Osservazioni sulla resistenza agli antimicrobici di enterobatteriacee isolate da uccelli da gabbia e da voliera.

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO CORSO DI L AUREA I N M EDICINA VETERINARIA DIPA RTIMENTO DI MEDICINA VETERINARIA Osservazioni sulla resistenza agli antimicrobici di enterobatteriacee isolate da uccelli da gabbia e da voliera. Relatore: Dott. Guido Grilli Correlatore: Dott.ssa Camilla Calligarich Tesi di laurea di: Lorenzo Bassi Matricola:

2 Introduzione Scopo della tesi Determinare le specie di Enterobacteriaceae commensali negli uccelli d affezione. Valutare la resistenza agli antimicrobici dei ceppi isolati. Fornire spunti di ricerca in relazione a queste specie, considerata la scarsa bibliografia. Canarino (Serinus canaria) Ara gialloblu (Ara ararauna)

3 Introduzione Perché?

4 Introduzione Perché? In Italia si stimano oltre 12 milioni di pet-bird distribuiti tra allevamenti e proprietari (FEDIAF, 2014). Contatti anche diretti con tutto il nucleo famigliare, con persone di qualsiasi età. Dispersione di batteri fecali in ambiente domestico inevitabile. Terapie empiriche e senza prescrizione, anche con farmaci antimicrobici ad uso umano.

5 Introduzione Allevamento e detenzione Federazione Ornicoltori Italiani (FOI) e associazioni territoriali: allevatori, registro nazionale, eventi e divulgazione. Legge-quadro sulla caccia (n.157/1992) e convenzione CITES (Reg. CE n.338/97). Cenerino (Psittacus erithacus) Specie di libera detenzione e commercio. (sx) Diamante di Gould (Erythrura gouldiae) (dx) Cocorita (Melopsittacus undulatus)

6 Introduzione Specie più diffuse Passeriformes Psittaciformes Ciuffolotto (Pyrrhula pyrrhula) Canarino (Serinus canaria) Cardellino (Carduelis carduelis) Cenerino (Psittacus erithacus) Ara gialloblu (Ara ararauna) Amazzone fronte gialla (Amazona ochrocephala) Diamante di Gould (Erythrura gouldiae) Diamante mandarino (Teniopygia guttata) Passero del Giappone (Lonchura striata domestica) Inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis) Calopsitta Cocorita (Nymphicus hollandicus) (Melopsittacus undulatus) Parrocchetto dal collare (Psittacula krameri)

7 Introduzione Microbioma intestinale delle specie aviarie Microbioma: «Insieme del patrimonio genetico e delle interazioni ambientali della totalità dei microorganismi di un ambiente definito» (Turnbaugh, 2007). Il microbioma intestinale aviare è determinato dalla specie ospite, dall ambiente, dall età e dell alimentazione. Enterobatteriaceae spesso presenti ma non predominanti. Hanno ruolo primario nella generazione e trasmissione della resistenza agli antimicrobici. Sono inoltre indicatori di antibiotico-resistenza secondo la direttiva CE 99/2003.

8 Introduzione Principali enterobatteriacee nelle specie aviarie Escherichia coli Salmonella spp. Yersinia enterocolitica Shigella spp Citrobacter freundii Serratia spp. Serratia marcescens (Agar MacConkey) Shigella spp. (Agar MacConkey) Proteus spp. Escherichia coli (Agar MacConkey)

9 Introduzione Antibiotico-resistenza: origine e trasmissione Capacità dei batteri di resistere all azione delle sostanze antimicrobiche, naturale o acquisita. Mutazione e selezione di ceppi resistenti. Trasmissione della resistenza tramite ricombinazione: trasduzione, trasformazione e coniugazione. Particolare rilevanze del plasmide R nelle Enterobacteriaceae.

10 Introduzione Antibiotico-resistenza: situazione attuale Sono stimate morti l anno dovute all antibiotico-resistenza (O Neill, 2016). Importanza fondamentale dei farmaci antimicrobici: un utilizzo consapevole è essenziale. Conseguenze del passato e nuove sfide. Le specie aviarie sono coinvolte nello sviluppo e nella diffusione dell antibiotico-resistenza.

11 Materiali e metodi Raccolta dei campioni Raccolta di materiale fecale fresco da uccelli asintomatici, con fogli di alluminio. Campionamenti da pet-bird, allevamenti e un negozio di animali. Esemplari campionati erano esenti da trattamento antibiotico da almeno 6 mesi. 64 campionamenti da passeriformi e psittaciformi: 23 pet-bird, 28 pool da allevamenti e 13 da negozio di animali. Conservazione dei campioni sigillati a temperatura di refrigerazione. Canarino, campionamento in corso.

12 Materiali e metodi Colture batteriche... Agar MacConkey Mueller Hinton Agar Campione fecale Acqua sterile Terreno di arricchimento (BHI)

13 Materiali e metodi Identificazione di specie RapID ONE è un sistema qualitativo miniaturizzato che utilizza convenzionali substrati cromogeni per l identificazione di Enterobacteriaceae di rilevanza clinica ed altri bacilli Gram-negativi.

14 Materiali e metodi Antibiogrammi Classi testate: Antimicrobico Dose disco Sigla Aminoglicosidi Apramicina 15 µg APR Neomicina 10 µg N Chinoloni Streptomicina 25 µg S Ciprofloxacina 5 µg CIP Enrofloxacina 5 µg ENR Levofloxacina 5 µg LEV... Tecnica di Kirby-Bauer Polipeptidi Sulfamidici Flumequina 30 µg UB Colistina solfato 25 µg CT Polimixina B 300 U PB Cotrimossazolo 25 µg SXT Tetracicline β Lattamici Cefalosporine Triple-sulfa 300 µg S3 Doxiciclina 30 µg DO Tetraciclina 10 µg TE Amoxicillina e ac. clavulanico 30 µg AMC Cefotaxime 30 µg CTX Fenicoli Ceftazidime 30 µg CAZ Cloramfenicolo 30 µg C Florfenicolo 30 µg FFC

15 Risultati e discussione Specie aviarie campionate 64 Campioni 41 Isolamenti 17 da Passeriformes (8 specie) 24 da Psittaciformes (14 specie) Canarino (Serinus Canaria) Diamante fetonte (Neochmia phaeton) Diamante di Kittlitz (Erythrura trichroa) Cappuccino tricolore (Lunchura malacca) Cardinalino del venezuela (Spunus cucullata) Cardellino (Carduelis carduelis) Diamante di Gould (Erythrura gouldiae) Passero del Giappone (Lonchura striata domestica) Parrocchetto dal collare (Psittacula krameri) Parrocchetto ali cremisi (Aprosmictus erythropterus) Cocorita (Melopsittacus undulatus) Parrocchetto alessandrino (Psittacula eupatria) Groppone rosso (Psephotus haematonotus) Parrocchetto capinero (Pyrrhura rupicola) Pappagallino del pacifico (Forpus coelestis) Cenerino (Psittacus erithacus) Calopsitta (Nymphicus hollandicus) Rosella orientale (Platycercus eximius) Rosella cremisi (Platycercus elegans) Inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis) Amazzone fronte gialla (Amazona ochrocephala) Conuro del sole (Aratinga solstitialis)

16 Risultati e discussione Ceppi batterici isolati Altri Yersinia enterocolitica Massima prevalenza per Y. enterocolitica, solitamente è inferiore ma è già stata osservata oltre il 20% (Kato, 1985). Prevalentemente da pet-bird e per specie da cocorite. Escherichia spp. Acinetobacter cacloaceticus Serratia spp. Citrobacter freundii Shigella spp. Ceppi di Shigella spp. distribuiti casualmente tra classi. Probabilmente ceppi non patogeni per gli uccelli e dunque per l uomo. C. freundii e Serratia spp. si confermano parte del microbioma fecale: entrambi potenziali opportunisti. E. coli dalla bassa prevalenza come già indicato da altri studi (Alcaraz, 2016). A. calcoaceticus non appartiene alle Enterobacteriaceae, già osservato negli uccelli.

17 Risultati e discussione Esito degli antibiogrammi Categorie EUCAST in base al breakpoint clinico: Resistente Intermedio Sensibile Il 65,2% dei ceppi è multiresistente, solo 2 ceppi sono totalmente sensibili. In confronto alla scarsa letteratura, il risultato è prossimo ai livelli massimi riportati (Giacopello, 2016). Resistenze distribuite tra esemplari d allevamento e pet-bird. Probabile causa: utilizzo indiscriminato degli antimicrobici durante l allevamento.

18 Risultati e discussione Esito degli antibiogrammi Resistente Intermedio Sensibile Levofloxacina: R 8% I 8% S 84% Apramicina: R 30% I 3% S 67% Ceftazidime: R 65% I 8% S 27% Buona efficacia Simili: ciprofloxacina, doxiciclina cloramfenicolo. Efficacia ridotta Simili: altri aminoglicosidi, enrofloxacina, flumequina, sulfamidici, polipeptidi. Scarsa efficacia Simili: cefotaxime, tetraciclina.

19 Risultati e discussione Resistenze di Yersinia enterocolitica Resistente Intermedio Sensibile Levofloxacina: R 10% I 20% S 70% Ceftazidime: R 80% I 10% S 10% Mediamente, la resistenza dei ceppi è maggiore rispetto al gruppo complessivo. Resistenze non ritrovate in ceppi di Y. enterocolitica contaminanti l ambiente (Bonardi, 2010). Rischio potenziale: grande utilità di un indagine del sierotipo per determinare la patogenicità dei ceppi.

20 Risultati e discussione Resistenze di Shigella spp. Resistente Intermedio Sensibile Florfenicolo: R 4/8 I 1/8 S 3/8 Mediamente, la resistenza dei ceppi è minore rispetto al gruppo complessivo. Presenza di sensibilità che mancano in uccelli che vivono all aperto (Abo-Amer, 2015).

21 Risultati e discussione Resistenze di Citrobacter freundii. Resistente Intermedio Sensibile Colistina solfato: R 4/5 I 0/5 S 1/5 Pochi ceppi isolati per considerazioni approfondite, tuttavia marcata resistenza alla colistina solfato, farmaco salva vita in medicina umana.

22 Conclusioni Considerazioni finali Gli uccelli da gabbia e da voliera sono portatori di enterobatteriacee con alti livelli di antibiotico resistenza: rischio diretto a causa eventuali patogeni e indiretto per via dei ceppi innocui. Ruolo fondamentale del Medico Veterinario anche in queste specie, per ogni tipo di trattamento, secondo il principio di One Health. Nota positiva: totale assenza di Salmonella spp., probabilmente per un risanamento degli esemplari da anni allevati in cattività. Ulteriori studi che sfruttano la biologia molecolare sarebbero interessanti per descrivere i geni di resistenza e la loro possibile trasmissibilità. Pappagallo del Senegal (Poicephalus senegalus).

23 Grazie per l attenzione