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1 Laboratorio di Tecniche Microscopiche Esercitazione 4 Analisi d immagine Sara Ferrando ImageJ Il software, numerosissimi plug-in e il manuale di utilizzo possono essere scaricati da una pagina web dell NIH: Analisi d immagine Durante questa esercitazione vedremo alcuni esempi molto semplici di analisi di immagine che possono essere eseguiti con la versione base di ImageJ, quindi senza installare plug-in aggiuntivi e altri che invece richiedono l utilizzo di plug-in. - Conta manuale - Conta automatica - Misurazione di lunghezze, aree e angoli - Sovrapposizione di immagini in fluorescenza - Analisi dei toni di grigio - Analisi dei colori - Un utilizzo delle Look Up Table Conta manuale (ImageJ versione base) Aprire il file DAPI.jpg 2) Scegliete il Point selection tool (il settimo sulla barra degli strumenti). Tenendo premuto il tasto shift sulla tastiera cliccate sulle cellule. Ad ogni cliccata compare sull immagine un quadratino giallo con un numero. Ci si può interrompere ma occorre ricordare di ricominciare a premere shift quando si riprende la conta. Quando avrete cliccato su tutti gli oggetti che volete contare potete semplicemente appuntarvi l ultimo numero oppure: 3) Analize>Measure (oppure Ctrl-M) In questo modo per ogni punto avrete un numero, le coordinate e il valore di luminosità del pixel in questione. Questi dati possono essere salvati in formato.xls (cioè Excel). Conta automatica(imagej versione base) La conta automatica prevede la messa a punto di un protocollo diverso per ogni tipologia di immagine. Una volta messa a punto la metodica però ci consentirà di contare velocemente molte immagini, con accuratezza uguale o maggiore alla conta manuale. Ovviamente, se volete che la conta automatica sia efficace e precisa, che possa funzionare senza dover ogni

2 volta reimpostare i parametri per la conta, e che i dati ottenuti siano confrontabili, occorre fornire immagini microscopiche acquisite senza variare le impostazioni (ingrandimento, intensità luminosa, tempo di esposizione della macchina, apertura del condensatore etc etc). Aprire il file DAPI.jpg 2) Image>Type>8-bit Trasformate l immagine in un immagine a 8-bit (toni di grigio) 3) Image>Adjust>Threshold Scegliete opportunamente i valori in modo da evidenziare gli oggetti da contare in modo che risultino distinti (così che il software possa distinguerli quando li andrà a contare). E possibile che rimangano evidenziate anche alcune piccole aree che non vogliamo che siano contate come cellule. Per fortuna la funzione Analyze Particles permette di scegliere dei limiti di dimensione per le particelle da contare. La dimensione viene calcolata in pixel 2. Dovete quindi sapere quanto misura l area delle macchie che vogliamo non vengano considerate nella conta. E ovvio che le macchie che potete escludere devono essere tutte più piccole delle particelle da contare. Se non lo sono significa che avete scelto male i vostri valori di Threshold e che occorre rifare quel passaggio. 4) Analyze>Set Measurement Assicuratevi che nella finestra che si apre con questo comando sia smarcata la casella Area. 5) Prendete lo strumento Wand (l ottavo sulla barra degli strumenti) e selezionate (tenendo premuto shift) le più grandi macchie che volete vengano escluse dalla conta. 6) Analyze>Measure Si aprirà una finestra che vi dirà l area in pixel 2 delle macchie che avete selezionato. Memorizzate l area più grande tra quelle indicate, perché le particelle che volete contare dovranno avere una superficie maggiore di questa. 7) Analyze>Analyze Particles Settiamo le dimensioni minime e massime delle particelle da contare; possiamo poi scegliere altre cose, ad esempio se considerare o meno gli oggetti che toccano il bordo dell immagine, etc. Misurazioni(ImageJ versione base) Aprire il file epitelio.jpg 2) Con lo strumento Magnifying glass (è la lente d ingrandimento, cercatela sulla barra degli strumenti) ingrandite il righello presente nella foto in modo a inquadrarlo e leggere la dimensione.

3 3) Con lo strumento Straight line selection (barra degli strumenti) disegnate una linea lunga come il righello. 4) Analyze>Measure Scopriamo così quanto è lunga in pixel il righello. 5) Analyze>Set scale In questa finestra definite a quanto corrisponde nella realtà la distanza in pixel. Lasciate sempre 1 la pixel ratio. Se smarcate la casella global il software ricorderà queste impostazioni finchè non le cambiate o finchè non lo chiudete, altrimenti saranno valide solo per l immagine corrente. 6) Con lo strumento Straight line selection (barra degli strumenti) potete selezionare delle linee e sapere quanto sono lunghe per mezzo di Analyze>Measure 7) Oppure con i vari strumenti di selezione potete selezionare aree circolari, ovali, rettangolari, irregolari. Quindi con il comando Analyze>Set Measurement potete scegliere quali informazioni vogliamo ottenere su queste aree (il perimetro, la superficie, i valori di luminosità, etc.) 8) Analyze>Measure Il software ci restituirà i valori richiesti nell unità di misura settata. Sovrapposizione di immagini(imagej versione base) Questa funzione può rivelarsi utile per sovrapporre immagini in fluorescenza in modo da ottenere immagini con più colori contemporaneamente agevolando i confronti. Aprite il file rosso.jpg e poi il file blu.jpg 2) Process>Image calculator Mettere le due immagini nei due slot Image1 e Image2. Scegliere l operazione Add. Smarcare la casella Create New Window e non spuntate la casella 32-bit Result Analisi dei toni di grigio(imagej versione base) In alcuni casi, per ottenere un dato semi-quantitativo da immagini acquisite al microscopio è opportuno, anziché contare e misurare gli elementi di interesse, valutare un range di colore (o luminosità) che può essere considerato positività e poi calcolare la percentuale di pixel positivi sui pixel totali dell immagine. Aprire i file poco.jpg e tanto.jpg

4 2) Image>Color>RGBsplit Chiudete le immagini chiamate poco(blu), tanto(blu), poco(red) e tanto(red). Adesso avete due immagini ad 8 bit in cui la parte positiva che vogliamo quantificare è nera o grigio scuro. Ci sono diversi modi di procedere per contare i pixel abbastanza scuri da poter essere considerati positivi. 4) Image>Adjust>Threshold Selezionate opportunamente i valori di soglia in modo da separare le zone di interesse dallo sfondo. 5) Analyze>Histogram Disegnate l istogramma dei grigi per entrambe le immagini. Quindi, nella finestra dell istogramma cliccate su list per avere una lista dei toni di grigio (la solita 0-255) con accanto il numero di pixel che ha proprio quel valore di luminosità. Essendo l immagine bianca e nera ci saranno pixel solo bianchi (valore 255) o neri (valore 0). Quelli neri sono quelli positivi e il loro rapporto con i pixel complessivi dell immagine ci darà la percentuale di area positiva. Analisi dei colori (ImageJ + Color Inspector 3D Plugin) Il plugin utilizzato in questo esercizio è già stato installato nei computer usati durante l esercitazione. Le istruzioni per l installazione del plugin sono riportare per completezza e per consentirvi l eventuale utilizzo del plugin su altri computer. Scaricate dal sito il file ColorInspector3D.jar e salvatelo nella cartella plugins che si troverà dentro la cartella ImageJ che probabilmente si troverà nella cartella Programmi del vostro computer Nel caso abbiate già avviato il software ImageJ, chiudetelo e riapritelo. Ora il plugin è stato installato. 1) Aprite l immagine tanto.jpg. 2) Plugins>Color Inspector 3D La finestra che si apre mostra una visione tridimensionale della distribuzione di colori nell immagine tanto.jpg. Provate a cambiare (in alto nella finestra) il Display Mode in Histogram e a cambiare il Color Space (per esempio scegliete HSB invece che RGB). Con il mouse potete ruotare il grafico tridimensionale in modo da vederlo in modo ottimale. 3) File>Save Visualisation Salvate sul desktop il grafico 3D dei colori, con un nome appropriato.

5 4) Ripetete le stesse operazioni su poco.jpg e confrontate i grafici ottenuti. Un utilizzo delle Look Up Table (ImageJ versione base) Talvolta le differenze tra un immagine e l altra sono oggettive ma non così semplici da vedere. Abbiamo detto che, ad esempio, un immagine a 8 bit in toni di grigio può avere fino a 256 toni diversi, che sono più numerosi dei toni di grigio che possono essere distinti dall occhio umano. Quindi possiamo avere immagini che apparentemente sono molto simili o uguali ma che poi si dimostrano diverse se andiamo a confrontare il valore dei diversi pixel sul computer. Le differenze che non possono essere apprezzate dall occhio umano costituiscono comunque un informazione (nascosta), che talvolta vale la pena di rendere evidente. E possibile infatti accentuare le differenze che il computer vede tra i pixel, assegnando a piccoli range di luminosità altri colori nettamente diversi. Vediamo un esempio, la LUT che si chiama 16_colors prende i 256 toni di grigio, li divide in 16 parti (256/16=16) e assegna il colore secondo questa funzione (V sta per valore di grigio): 0<=V<16 16<=V<32 32<=V<48 48<=V<64 64<=V<80 80<=V<96 96<=V< <=V< <=V< <=V< <=V< <=V< <=V< <=V< <=V< <=V<256 Nero Blu scuro Blu Azzurro scuro Azzurro Azzurro chiaro Verde Verde acido Giallo limone Giallo tuorlo Arancione Arancione scuro Rosso Fucsia Lilla Bianco 1) Aprite l immagine sfumatura.jpg 2) Image>Lookup Tables>16_colors Ora vediamo come questa LUT può essere utile. 1) Aprite le due immagini verdea.jpg e verdeb.jpg 2) Image>Color>RGBsplit per entrambe le immagini Lasciate aperte solo le immagini (green) dove la fluorescenza che ci interessa risulta molto chiara. Osservate come i toni di grigio delle due foto non diano molte informazioni sulle differenze. 3) Image>Lookup Tables>16_colors per entrambe le immagini Confrontatele adesso

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