RISOLUZIONE OIV-OENO 419C-2015

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1 RISOLUZIONE OIV-OENO 419C-2015 METODI DI ANALISI PARTICOLARI PER LO ZUCCHERO D UVA (MOSTI D UVA CONCENTRATI RETTIFICATI) DETERMINAZIONE DI MESO-INOSITOLO, SCILLO-INOSITOLO E SACCAROSIO L ASSEMBLEA GENERALE Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'organizzazione internazionale della vigna e del vino, CONSIDERATI i lavori della Sottocommissione Metodi d analisi sull aggiornamento della Raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti, CONSIDERATA la risoluzione OENO 47/2000 che descrive le specifiche dei mosti concentrati e rettificati e i metodi corrispondenti e la necessità di aggiornare tali metodi, VISTO che i seguenti metodi sono già riconosciuti da autorità internazionali, DECIDE di creare una SEZIONE F dal titolo Metodi di analisi particolari per mosti di uva concentrati rettificati, DECIDE di inserire nella SEZIONE F la Raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti i metodi descritti di seguito, DECIDE di adattare di conseguenza la risoluzione OENO 47/2000 inclusa nel Codice enologico internazionale. METODI DI ANALISI PARTICOLARI PER LO ZUCCHERO D UVA (MOSTI D UVA CONCENTRATI RETTIFICATI) DETERMINAZIONE DI MESO-INOSITOLO, SCILLO-INOSITOLO E SACCAROSIO ALLEGATO F: 1. PRINCIPIO MESO-INOSITOLO, SCILLO-INOSITOLO E SACCAROSIO Il Mosto Concentrato Rettificato (MCR) è costituito principalmente da zuccheri, polialcoli e acqua presenti nell uva. Tutti gli altri componenti organici e minerali sono allontanati durante il processo di rettifica. Il Meso-inositolo, lo Scillo-inositolo ed il saccarosio vengono determinati mediante gascromatografia previa silanizzazione. Il saccarosio eventualmente presente in piccole quantità nel MCR è stabile per diversi mesi in quanto la sua idrolisi viene molto rallentata dall assenza di acidità organica o minerale 1

2 dovuta alla rimozione degli acidi organici e minerali durante il processo di rettifica, dal contenuto di acqua molto basso, e al contenuto molto elevato di glucosio e fruttosio. 2. REATTIVI 2.1. Xilitolo (CAS ) Standard interno: (soluzione acquosa a titolo esattamente noto di circa 10 g/l preparata al momento) Meso-inositolo (C 6H 12O 6) (CAS ) 2.3. Scillo-inositolo (C 6H 12O 6) (CAS ) 2.4. Glucosio (C 6H 12O 6), fruttosio (C 6H 12O 6), saccarosio (C 12H 22O 11) 2.5. Bistrimetilsililtrifluoroacetamide BSTFA (C 8H 18F 3NOSi 2) (CAS ) Avvertenza: Prodotto pericoloso e infiammabile. Liquido e vapori infiammabili. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Indossare guanti/ indumenti protettivi/ Proteggere gli occhi/ il viso Trimetilclorosilano (C 3H 9ClSi) (TMCS)-(CAS ) Avvertenza: Prodotto pericoloso e infiammabile. Nocivo per contatto con la pelle. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Tossico se inalato. Può irritare le vie respiratorie. Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere/superfici riscaldate. - Non fumare. Evitare di respirare i vapori. Indossare guanti/ indumenti protettivi/ Proteggere gli occhi/ il viso Piridina p.a. (C 5H 5N) (CAS ) Avvertenza: Prodotto pericoloso e infiammabile. Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione Etanolo assoluto (C 2H 6O) (CAS ) Avvertenza: Prodotto infiammabile. Liquido e vapori facilmente infiammabili. Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere/superfici riscaldate. - Non fumare Acqua di tipo 1 conforme alla norma ISO 3696 o acqua deionizzata con resistività 18M cm 2.10 Il reattivo silanizzante si può reperire anche in kit pronti all uso (come p.es. HMDS+TMCS+Pyridine 3:1:9 Supelco cod ) 2.11 Gas tecnici: azoto, idrogeno, elio ed aria per il gascromatografo e per le fasi di disidratazione 3. APPARECCHIATURA 3.1. Gascromatografo : 3.2. Colonna capillare in grado di garantire un efficienza minima di N= piatti/colonna per il saccarosio a 1 g/l. Per esempio OV 1 (25 m x 0,30 mm x 0,15 µm) oppure DB-5 (60 m x 0,25 mm x 0,10 µm). Condizioni operative (a titolo di esempio): 2

3 gas di trasporto: idrogeno o elio puri per gascromatografia Idrogeno: Avvertenza: Gas estremamente infiammabile. Conservare il recipiente in luogo ben ventilato e lontano da fiamme e scintille - Non fumare. Evitare l'accumulo di cariche elettrostatiche. flusso del gas di trasporto: circa 2 ml/minuto, temperatura dell'iniettore 250 C, tempetaratura del rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID): 300 C, programmazione di temperatura: 1 minuto a 160 C, 4 C/minuto fino a 260 C, isoterma a 260 C per 15 minuti, rapporto di splittaggio: circa 1 a 20, gas ausiliari: idrogeno e aria puri per gascromatografia Integratore Siringa micrometrica da 10 µl Micropipette da 10, 100, 400 e 1000 µl Fiale da 2 ml con tappo teflonato Stufa. 3.8 Bilancia tecnica, bilancia analitica in grado di garantire un accuratezza di ± 0.1 mg. 3.9 Matracci da 50 e 100 ml 3.10 Essiccatore 4. MODO DI OPERARE 4.1 Preparazione del campione Pesare, in un matraccio da 50 ml, una quantità p di mosto concentrato rettificato, compresa fra 4.9 e 5.1 g, annotando la pesata con la precisione di ±0.1 mg. Aggiungere poi 1 ml di soluzione standard di xilitolo (2.1) e portare a volume con acqua (2.9). 4.2 Disidratazione del campione Dopo omogeneizzazione del campione, si prelevano 100 µl di soluzione che si pongono in una fiala (3.6) e si portano a secchezza sotto leggera corrente d azoto. Eventualmente aggiungere 100 µl di etanolo assoluto (2.8) per facilitare l'evaporazione. Nota 1: Nel caso interessi un preciso dosaggio del saccarosio, la soluzione diluita deve essere preparata immediatamente prima della silanizzazione, al fine di limitare l idrolisi del saccarosio in soluzione acquosa diluita. Nota 2: Le misure ripetute sul contenuto di saccarosio devono essere eseguite su soluzioni diluite preparate ogni volta prima di ogni silanizzazione 3

4 4.3 Derivatizzazione Il residuo si scioglie accuratamente in 100 µl di piridina (2.7), si aggiungono 100 µl di bistrimetilsililtrifluoroacetamide (2.5) e 10 µl di trimetilclorosilano (2.6), si sigilla la fiala con tappo teflonato e si pone in stufa a 70 C per 70 minuti. Estrarre le fiale sigillate dalla stufa e lasciarle raffreddare in essiccatore al buio a temperatura ambiente per un ora prima di iniettare al gascromatografo. Il silanizzato conservato in fiale sigillate tenute in essiccatore al buio a temperatura ambiente è stabile per tre giorni. Nota 3: Nel caso si operi con il kit di silanizzazione utilizzare 400 µl di reattivo per 100 µl di campione diluito e disidratato come descritto in (4.1). Nota 4: La silanizzazione è andata a buon fine se la soluzione si presenta in una sola fase limpida o con un leggero deposito bianco. Non deve esserci deposito scuro, perché indicherebbe un eccesso di zucchero non derivatizzato o silanizzante invecchiato. Nota 5: In presenza di sospensione bianca, attendere che il solido si depositi sul fondo senza centrifugare. 4.4 Analisi gascromatografica Si preleva 1 µl con la siringa (3.4) e si inietta nel cromatografo con lo splittaggio sopraindicato. Il cromatogramma non deve mostrare un affollamento di picchi (indice di silanizzazione mal eseguita), ma la presenza dei picchi caratteristici come riportato nelle figure allegate (Fig.9 Fig.12). 4.5 Criteri di integrazione dei picchi Integrare i picchi gascromatografici rispetto alla linea di base orizzontale. Nel caso di picchi non perfettamente risolti, tracciare la liea di base orizzontale a partire dall avvallamento più profondo che delimita il picco di interesse. Tracciare una linea verticale verso il basso a partire dalle valli dei picchi fino alla linea di base per individuare la superficie del picco. Non usare la modalità di integrazione valle-valle. Un esempio di applicazione di questi criteri è dato in figura 10 per lo standard interno, in figura 11 per gli inositoli e in figura 12 per il saccarosio. Nota 6: Nel caso interessi un preciso dosaggio del saccarosio, il rispetto dei criteri di integrazione esposti al par e rappresentati nella figura 12 è molto importante. 5. CALCOLI 5.1 Calcolo dei Fattori di Risposta Note : Una curva di calibrazione può essere utilizzata in alternativa al calcolo dei fattori di risposta Preparare una soluzione contenente: - 60 g/l di glucosio, 4

5 - 60 g/l di fruttosio, - 1 g/l di meso-inositolo e - 1 g/l di saccarosio, pesare 60 g di glucosio e 60 g di fruttosio con precisione ± 1 g; poi 1 g di meso-inositolo e 1 g di saccarosio con precisione ±0.1 mg ed infine portare a volume a 1 litro con acqua Silanizzazione della soluzione di riferimento Eseguire le operazioni descritte al paragrafo 4.1 a partire da 5 ml di detta soluzione in luogo dei 5 g di MCR. Prelevare 5 ml di detta soluzione e procedere come al paragrafo Fattori di risposta gascromatografici Si calcolano dal cromatogramma ottenuto i fattori di risposta del meso-inositolo e del saccarosio rispetto allo xilitolo. Per lo scillo-inositolo, che ha un tempo di ritenzione compreso fra l'ultimo picco delle forme anomeriche del glucosio e quello del meso-inositolo (vedi figura 11), utilizzare lo stesso fattore di risposta ottenuto per il meso-inositolo. Posto: A m-inositolo= Area del picco di meso-inositolo; A saccarosio= Area del picco di saccarosio; A is= Area del picco di standard interno; C m-inositolo= concentrazione di m-inositolo in mg/l; C saccarosio= concentrazione di saccarosio in mg/l; C is= concentrazione di standard interno in mg/l, risulta: FR m inositolo = A m inositolo A is FR saccarosio = A saccarosio A is C is C m inositolo C is C saccarosio La soluzione per il calcolo dei fattori di risposta va preparata e analizzata in giornata (vedi nota 1 al paragrafo 4.1) Espressione dei risultati Il meso-inositolo, lo scillo-inositolo e il saccarosio si esprimono in milligrammi per kilogrammi di Zuccheri Totali (mg/kgzt) senza cifre decimali Concentrazioni espresse in mg/l nella soluzione di MCR al 10 % (m/v) (4.1): C m inositolo ( mg l ) = C is A m inositolo FR m inositolo A is C saccarosio ( mg l ) = C is A saccarosio FR saccarosio A is 5

6 5.2.2 Concentrazioni espresse in mg/kg su Zuccheri Totali (mg/kg ZT) per il meso-inositolo e lo scillo-inositolo e per il saccarosio nel MCR. Indicando con i uno qualsiasi dei tre composti: CONC i ( mg kgzt ) = C i 5000 p G Dove p è la pesata in g del MCR e G è il grado zuccherino del MCR espresso in Brix [oppure % (m/m) di saccarosio]. Il grado zuccherino del campione di MCR deve essere misurato con il metodo OIV-MA-AS CARATTERISTICHE DEL METODO 6.1 Punti critici Il metodo tratta dell analisi di zuccheri e polialcoli presenti in minima quantità in una matrice di glucosio e fruttosio a concentrazione molto elevata. Occorre quindi verificare la capacità della metodica di fornire risposte lineari nell intervallo di concentrazioni proposto e sufficientemente accurate rispetto a valori noti. Inoltre la metodica prevede l analisi al gascromatografo dei composti silanizzati ottenuti per derivatizzazione degli zuccheri. Questi composti sono sensibili all umidità e tendono a degradarsi nel tempo. E importante quindi verificare che le indicazioni riguardo alla conservazione e manipolazione di questi composti siano adeguate. Infine il saccarosio è soggetto ad idrolisi dovuta alla quantità di acqua residua nel MCR (dal 30 al 45%). Tuttavia la bassa acidità della matrice e l elevata concentrazione di glucosio e fruttosio rallentano il processi di idrolisi e consentono l effettuazione di misure accurate. E importante quindi verificare che i tempi di analisi siano rapidi rispetto all idrolisi al fine di consentire misure ripetibili di saccarosio. 6.2 Linearità E stata preparata una serie di 6 campioni sintetici (compreso il bianco) contenenti una matrice di glucosio e fruttosio ottenuta pesando uguali quantità dei due zuccheri e riferiti ad un contenuto di zuccheri totali del 60% (p/p) nel MCR di partenza. A 5 di tali campioni sintetici sono state aggiunte per pesata quantità crescenti di mesoinositolo e saccarosio fino ad ottenere le concentrazioni riportate nella tabella seguente: 6

7 Cmeso/Cs.i. concentrazione aggiunta N. meso-inositolo saccarosio (mg/kg ZT) (mg/kg ZT) 1 0 (bianco) 0 (bianco) 2 214,7 427, ,0 857, ,2 1675, ,0 3338, ,0 6719,0 I campioni sono stati poi diluiti (4.1), la soluzione diluita è stata disidratata (4.2), silanizzata (4.3) e analizzata al GC ( ). I campioni sono stati poi silanizzati e analizzati al GC. I risultati sono stati verificati in ordine alla linearità ponendo in grafico il rapporto fra le superfici dei picchi del meso inositolo e dello standard interno (A meso/a s.i.) e il rapporto fra le concentrazioni del meso inositolo e dello standard interno (in mg/l), indicato con C meso/c s.i. Le analisi al GC sono state condotte in duplicato ed i dati seguenti si riferiscono alle medie di due valori. Analogo trattamento è stato applicato al saccarosio che segue. Linearità meso-inositolo y = 15,728x + 0,0557 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 Ameso/As.i. Fig. 1 Linearità meso-inositolo La linearità per il meso-inositolo è molto soddisfacente (R>0.998) in tutto l intervallo di concentrazione esplorato. 7

8 Csacc/Cs.i Linearità saccarosio y = 52,108x - 0,2866 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Asacc./As.i. Fig. 2 Linearità saccarosio Relativamente al saccarosio la relazione lineare ipotizzata su tutto l intervallo di concentrazioni esplorato non porta ad una correlazione soddisfacente (R=0.967) ma restringendo il campo di linearità al campione sintetico n.5, la correlazione diventa comparabile con quella per il meso-inositolo (R>0.997). Seguendo le istruzioni al par. 5.1, sono stati ottenuti i seguenti fattori di risposta FR rel. Meso inositolo/xilitolo S.I. RF rel. Saccarosio/Xilitolo S.I. 1,04 ± 0.03 (media ± σ; n=4) 0,36 ± 0,06 (media ± σ; n=4) 8

9 Conc meso-inositolo detrminato al GC (mg/kgzt) 6.3 Specificità La relazione fra meso-inositolo aggiunto e quello determinato al GC è lineare in tutto il campo di misura esplorato e la pendenza della retta è molto vicina ad uno e la pendenza molto vicina a zero Specificità meso-inositolo y = 1,0046x - 9,675 R² = 0, Conc. meso-inositolo aggiunto mg/kgzt Fig. 3 Specifità meso-inositolo Anche il recupero è soddisfacente, fra il 95 e il 105%, come da tabella seguente: C meso aggiunto C meso determinato al GC ±σ (n=2) (mg/kg ZT) (mg/kg ZT) Recupero % ,7 213 ± 2 99% 420,0 419 ± 3 100% 840,2 852 ± % 1727, ± % 2514, ± 36 99% Per quanto riguarda la specificità riguardo al saccarosio, le concentrazioni ottenute dal calcolo sul saccarosio aggiunto e quelle determinate al GC sono in buon accordo ed in relazione lineare fra loro, con pendenza uno ed intercetta quasi zero, a patto però di considerare un range di concentrazioni più ristretto rispetto a quello esplorato. Dal grafico seguente si nota che la relazione lineare non si estende fino all ultimo livello di concentrazione a circa 6700 mg/kgzt. 9

10 Conc. Saccarosio determinato al GC, mg/kgzt Specificità saccarosio y = 0,9956x + 43,029 R² = 0, Conc. Saccarosio aggiunto mg/kgzt Fig. 4 Specificità saccarosio Anche il recupero è soddisfacente, fra il 90 e il 110%, escluso il livello a concentrazione più elevata, come da tabella seguente: C saccarosio aggiunto (mg/kg ZT) C saccarosio determinato al GC ±σ (n=2) (mg/kg ZT) Recupero % ,3 423 ± 16 99% 857,7 913 ± % 1675, ± % 3338, ± % 6719, ± % 6.4 Stabilità del saccarosio nel mosto concentrato rettificato Un campione di MCR aggiunto di saccarosio è stato conservato a temperatura ambiente ed analizzato a intervalli di tempo regolari al fine di conoscere l incidenza del fenomeno di idrolisi del saccarosio nel MCR. I risultati sono riassunti nella tabella seguente: t = 0 giorni t=9 giorni t=53 giorni Meso-inositolo (mg/kg ZT) Scillo-inositolo (mg/kg ZT) Saccarosio (mg/kg ZT)

11 Concentrazione Sia il meso-, che lo scyllo-inositolo che il saccarosio non mostrano significative variazioni nella concentrazione rispetto a quella iniziale fino a 53 giorni dalla preparazione. Questo fatto appare evidente nel grafico che segue: Stabilità nel tempo Tempo dalla preparazione (giorni) Meso mg/kgzt Scyllo mg/kgzt Sacc mg/kgzt Fig 5 Stabilità nel tempo 6.5 Stabilità del silanizzato Mesoinositolo (mg/kg ZT) Scilloinositolo (mg/kg ZT) Saccarosio (mg/kg ZT) Il prodotto della silanizzazione ottenuto come descritto al punto 4.2 è stato conservato come descritto nello stesso paragrafo. Ad intervalli di 24 ore il campione silanizzato è stato analizzato al gascromatografo seguendo le modalità stabilite al p.to 4.3 e seguenti. I risultati sono descritti nella seguente tabella: t=0 media ± SD (n=3) t=24 h media ± SD (n=3) t=48 h media ± SD (n=3) t=72 h media ± SD (n=3) t=96 h media ± SD (n=3) 2424 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

12 mg/kg ZT mg/kg ZT Non vi sono significative differenze fra i risultati ottenuti a partire dallo stesso campione silanizzato fino a 4 giorni dopo la silanizzazione, adottando le cautele per la conservazione del silanizzato prescritte al p.to 4.2. Questo fatto appare evidente nei grafici che seguono: 3000 Meso-inositolo ore Fig 6 Stabiltà del meso-inositolo 300 Scillo-inositolo ore Fig 7 Stabilità del scillo-inositolo 12

13 mg/kg ZT 8000 Saccarosio 6.6 Precisione ore Fig 8 Stabilità del saccarosio Parametri di precisioni risultanti dalla prova interlaboratorio condotta nel mese di aprile 2014 fra 8 laboratori Italiani. Il Ring Test è stato condotto su un campione aggiunto di saccarosio nella misura di 1 g saccarosio per 1 Kg MCR. Saccarosio mesoinositolo scylloinositolo Numero di laboratori partecipanti Numero di risultati accettati Valori medi (mg/kg ZT) Ripetibilità Scarto tipo di ripetibilità (Sr) Scarto tipo di ripetibilità relativo (%RSD r) 4,7 5,4 7,3 Limite di ripetibilità (r ) HORRAT(r)= RSD r / RSD(R) Horwitz 0,9 1,0 1,0 Riproducibilità Scarto tipo di riproducibilità (SR) Scarto tipo di riproducibilità relativo (%RSD R) 7,4 8,0 13 Limite di riproducibilità (R) RSD(R) Horwitz % 5,2 5,7 7,6 HORRAT(R)= RSD R / RSD(R) Horwitz 1,4 1,4 1,8 S r/s R 0,64 0,68 0,58 13

14 7 BIBLIOGRAFIA 7.1 Versini, G., Dalla Serra, A., & Margheri, G. (1984). Polialcooli e zuccheri minori nei mosti concentrati rettificati. Possibili parametri di genuinità? Vignevini, 11(3), Monetti A., Versini G., Dalpiaz G. and Raniero F., (1996) Sugar adulterations control in concentrated rectified grape musts by finite mixture distribution analysis of the myo-inositol and scyllo-insitol content and the D/H methyl ratio of fermentative ethanol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44-8: FIGURE Fig. 9 Cromatogramma della soluzione di riferimento per il calcolo dei fattori di risposta Fig. 10 Cromatogramma di un MCR - ZONA Standard Interno 14

15 Fig. 11 Cromatogramma di un MCR - ZONA Inositoli Fig. 12 Cromatogramma di un MCR addizionato di saccarosio 0,5 g/kg 15