Metodologie di biochimica clinica in vivo
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- Serafino Stefani
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1 Metodologie di biochimica clinica in vivo Emiliano Ricciardi Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica Facoltà di Medicina, Università di Pisa
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3 Esplorazione funzionale in vivo del cervello Perché studio in vivo? 1. Differenze in vitro e in vivo 2. Limite anatomico: santuario anatomico
4 Esplorazione funzionale in vivo del cervello Perché studio in vivo? 3. Segregazione e integrazione funzionale
5 Esplorazione funzionale in vivo del cervello Perché studio in vivo? 4. Limite dei modelli animali
6 Esplorazione funzionale in vivo del cervello La prima esperienza di Angelo Mosso: l aumento dell attività cerebrale induce un aumento di flusso ematico
7 Angelo Mosso (1881): Concerning the Circulation of the Blood in the Human Brain Verlag von Viet & Company: Leipzig, pages 66-67
8 Fisiologia della Correlazione Flusso Ematico- Metabolismo Cerebrale Nonostante i numerosi sforzi per risolvere il quesito del coupling, il meccanismo fisiologico è ancora sconosciuto: dopo l ipotesi omeostatica di Roy e Sherrington, sono stati suggeriti differenti modelli di regolazione dinamica cerebrovascolare e vari agenti mediatori di tipo biometabolico. Recentemente, è stata proposta un ipotesi di regolazione multilivello, che interessa anche le cellule neurogliali
9 Il metabolismo cerebrale del glucosio Tessuto nervoso comprende neuroni e cellule gliali In condizioni fisiologiche l ossidazione del glucosio a CO 2 ed H 2 O è pressoché l unica via metabolica per la produzione di ATP (corpi chetonici nel digiuno prolungato) L'apporto di glucosio ed ossigeno dipende strettamente dal flusso ematico cerebrale cervello: ~2% del peso corporeo ma riceve il 15% della gittata cardiaca basale e consuma il 20% dell'o 2 (50% nel bambino) estrae circa il 10% del glucosio nel sangue riserve cerebrali di glicogeno molto limitate il flusso ematico cerebrale aumenta nelle regioni cerebrali dove vi è un aumentata richiesta metabolica i prodotti del metabolismo energetico (CO 2, ADP, AMP) contribuiscono a regolare l aumento di flusso ematico l'interruzione completa del flusso ematico cerebrale comporta perdita di coscienza in pochi secondi e danni irreversibili in pochi minuti
10 Il metabolismo energetico cerebrale: Effetti della deprivazione di glucosio condizioni fisiologiche ipoglicemia grave ipoglicemia con coma Glicemia (mg/dl) Consumo di Glucosio (mg/100g/min) 5,5 2,3 0,8 Consumo di O 2 (ml/100g/min) 3,5 2,6 1,9 Flusso Ematico Cerebrale (ml/100g/min) L ipoglicemia si associa a confusione mentale, obnubilamento del sensorio coma Questi effetti possono essere corretti dalla somministrazione di glucosio o di mannosio ATP ADP Mannosio Mannosio-6-P Fruttosio-6-P Fosfato Esochinasi isomerasi ma non dai substrati intermedi della glicolisi, che non possono passare attraverso la BEE
11 DESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E O 2 Glicogeno Fosforilasi a Lattato UDP-glucosio Glucosio Glucosio-6-fosfatasi Esochinasi sintesi componenti cellulari (glicoproteine, glicolipidi, ecc.) Glucosio-1-P Glucosio-6-P shunt 5-8% Ribulosio-5-P Glicolisi Piruvato 90% ossidazione 10% del glucosio sintesi e metabolismo di neurotrasmettitori (ossidasi, ossigenasi ecc.) Acetil-CoA Ciclo di Krebs Fosforilazione ossidativa CO 2 + H 2 O ATP O 2 condizioni anaerobiche condizioni aerobiche ~ 10-15% 2 ATP ~ 85-90% La glicolisi libera solo il 5,2% dell energia totale disponibile nella molecola di glucosio e che può essere ricavata dall ossidazione completa a CO 2 e H 2 O
12 Consumo di ATP nel Cervello in Condizioni di Riposo Somatosensoriale 65% processi collegati ai flussi ionici: pompa Na + /K + : mantenimento del potenziale di membrana negativo; processi legati al reuptake di neurotrasmettitori 15% processi biochimici di sintesi: sintesi proteica (6%) sintesi lipidica (2%) sintesi dei nucleotidi (1%) glicogenosintesi (2%) turn-over neurotrasmettitoriale 20% altri processi: trasporto assoplasmatico veloce (6%) trasporto di calcio reazioni di fosforilazione riciclo vescicole sinaptiche La maggior parte della produzione di ATP nel cervello a riposo è destinata a mantenere la funzione della pompa Na + /K +
13 DESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E O2
14 Eventi legati all Attivazione Neuronale Cerebrale Stimolando una cellula nervosa si provoca la sua depolarizzazione e lo sviluppo di un potenziale d azione, caratterizzato a livello intracellulare da un aumento del sodio e da una diminuzione del potassio L aumento dell attività di trasmissione sinaptica aumenta l attività della pompa Na + /K +, necessaria a ripristinare il potenziale negativo della membrana cellulare Questo comporta un incremento della richiesta energetica, che per essere soddisfatta attraverso il metabolismo ossidativo del glucosio, produce un aumento della produzione di ATP dal 60% al 80%
15 Eventi legati all Attivazione Neuronale Cerebrale Il maggior quantitativo di ATP prodotto durante l'attivazione neuronale è utilizzato esclusivamente per il funzionamento della pompa Na + /K + Esperimento di Mata e coll., 1980 J Neurochem, 34: preparati in vivo di cellule nervose del 30% stimolazione elettrica a 10 Hz consumo di glucosio = UABAINA blocco della pompa Na + /K +
16 Eventi legati all Attivazione Neuronale Cerebrale Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellulari Esperimento di Kadekaro e coll., 1987 Proc Natl Acad Sci USA, 84:
17 Eventi legati all Attivazione Neuronale Cerebrale L aumento dell attività neuronale in una regione cerebrale induce un aumento del flusso ematico locale (coupling) Il flusso ematico fornisce glucosio e ossigeno ai neuroni In condizioni fisiologiche nel neurone l unica via metabolica è l ossidazione del glucosio con produzione di ATP L ATP serve a ripristinare il potenziale di membrana Il glucosio rappresenta un indice indiretto dell attività neuronale sinaptica Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellulari
18 Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell attività cerebrale +50 mv Riposo EEG MEG 2 3 msec Attivazione = Hb = HbO 2 FDG-PET smri attività neuronale sinaptica attività della pompa Na + /K + richiesta di ATP richiesta di ossigeno H 15 2 e glucosio 15 O-PET fmri flusso ematico cerebrale metabolismo ossidativo del glucosio e produzione di ATP
19 La tomografia ad emissione di positroni
20 Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni Presupposti fisici: Radionuclidi a breve emivita (es. 18 Fluoro, 15 Ossigeno) che decadono ed emettono positroni Positroni ed elettroni (stessa massa, carica opposta) annichilano e danno origine a due raggi γ in direzione diametralmente opposta, rilevabili da appositi detettori (Tomografo PET)
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22 Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni 18 FDG per misurare il metabolismo glucidico H 2 15 O per misurare il flusso ematico emivita(min) tempo di osservazione (min) durata singolo studio (min) numero di studi possibili nella stessa sessione PET Sostanze di interesse biologico, quali substrati metabolici, possono essere marcati usando questi radionuclidi positroneemittenti Per lo studio in vivo del metabolismo cerebrale possiamo utilizzare: misurano l'attività sinaptica neuronale di un determinato distretto cerebrale Caratteristiche distintive 18 FDG H 15 2 O > 10
23 Il modello del 18 Fluoro-2-deossi deossi-d-glucosio nello Studio in vivo del Metabolismo Glucidico Cerebrale Plasma precursori Tessuto cerebrale prodotti metabolici [ 18 F]deossiglucosio glucosio K 1 K 2 Barriera emato-encefalica K* 1 K* 2 [ 18 F]deossiglucosio glucosio K* 3 esochinasi K 3 esochinasi G-6-Pasi [ 18 F]glicolipidi [ 18 F]deossiglicogeno [ 18 F]UDPDG [ 18 F]deossiglucosio-1-P [ 18 F]deossiglucosio-6-P glucosio-6-p fruttosio-6-p [ 18 F]glicoproteine fosfoglucosio isomerasi CO 2 + H 2 O HO-CH 2 H H HO OH O H H OH HO-CH 2 H H HO OH O H H OH H glucosio OH H H 2-deossi-D-glucosio ( 18 F )
24 Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
25 Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni
26 Studio del Metabolismo Cerebrale del Glucosio in vivo nell Uomo in Condizioni Fisiologiche Condizione di riposo Effetti della stimolazione sensoriale visiva aumento % del metabolismo del glucosio Corteccia Visiva occhi chiusi 1 occhio 2 occhi scena complessa
27 Studio del Metabolismo Cerebrale in vivo nell Uomo in Condizioni Fisiologiche 18 FDG -glucosio 18 F-fluorodopa Anziano Sano Malato AD 18 F-fluoroetilspiperone
28 Studio in vivo delle funzioni cerebrali: elaborazione dei dati acquisiti con metodologia PET ATTIVAZIONE RIPOSO CONTROLLO NORMALIZZAZIONE ANATOMICA (Talairach e Tournoux Atlas) IMMAGINI INDIVIDUALI DI DIFFERENZA IMMAGINE MEDIA DELLE DIFFERENZE
29 PET - applicazioni cliniche Oncologiche Cardiache Cerebrali Malattie Infettive Farmacologiche Metaboliche
30 PET-FDG: verifica della terapia antitumorale Esame PET Linfoma di Hodgkin Esame PET Post-trattamento
31 Studio in vivo nell Uomo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio nelle Formazioni Neoplastiche Cerebrali Diagnostica Molecolare in Vivo Cellule neoplastiche: replicazione cellulare attività metabolica di sintesi attività glicolitica La misurazione del metabolismo cerebrale del glucosio consente di: determinare la natura (benigna/maligna) della neoformazione determinarne il grado di anaplasia ( anaplasia consumo glucosio) valutare nel tempo gli effetti della terapia e la presenza di eventuali recidive
32 Il ruolo della PET nelle patologie neurologiche Parkinson Epilessia Alzheimer
33 Il ruolo della PET nelle patologie neurologiche Traumi Cranici Corea di Hungtinton
34 Alzheimer s Disease: Diagnosis M 77 yrs
35 Alzheimer s Disease: Diagnosis M 65 yrs
36 La risonanza magnetica funzionale
37 Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell attività cerebrale +50 mv Riposo EEG MEG 2 3 msec Attivazione = Hb = HbO 2 FDG-PET smri attività neuronale sinaptica attività della pompa Na + /K + richiesta di ATP richiesta di ossigeno H 15 2 e glucosio 15 O-PET fmri flusso ematico cerebrale metabolismo ossidativo del glucosio e produzione di ATP
38 Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici risonanza magnetica funzionale Cosa accade al consumo di ossigeno?
39 fmri fmri: functional Magnetic Resonance Imaging: Tecnica che utilizza il segnale BOLD per visualizzare il metabolismo cerebrale mediante MRI. Il segnale BOLD permette l individuazione dei cambiamenti locali cerebrali di ossigenazione ematica durante una stimolazione fisiologica Il segnale BOLD si basa sui cambiamenti fisiologici delle proprietà magnetiche del sangue: OSSIEMOGLOBINA DEOSSIEMOGLOBINA DIAMAGNETICA PARAMAGNETICA
40 Deoxygenated blood attenuates T 2* -weighted MR images O 2 MRI volume element
41 The influence of arterial blood on the BOLD signal is probably insignificant (it contains low dhb and represent less than 25% of CBV) decrease of venous dhb during increased perfusion: O 2
42 Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici lo scanner
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44 reconstruction registration smoothing Interpretazione dei risultati, correlazione con dati comportamentali e verifica dell ipotesi Analisi dei dati: : postprocessing Esperimenti fmri: ingegneria biomedica Rationale: ipotesi sperimentale Selezione,, screening, test psicologici e comportamentali Preprocessing e sessione sperimentale Paradigma sperimentale
45 Beyond (and behind) the project Behavior (forgiveness, emotional hyperresponsiveness, reward, etc.) EEG and fmri Pharmacological Modulation Language Presurgical evaluation Speed and brain (Formula 1 racers) Tactile perception: sopra- and crossmodality Neurodegenerati ve diseases
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