Università degli studi di Roma Sapienza. Facoltà di Ingegneria

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1 Università degli studi di Roma Sapienza Facoltà di Ingegneria Dipartimento di Ingegneria Meccanica e Aerospaziale Corso di Laurea in Ingegneria Biomedica Tesi di Laurea Caratterizzazione biomeccanica di fibre muscolari ingegnerizzate in vitro mediante misure a correlazione digitale delle immagini (D.I.C.) Relatore: Prof. Ing. Adriano Alippi Laureando: Giansante Alessandrini Matricola Correlatore: Prof. Ing. Zaccaria Del Prete Anno accademico 2009/2010

2 Introduzione Negli ultimi dieci anni, grazie al notevole impulso delle conoscenze e all avanzamento tecnologico al quale si è assistito in ambito biomedico, si è sviluppato un nuovo settore di studio e ricerca, che si colloca all intersezione della medicina, della biologia e dell ingegneria: l ingegneria tissutale. Scopo principale di questa nuova disciplina è ottenere tessuti biologici artificiali destinati ad accelerare i processi di guarigione, a rigenerare tessuti che non assolvono più alla propria funzione nonché a sostituirli, qualora siano irrimediabilmente compromessi. In questo contesto, nel Dipartimento di Istologia ed Embriologia Medica dell Università Sapienza di Roma, è stata messa a punto una tecnica per la realizzazione di un costrutto biologico tridimensionale di cellule satelliti prelevate da fibre muscolari murine: l X-MET (ex vivo Muscle Engineered Tissue). Tale studio fa parte di una ricerca nella quale si sta indagando la possibilità di effettuare trapianti in vivo sia su muscolo cardiaco (per la cura di ischemie e di porzioni di miocardio infartuato) che su tessuto muscolare striato (per la cura della distrofia muscolare di Duchenne e per il recupero dell attività funzionale di tali organi). In questo contesto, lo scopo della tesi è stato di caratterizzare le proprietà biomeccaniche dell X-MET, determinando l andamento della forza e della deformazione di contrazione in risposta a specifici protocolli di stimolazione. In particolare, l evoluzione della deformazione è stata misurata mediante una metodologia di misura senza contatto, la Digital Image Correlation o D.I.C., attraverso l acquisizione di immagini ad alta frequenza. A tale scopo è stata realizzata una catena di misura ad hoc, dove le grandezze di interesse, deformazione e forza, sono state misurate, rispettivamente, da un sistema ottico e da un trasduttore a disposizione (risoluzione 1µN). La contrazione dei provini è stata indotta applicando al tessuto degli impulsi elettrici per mezzo di micro elettrodi collegati ad un elettrostimolatore. I segnali inviati all elettrostimolatore sono stati sintetizzati dal computer. 4

3 Entrambi gli elementi sensibili (trasduttore e telecamera) della catena di misura devono essere collocati sul microscopio. È stato quindi necessario costruire un supporto opportunamente progettato che consentisse il giusto posizionamento del trasduttore, degli elettrodi e dell X-MET sotto l obiettivo mentre la telecamera è stata posizionata nell alloggio apposito del microscopio. E stato necessario, inoltre, controllare l intero processo di misurazione tramite il calcolatore in modo che tutta la strumentazione possa coordinarsi ed interagire in maniera efficace. Ciò è stato possibile grazie alla messa a punto di un adeguato programma redatto in linguaggio LabView; esso è in grado di gestire contemporaneamente, in maniera automatica, l elettrostimolatore per fornire l impulso all X-MET, la telecamera per l acquisizione delle immagini, e il calcolatore per il salvataggio delle stesse. L elaborazione delle immagini è fatta con un algoritmo originale redatto in C++ e realizzato dal professor G. B. Broggiato del Dipartimento di Ingegneria Meccanica e Aerospaziale dell Università Sapienza di Roma. Tale programma è in grado di definire quantitativamente e qualitativamente le deformazioni che avvengono sull X-MET durante il processo di contrazione. L algoritmo è stato realizzato originariamente per applicazioni molto diverse da quella di questo lavoro. Esso era settato per elaborare immagini di provini meccanici con deformazioni quasistatiche e con velocità di acquisizione delle immagini molto ridotta, dell ordine dei 10fps al massimo: è stato necessario, quindi, modificare alcune righe del codice. Le qualità metrologiche sia statiche che dinamiche del sistema ottico e le proprietà del codice in C++ sono state valutate in studi precedenti a questo e, per completezza, ne verranno solamente richiamati i risultati; mentre la calibrazione del trasduttore è stata qui eseguita e descritta in modo esaustivo. Anche per la calibrazione è stato messo a punto un programma redatto in LabView. Questa tesi comprenderà inizialmente una breve panoramica sugli aspetti biologici di fibre e tessuti muscolari, poi si effettuerà una panoramica concettuale e applicativa sulle tecnologie di misura D.I.C., si presenterà la strumentazione utilizzata ed infine verranno descritte le misure effettuate sul costrutto e i relativi risultati. 5

4 Capitolo 1 Il muscolo 1.1 Il tessuto muscolare scheletrico Il tessuto muscolare è responsabile dei movimenti volontari ed involontari del corpo e si può suddividere in tre tipologie: Tessuto muscolare striato scheletrico che regola il movimento volontario; Tessuto muscolare striato cardiaco che costituisce il parenchima del cuore e ne permette la contrazione; Tessuto muscolare liscio che regola il movimento involontario. Figura1. Struttura del muscolo scheletrico Il tessuto muscolare scheletrico è caratterizzato da elementi irregolari di forma tubolare chiamati fibre muscolari; esse sono dei sincizi, cioè si generano dalla fusione delle cellule progenitrici, i mioblasti. Facendo riferimento alla figura 1 si nota come ogni muscolo sia avvolto da una lamina connettivale esterna, detta epimisio, la quale va a fondersi con il tendine 6

5 per permettere l attaccatura all osso da muovere. L epimisio si ramifica producendo elementi interstiziali che avvolgono i singoli fasci di fibre muscolari formando il perimisio, da questo si distaccano dei setti di connettivo che ricoprono la singola fibra muscolare e che sono detti endomisio. Le fibre muscolari sono, a loro volta, costituite da miofibrille (figura 2): Figura2. La miofibrilla Si distinguono in essa due zone: la banda A e la banda I che presenta al suo interno la linea Z; tra due linee Z successive si sviluppa l unità contrattile del 7

6 muscolo, il sarcomero. Le miofibrille sono formate da due tipi di filamenti: i filamenti spessi, composti in gran parte da miosina, e i filamenti sottili, composti in maggioranza da actina. L interazione tra queste due proteine consente la contrazione muscolare. Le miofibrille possono dar luogo a due diversi tipi di fibre muscolari: le fibre veloci, che hanno la capacità di imprimere elevati valori di forza in tempi molto brevi ma sono particolarmente inclini all affaticamento, e le fibre lente, che sviluppano una contrazione più prolungata con una risposta meno intensa e più lenta ma sono soggette ad un affaticamento minore. La lunghezza e la forza rappresentano le due grandezze meccaniche fondamentali nello studio della meccanica del muscolo. Mantenendone costante una è quindi possibile misurare l altra; in questo modo vengono inoltre a definirsi le due principali tipologie di protocollo sperimentale volto allo studio delle proprietà contrattili del muscolo: si parlerà di contrazione isometrica quando al muscolo viene fatta sviluppare una forza mantenendo costante la sua lunghezza, e di contrazione isotonica quando al muscolo viene imposto di contrarsi contro un carico resistente costante, potendo così misurare la variazione di lunghezza. Nella contrazione isometrica il muscolo viene stimolato elettricamente mentre è costretto a mantenere una lunghezza costante. Figura3. Sommazione meccanica 8

7 Un singolo stimolo determina un aumento della tensione muscolare che poi decade in seguito al rilassamento del muscolo: twitch. Se viene applicato un secondo stimolo prima che il muscolo si rilassi completamente, il picco della tensione muscolare relativa al secondo impulso sarà più elevato di quello relativo al primo: fenomeno della sommazione meccanica (figura 3). Applicare più stimoli uno vicino all altro, porta ad un aumento della tensione muscolare fino ad arrivare ad un massimo, cioè ad un livello stazionario. In questo caso si dice che il muscolo è in una condizione di tetano. Figura4. Relazione forza relativa-lunghezza del sarcomero Inoltre, il valore della forza massima generata risulta strettamente legato alla lunghezza alla quale viene stimolato il muscolo (figura 4). A livello microscopico, infatti, è stato rilevato come il valore di forza sia legato al grado di sovrapposizione dei sarcomeri, ed il valore massimo si ha quando essi non risultano né troppo distanti da non poter interagire, ne troppo vicini così da interferire tra loro. Nella contrazione isotonica il muscolo esercita sempre la stessa forza mentre varia la lunghezza delle proprie fibre. Il protocollo di misura di tale tipo di contrazione prevede l applicazione, al muscolo, di un carico fisso, mentre vengono misurate le variazioni di lunghezza. Nell apparato sperimentale il muscolo è attaccato ad un asta in modo da essere costretto a sollevare un carico durante l accorciamento; quando viene rilasciato, la leva poggia contro un punto di arresto così che il muscolo a riposo non debba sostenere il carico. Qualora non ci fosse 9

8 l arresto, il muscolo assumerebbe lunghezze iniziali progressivamente maggiori all aumentare del carico, rendendo più difficile l interpretazione dei risultati al variare dei pesi applicati. Nella figura 5 viene rappresentato cosa avviene nel muscolo quando questo deve sollevare un carico moderato mentre è sottoposto a stimolazione tetanica. Figura5. Scalino forza-velocità La forza generata dal muscolo aumenta (curva centrale) subito dopo il primo impulso elettrico (linea a), ma non vi è accorciamento del muscolo che avviene solo più tardi (linea b): quindi tra a e b vi è una contrazione isometrica. La tensione muscolare continua ad aumentare fino a raggiungere la forza del carico esterno (linea c), a questo punto il muscolo inizia ad accorciarsi senza che la tensione possa aumentare ulteriormente: ci troviamo nella fase di contrazione isotonica. La derivata della curva di lunghezza del muscolo, fatta rispetto al tempo (dl/dt), rappresenta la velocità di accorciamento. Come si vede dalla figura essa è massima all inizio e va diminuendo all accorciarsi della fibra muscolare fino ad annullarsi quando cessa la stimolazione, a questo punto la velocità si inverte quasi subito. Terminata la stimolazione, infatti, il muscolo torna a distendersi per effetto del carico. 10

9 1.2 Ingegneria tissutale Il termine ingegneria tissutale (tissue engineering) fu introdotto per la prima volta nel 1987 dai membri della US National Science Foundation a Washington D.C. e definito nel seguente modo: L applicazione dei principi e dei metodi dell ingegneria e delle scienze della vita per comprendere a fondo la relazione che esiste tra struttura e funzione nei tessuti viventi normali e patologici, per lo sviluppo di sostituti biologici che possano ripristinare, mantenere e migliorare la funzione tissutale (Fox and Skalak, 1988). Indica la coltivazione in laboratorio di cellule per ottenere tessuti artificiali destinati ad accelerare i processi di guarigione, a rigenerare tessuti che non assolvono più alla propria funzione nonché a sostituirli qualora siano compromessi. L obiettivo finale è quello di poter coltivare tessuti complessi se non addirittura organi interi. Va considerato che l ingegneria tissutale è ormai una pratica clinica comune per quanto riguarda alcuni tessuti, come pelle, osso e cartilagine, mentre in riferimento al tessuto muscolare, è una tecnica ancora in fase di studio a causa della complessità strutturale e funzionale di tale sistema. Nonostante le difficoltà in quest ultimo ambito, i primi studi sembrano confermare come l ingegneria tissutale applicata al tessuto muscolare sia una soluzione vincente nella cura di malattie quali la distrofia e l atrofia muscolare progressiva e nel recupero di massa muscolare in seguito a lesioni di natura traumatica e ad asportazioni chirurgiche di tumori. La tecnica maggiormente utilizzata è l autografting, basata sul trapianto o trasferimento di tessuto muscolare da altri distretti anatomici del paziente. Ciò porta, però, ad una degenerazione dell area donatrice con una sua conseguente perdita di peso e funzionalità; per contro, il trapianto eterologo può dare problemi di rigetto, anche se questo processo è stato eseguito con successo. In condizioni fisiologiche il muscolo scheletrico è in grado di rigenerare grazie alla presenza di cellule satelliti, che definiscono il compartimento staminale nel muscolo adulto. Purtroppo tali cellule non sono in grado di operare in maniera efficiente nel caso dell invecchiamento e in particolari patologie, come per esempio nella distrofia muscolare di Duchenne. Caratteristica molto importante di tali cellule è quella di poter essere isolate. L idea che si trova dietro l ingegneria tissutale applicata al muscolo è, quindi, quella di isolare cellule satelliti dal muscolo di soggetti adulti e porle in colture in 11