X-MET: un tessuto muscolare ingegnerizzato in vitro Misura delle proprietà biomeccaniche

Transcript

1 Misure Meccaniche & Termiche II - MBIR (A. A ) Prof. Z. Del Prete X-MET: un tessuto muscolare ingegnerizzato in vitro Misura delle proprietà biomeccaniche Dispensa a cura dell ing. S. Carosio PhD silvia.carosio@uniroma1.it Dipartimento di Scienze anatomiche, istologiche, medico-legali e dell'apparato locomotore Via Scarpa Roma T

2 Ingegneria tissutale L ingegneria tessutale è un campo interdisciplinare che applica i principi dell ingegneria e delle scienze della vita al fine di sviluppare sostituti biologici che ripristinino, mantengano o migliorino le funzioni tessutali. Langer, R & Vacanti JP, Tissue engineering. Science 260, 920-6; 1993 X-MET: ex-vivo Muscle Engineered Tissue 1. Dissezione digestione enzimatica e isolamento cellule staminali Coltura primaria 2. Arricchimento della frazione staminale 3. Piastraggio delle cellule su substrato selezionato Realizzazione dell X-MET A B C D Monostrato cellulare Delaminazione del monostrato Ancoraggio X-MET

3 Contrazione sincrona e ritmica Necessità di una caratterizzazione biomeccanica

4 Misura delle caratteristiche funzionali dell X-MET Caratterizzazione biomeccanica Misura della forza di contrazione: utilizzo di un trasduttore di forza piezoresistivo Misure di deformazione in seguito a contrazione: utilizzo di una tecnica non a contatto: Digital Image Correlation (D.I.C.)

5 Misura della forza di contrazione Contrazione isometrica e isotonica Elettrodi di platino Trasduttore di forza [0;500]μN X-MET

6 Confronto tra trasduttore di forza per muscolo murino ex-vivo e microtrasduttore per l X-MET Attuatore/trasduttore ASI 300B Muscolo ex-vivo F (range) : N sensibilità : 0.3 mn Trasduttore SensorOne AE801 X-MET F (range) : μn sensibilità : 1 μn

7 Trasduttore di forza - schema e collegamenti elettrici: Circuito elettrico di completamento del ponte: Segnale dal sensore di forza Componente integrato 1B31: necessario per il completamento del ponte Segnale in uscita da inviare al calcolatore

8 Taratura del trasduttore di forza mv 8 pesi compresi tra 50.03µN (5.1mg) e µN (100.2mg) N -400 maggiore addensamento all interno del range 0-500µN mV = X µn

9 Risposta dell X-MET alla stimolazione elettrica Singolo twitch Stimolazione isometrica : riassunto sommazione tetano

10 Prove preliminari determinazione larghezza dell impulso singolo e sua intensità di corrente Larghezza dell impulso: 1 ms Intensità di corrente: 400 ma durata della stimolazione al variare della frequenza degli impulsi Fase di stimolazione: 1.2 s Fase di rilassamento: 1 s

11 Forza (μn) Dalle prove preliminari alla scelta del protocollo di stimolazione completo Ritardo Durata Frequenza Larghezza Corrente iniziale stimolazione segnale (Hz) impulso (ma) stimolazione (s) (ms) (s) 20 Singolo twitch Singolo twitch Costruzione della curva forza-frequenza: esempio reale Freq (Hz)

12 Parametri di interesse Forza di twitch (F tw ) Time to peak (TTP) Half relaxation time (½RT) Forza di tetano (F) Forza specifica (F spec ) F F spec F CSA Cross sectional area(csa) del costrutto biologico: 2 CSA r m

13 Valutazione delle caratteristiche funzionali dell X-MET Caratterizzazione biomeccanica Misura della forza di contrazione: utilizzo di un trasduttore di forza piezoresistivo Misure di deformazione in seguito a contrazione: utilizzo della tecnica non a contatto: Digital Image Correlation (D.I.C.) Digital Image Correlation (D.I.C) La D.I.C. è una metodica che permette di effettuare misure di deformazione senza contatto attraverso l elaborazione digitale di immagini video acquisite a velocità opportuna

14 Schema di un sistema di acquisizione delle immagini per analisi D.I.C. in 2 dimensioni I componenti principali di un tipico sistema ottico digitale sono : una telecamera (preferibilmente del tipo CCD, charged coupled device); un frame grabber, cioè una scheda di acquisizione delle immagini; un unità di elaborazione (computer).

15 Requisiti della superficie da analizzare: lo speckle Affinché sia possibile effettuarne una correlazione è necessario che la superficie inquadrata sia dotata di speckel; tramite la D.I.C. le immagini sono analizzate per misurare grandezze quali lo spostamento e la deformazione. Lo speckle è una distribuzione casuale, ben contrastata e distribuita, di piccole macchioline, con toni di grigio ad elevato contrasto. Lo speckle, qualora non presente naturalmente sulla superficie del provino, può essere realizzato con vernici spray, laser o polveri di silicio, a seconda del tipo di applicazione. Immagine speckle Grazie allo speckle è possibile associare ad ogni punto della superficie uno specifico valore di intensità luminosa (livello di toni di grigio) diverso da quello dei punti adiacenti. Tramite il confronto tra la variazione di intensità luminosa dello stesso punto in immagini diverse si valuta la deformazione che avviene sul costrutto biologico.

16 Tramite la telecamera (che deve essere posizionata lungo la perpendicolare alla superficie da analizzare) si effettua una conversione analogico/digitale (eseguita dai sensori della telecamera) passando così da una rappresentazione continua a punti dell immagine originaria ad una discreta a pixel. A questo punto è possibile effettuare il confronto tra pixel adiacenti. La distribuzione casuale di macchioline sulla superficie permette la realizzazione di un immagine speckle attraverso la quale è possibile definire la funzione f(x,y)=g Attraverso la marcatura speckle possiamo ottenere una corrispondenza c biunivoca tra il punto materiale p(x,y) e quello dell immagine P(X,Y) mentre tramite la funzione f(x,y) siamo in grado di associare il livello di grigio g al punto dell immagine e quindi a p(x,y): p( x, c f ( X, Y ) y) P( X, Y) g dove c ed f(x,y) sono funzioni discrete dello spazio.

17 Frequenza di contrazione dell X-MET frequenza di acquisizione delle immagini Per il teorema di Nyquist: f c > 2 f s Nel nostro caso la frequenza di contrazione massima dell X-MET è: f X-METmax = 70 Hz Abbiamo quindi la necessità di utilizzare una telecamera ad alta velocità (320 fps = frame per second) per potere acquisire correttamente le immagini della contrazione.

18 Digital Image Correlation (D.I.C) Riassumendo, il metodo DIC esegue un confronto dei livelli di grigio di una regione divisa in gruppi di pixel e soggetta a deformazione, confrontando un sottoinsieme preso come riferimento, appartenente all immagine indeformata I mi, con lo stesso sottoinsieme relativo all immagine deformata I md. Per studiare un fenomeno durante un intervallo di tempo stabilito, questo tipo di analisi può essere esteso ad una serie di immagini consecutive. Nel nostro caso per ogni stimolazione, acquisendo ad una frequenza di 320 Hz e, per esempio, per un periodo pari a circa 1.5 s, si effettuano confronti tra circa 480 immagini; ogni immagine della sequenza è correlata con la precedente. Il metodo di correlazione numerica delle immagini consente quindi di eseguire misure accurate, senza alcun contatto ed a distanza; è dotato di elevata versatilità e robustezza, permette di eseguire la misura sull intero campo di deformazione e su sotto-regioni selezionate (Region Of Interest = ROI).

19 Analisi della deformazione dell X-MET Tramite l algoritmo sviluppato in ambiente C++ è possibile: Selezionare la ROI d interesse Analizzare lo spostamento dei nodi

20 Catena di misura elettrostimolatore elettrodi di platino telecamera alta velocità trasduttore di forza (1µN) pc trigger ES impulsi TTL Programma di comando ed acquisizione realizato ad hoc in LabView 8.2 PC forza trigger X-MET TC immagini

21 Pannello di controllo del programma in LabVIEW

22 Risultati sperimentali di deformazione analisi globale Deformazioni medie per singolo twitch: ε * x=1.1% e ε * y=0.41% Deformazioni medie 70 Hz: ε * x=6.26% e ε * y=2.34%

23 Risultati sperimentali di deformazione analisi locale Deformazioni medie per singolo twitch: ε * x=3.47% e ε * y=4.51% Deformazioni medie 70 Hz: ε * x=12.3% e ε * y=8.89%

24 Esercitazione in laboratorio: In laboratorio verrà effettuata una stimolazione isometrica dell X- MET secondo le modalità seguenti: single pulse stimolazione a frequenza di sommazione stimolazione a frequenza di tetano Parallelamente, in modo sincrono alla misura della forza, si acquisiranno le immagini necessarie per la misura della deformazione (tramite D.I.C.). 1. Verranno forniti 3 set di dati pre-elaborati necessari per il calcolo della deformazione assiale e longitudinale dell X-MET, i relativi andamenti della forza acquisita e il programma in LabView necessario per l elaborazione. 2. Inoltre andranno analizzati gli andamenti della forza generata, da filtrare in modo opportuno, da cui calcolare la F max