OSSERVAZIONI SULLA RESISTENZA AGLI ANTIMICROBICI DI ENTEROBATTERIACEE ISOLATE DA UCCELLI DA GABBIA E DA VOLIERA

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO Corso di Laurea in Medicina Veterinaria Dipartimento di Medicina Veterinaria OSSERVAZIONI SULLA RESISTENZA AGLI ANTIMICROBICI DI ENTEROBATTERIACEE ISOLATE DA UCCELLI DA GABBIA E DA VOLIERA Relatore: Dott. Guido Grilli Correlatore: Dott.ssa Camilla Calligarich Tesi di laurea di: Lorenzo Bassi Matricola: Anno accademico

2 INDICE 1 SCOPO DELLA TESI INTRODUZIONE 2.1 Diffusione e allevamento degli uccelli da gabbia e da voliera Aspetti legislativi Associazioni ornitologiche Passeriformi maggiormente diffusi Psittaciformi maggiormente diffusi Principali enterobatteriacee isolate da specie aviarie Microbioma intestinale delle specie aviarie Escherichia coli Yersinia enterocolitica Citrobacter freundii Salmonella spp Proteus spp Shigella spp Serratia spp Introduzione all antibiotico resistenza Cenni storici sullo sviluppo degli antimicrobici Resistenza agli antimicrobici Meccanismi di acquisizione e trasmissione della resistenza Specie aviarie e antibiotico resistenza.38 3 MATERIALI E METODI 3.1 Raccolta dei campioni Analisi dei campioni Colture batteriche Identificazione di specie Antibiogrammi.44 1

3 INDICE 4 RISULTATI E DISCUSSIONE 4.1 Ceppi batterici isolati Panoramica degli isolamenti effettuati Isolamenti di Yersinia enterocolitica Isolamenti di Shigella spp Isolamenti di Citrobacter freundii Isolamenti di Serratia spp Isolamenti di Acinetobacter calcoaceticus Isolamenti di Escherichia spp Altri isolamenti Risultati della sensibilità agli antimicrobici Panoramica degli antibiogrammi Resistenze specifiche CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA RINGRAZIAMENTI

4 1 SCOPO DELLA TESI Lo scopo dello studio è quello di indagare quali siano gli enterobatteri commensali delle specie di uccelli d affezione e di valutarne la resistenza agli antimicrobici. Si vuole dunque descrivere se e in quale misura le specie aviarie che vivono a stretto contatto con l uomo possano essere portatrici di ceppi batterici antibiotico resistenti. Le enterobatteriacee sono infatti note per la capacità di sviluppare e trasmettere antibiotico resistenza. L antibiotico resistenza di batteri commensali e patogeni di origine animale è infatti uno dei più grandi problemi di sanità pubblica in tutto il mondo. L Unione Europea ha definito l antibiotico resistenza come una zoonosi trasversale nella direttiva CE 99 del 17 novembre Nella suddetta direttiva, viene inoltre evidenziata la necessità di sorvegliare non solo gli agenti zoonosici ma anche gli organismi indicatori che possono essere utili per valutare la diffusione del fenomeno dell antibiotico resistenza. Già altri studi hanno dimostrato che le specie aviarie possono albergare enterobatteri antibiotico resistenti, tuttavia non sono molti i lavori inerenti gli uccelli da gabbia. In Italia, i cosiddetti nuovi animali da compagnia godono di crescente diffusione negli ultimi anni. In particolare, secondo il rapporto dell Istituto di Studi Politici, Economici e Sociali (EURISPES) del 2016, il 5,4% degli animali domestici sono uccelli. Considerate le peculiarità di mantenimento di questi animali, è ragionevole pensare che la dispersione di enterobatteri in ambiente domestico sia più che probabile, da qui l intenzione di valutare l entità del rischio. Nell introduzione viene descritta la diffusione degli uccelli da gabbia e da voliera citando alcune delle specie più diffuse, con cenni alle leggi che ne regolano la detenzione. Vengono poi passati in rassegna i principali enterobatteri che la letteratura evidenzia in queste specie. Viene infine descritto il fenomeno dell antibiotico resistenza ed il rapporto che questo ha con le specie aviarie. 3

5 2 INTRODUZIONE 2.1 Diffusione e allevamento degli uccelli da gabbia e da voliera Aspetti legislativi In Italia, l allevamento di molte specie di uccelli d affezione e da allevamento per uso sportivo deve sottostare a precise leggi che ne regolano la detenzione ed il commercio affinché questo sia compatibile con la sopravvivenza e la conservazione della specie in oggetto. La regolamentazione è portata in atto tramite metodi di marcatura (anelli inamovibili o microchips) per certificare la nascita in cattività dei soggetti. Vengono impiegati inoltre registri e denunce di spostamento, nascita e morte per il monitoraggio del traffico. Da queste leggi sono esenti le specie considerate storicamente domestiche, come il canarino (Serinus canaria domestica). Esiste una prima grande distinzione in base alle due principali fonti legislative che regolano la detenzione degli uccelli d affezione. Risultano infatti differenti se la specie in oggetto costituisce fauna autoctona o alloctona (esotica). In caso di specie autoctone, ad esempio il cardellino (Carduelis carduelis), si fa riferimento alla cosiddetta legge-quadro sulla caccia dell 11 febbraio 1992, n.157 e successive modifiche e integrazioni, in materia di Norme per la protezione della fauna selvatica omeoterma e per il prelievo venatorio. La legge prevede la possibilità da parte delle regioni di autorizzare l allevamento di fauna selvatica a scopo di ripopolamento, ornamentale ed amatoriale (art.17, comma 1). L art 21 (comma 1) vieta al contempo la detenzione, l acquisto e la vendita di esemplari vivi di specie di avifauna selvatica nazionale non proveniente da allevamenti. Da questa legge derivano dunque diversi recepimenti in base alla regione in cui risiede l allevamento, per certi aspetti ci sono differenze anche a livello provinciale. In generale, l allevatore deve chiedere autorizzazione presso l ente preposto, deve dunque sottostare alle leggi regionali in merito alle specie allevabili, al numero di capi, agli obblighi di marcatura e deve provvedere all aggiornamento dell eventuale registro di detenzione. A titolo esemplificativo, in regione Lombardia vige il regolamento regionale n. 16 del 4 agosto 2003 come attuazione di parte della legge regionale del 16 agosto 1993 in merito a Norme per la 4

6 protezione della fauna selvatica e per la tutela dell equilibrio ambientale e disciplina dell attività venatoria. Nello specifico, al capo V si tratta di Allevamento di fauna selvatica autoctona, limitatamente alle classi mammiferi ed uccelli, a scopo alimentare, di ripopolamento, ornamentale ed amatoriale. Secondo questo regolamento, l ente preposto all autorizzazione è la Provincia, al quale l allevatore deve comunicare generalità, sede dell allevamento e specie allevate (art. 22 comma 2). La Provincia può riservarsi il diritto di stabilire il numero massimo di capi per gli allevamenti a scopo ornamentale, tuttavia, per allevamenti di questo tipo, non è richiesta nessuna autorizzazione per la famiglia dei Fringillidi qualora siano detenuti fino a trenta capi (art. 22 comma 3 e 4). Nell art 23 (comma 2) la regione obbliga il proprietario di allevamenti ornamentali ad essere iscritto alla Federazione Ornicoltori Italiani (FOI) o ad altra associazione riconosciuta a livello nazionale o internazionale. Questo poiché viene successivamente descritto l obbligo di marcatura con anello inamovibile, il quale è fornito dalle associazioni e riporta il numero di matricola dell allevatore iscritto, nonché l anno di nascita ed il numero identificativo dell animale (art. 23 comma 4 e 5). Viene così certificata la nascita in cattività dei soggetti e la loro tracciabilità, unitamente ai documenti di cessione descritti nell art 23, comma 6. Per quanto concerne la detenzione di specie esotiche, si fa invece riferimento alle leggi che derivano dall accordo siglato in occasione della Convention on International Trade of Endangered Species firmata a Washington nel 1973 e in vigore dal La CITES ha lo scopo di monitorare e regolamentare il commercio internazionale di flora e fauna selvatiche in pericolo di estinzione. Attualmente aderiscono alla convenzione 182 stati. Nella convenzione, le specie sono suddivise in tre appendici in base al grado di rischio a cui sono sottoposte. Nell appendice I sono comprese specie gravemente minacciate di estinzione e per le quali è rigorosamente vietata la cattura, nonché la detenzione ed il commercio di individui selvatici. Viene concessa la detenzione di soggetti nati in cattività se regolarmente denunciati. Nell appendice II sono incluse specie per cui cattura e commercio sono regolamentati per evitare uno sfruttamento non compatibile con la loro sopravvivenza. Nell appendice III sono infine elencate le specie per cui i singoli stati possono regolarne l esportazione dai propri territori. L unione Europea ha recepito la CITES con il Regolamento del Consiglio n. 338/97 e s.m. In Italia, l attuazione della convenzione è affidata a tre ministeri: Ministero dell Ambiente e della Tutela del Territorio e del Mare, Ministero dello Sviluppo Economico e Ministero delle Politiche Agricole, 5

7 Alimentari e Forestali. Quest ultimo, demanda la gestione amministrativa delle certificazioni e dei controlli al servizio CITES territoriale svolto dal Comando Unità Carabinieri per la tutela forestale, ambientale e agroalimentare. Il suddetto regolamento (CE) n. 338/97 è caratterizzato da termini più restrittivi rispetto alla convenzione originale e suddivide le specie in quattro allegati. Nell allegato A rientrano specie appartenenti all appendice I ed alcune elencate nell appendice II. L allevamento a scopo di vendita di specie aviari che appartengono a questo allegato richiede un registro di detenzione dove annotare le singole entrate ed uscite di soggetti dall allevamento. Risultano inoltre obbligatori il marcaggio tramite anello inamovibile o microchip e la denuncia di nascita. Ogni spostamento degli esemplari deve essere accompagnato dal relativo documento di cessione e certificato CITES. Nell allegato B sono comprese principalmente specie che la CITES ha elencato nell appendice II con l aggiunta di specie appartenenti all appendice I per le quali è stata avanzata una riserva. Per questo allegato il marcaggio non è obbligatorio mentre il registro di detenzione e la denuncia di nascita sono comunque richieste. Il documento di cessione risulta sufficiente per gli spostamenti. In Italia, sono previste esenzioni dall obbligo di possedere il registro tramite decreti ministeriali per le specie di allegato B che godono di ottima diffusione, a patto che queste siano marcate con anello inamovibile. L allegato C comprende le specie dell appendice III assieme a quelle dell appendice II per le quali è stata avanzata una riserva. Infine, l allegato D comprende specie per cui il volume di importazioni in Comunità Europea ne giustifica il controllo, assieme alle specie di appendice III per le quali è stata avanzata una riserva. Questo ultimo allegato comprende dunque specie non citate nella CITES per i quali la Comunità reputa cautelativo un controllo. Si citano infine le sole 4 specie di Psittacidi che non sono comprese nella CITES, la cui detenzione, commercio ed allevamento sono privi di qualsiasi vincolo: l inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis), l ondulato (Melopsittacus undulatus), il parrocchetto dal collare (Psittacula krameri) e la calopsitta (Nymphicus hollandicus). Queste specie sono infatti ampiamente diffuse in cattività e la minaccia data dallo sfruttamento commerciale delle popolazioni selvatiche è pressoché nulla. La diffusione di queste specie le porta ad essere tra i più comuni psittacidi che ricoprono il ruolo di pet-bird. 6

8 2.1.2 Associazioni ornitologiche A livello mondiale, la Confederation Ornithologique Mondiale o COM è la principale organizzazione che riunisce più di 40 stati nazionali e fa capo alle rispettive federazioni. La C.O.M nasce il 10 novembre 1956 quando nel congresso straordinario di Milano è stata ratificata la decisione presa nella riunione internazionale di Parigi del 18 marzo dello stesso anno, ovvero la fusione tra l Associazione Ornitologica Internazionale (AOI) e la Confederazione Internazionale del Canarino (CIC). La COM ha sede in Olanda e la lingua ufficiale è il francese. Lo scopo dell organizzazione è quello di diffondere e mantenere la cultura ornitologica quale parte integrante della cultura e della conservazione delle specie aviarie. La COM organizza ogni anno due campionati mondiali di ornitologia (uno per emisfero) distribuendo anno dopo anno gli eventi alle varie federazioni nazionali. L istituzione si distingue per l impegno d istruzione verso i giovani, nei confronti dei quali viene messa in evidenza l importanza del rispetto e del benessere per la natura animale. La COM si occupa anche di campagne di sensibilizzazione per dimostrare all opinione pubblica che l allevamento ornamentale e sportivo delle specie aviarie non prescinde dalla loro salvaguardia e che, al contrario, né è parte integrante. Sugli stessi principi ed obbiettivi sono basati gli statuti delle federazioni nazionali affiliate. In Italia, l associazione nazionale prende il nome di FOI (Federazione Ornicoltori Italiani). La Federazione Ornicoltori Italiani Onlus è un ente riconosciuto con D.P.R. del 15 dicembre 1949 n.1166 che riunisce appassionati ed allevatori con lo scopo di promuovere lo studio, il miglioramento, lo sviluppo e la conservazione del patrimonio ornitologico. Alla FOI afferiscono come affiliate oltre 230 associazioni e 44 club di specializzazione in relazione a determinate specie allevate. In totale, conta circa allevatori distribuiti su tutto il territorio nazionale. L importanza di una capillarità così marcata sta nella possibilità di coordinare l allevamento ornamentale e sportivo così da garantire una riproduzione in cattività nel rispetto delle leggi e dunque della conservazione delle specie. Il motto Allevare è proteggere è particolarmente pregnante quando si tratta di riproduzione in cattività di specie in via di estinzione. La FOI promuove questo tipo di attività nel rispetto delle leggi, aggiornando gli iscritti sulle procedure corrette per la detenzione e per il mantenimento del benessere animale. Il commercio illegale, infatti, è una delle cause fondamentali della scomparsa di diverse specie di uccelli. La raccomandazione della Commissione CITES del 13 giugno 2007 riporta infatti Per rafforzare la cooperazione e lo scambio 7

9 di informazioni, gli Stati membri [ ] forniscono pareri ed assistenza per agevolare il commercio legale e sostenibile grazie ad una corretta applicazione delle procedure. Le attività ornitologiche sviluppate dalla FOI hanno permesso infatti di salvaguardare con successo diverse specie che ora, grazie alla consistente presenza della popolazione domestica, non sono più a rischio di estinzione. Questo risultato è ottenuto sia in maniera diretta con l incremento della popolazione, sia indiretta per via dell annullamento del prelievo in natura vista la reperibilità del mercato. La burocrazia stessa si semplifica man mano che una specie si diffonde, rendendo l allevamento accessibile ad un pubblico più ampio. Un esempio calzante è quello del Cardinalino del Venezuela (Spinus cucullata) che ha ottenuto la rimozione dagli elenchi CITES. Anche molte specie appartenenti alla famiglia Estrildidae sono minacciate in natura ma godono di un ottima diffusione in allevamento. La FOI in collaborazione con le società provinciali si occupa di indire manifestazioni divulgative e sportive come seminari e mostre ornitologiche. Figura 1: Esposizione ornitologica locale dove sono stati prelevati alcuni campioni (Archivio personale). Altra funzione fondamentale della FOI è quella di costituire un registro nazionale degli allevatori e di fornire ad essi gli anelli inamovibili richiesti per il marcaggio di molte specie. Questo sistema permette una semplice tracciabilità dei soggetti oltre a certificarne la nascita in cattività. Il sistema può tornare utile agli stessi medici veterinari e assume valenza per la sanità pubblica. La possibilità di risalire all origine dell animale è infatti di particolare rilevanza quando si ha a che fare con focolai di malattie pericolose per l uomo, ad esempio l influenza aviaria. La FOI si occupa inoltre di aggiornare gli allevatori sui rischi sanitari e sulle misure da adottare per problematiche inerenti la salute pubblica qualora le specie aviarie siano coinvolte. Questa azione è mediata dalla diffusione 8

10 delle norme sanitarie e dalla eventuale sospensione di attività che porterebbero allo spostamento e concentrazione di soggetti sensibili. Per quanto riguarda le problematiche sanitarie dei singoli soggetti o allevamenti, la FOI promuove il ruolo del medico veterinario, facilitando gli allevatori nella ricerca di professionisti specializzati in medicina aviare ed avvalendosi del supporto degli stessi per la pubblicazione di articoli Passeriformi maggiormente diffusi Il canarino (Serinus canaria) è sicuramente uno dei passeriformi più diffusi ed il suo allevamento vanta una storia secolare. La specie è caratterizzata da un rapido adattamento alla vita in cattività e ciò ne ha permesso la sua diffusione già a partire dalla scoperta delle Isole Canarie nel Il canarino allevato si è presto diffuso in tutta Europa ed è stata la specie che ha trainato la fondazione delle prime società ornitologiche. Oggi sulle isole sono contate circa coppie selvatiche. I canarini selvatici non superano i 16cm di lunghezza, in cattività invece lo sviluppo di svariate razze ha permesso di raggiungere misure di 20-22cm. Il canarino è un animale sociale e può reagire molto bene all addestramento previo imprinting. Tuttavia la caratteristica per cui da sempre suscita l interesse dell uomo sono la livrea che conta decine di mutazioni ed il canto. Entrambe queste caratteristiche sono oggetto di selezione e competizione. L enorme numero di soggetti allevati da sportivi ed amatori rendono il canarino facilmente reperibile sul mercato e assieme al minimo impegno gestionale lo rendono uno dei pet-bird di maggior successo. Figura 2: Esemplare di canarino campionato (Archivio personale). 9

11 Il cardellino (Carduelis carduelis) è il passeriforme indigeno più allevato da amatori e sportivi. Appartiene alla famiglia Fringillidae e in natura le sottospecie di cardellino popola storicamente un vasto areale comprendente Europa continentale e l Asia centrale (dove sverna). In Italia, la specie è ben rappresentata in tutto il territorio nazionale. La sottospecie autoctona è molto interessata dall allevamento ma attualmente gode di maggior successo la sottospecie del cardellino maggiore (Cardueli carduelis major) caratterizzato da dimensioni superiori (15,5 cm) e originario dell Asia settentrionale. La riproduzione in cattività del cardellino richiede esperienza e per avere successo l allevatore deve disporre di strutture ed alimenti adeguati. L igiene risulta particolarmente importante data la suscettibilità della specie a contrarre malattie in cattività. L appoggio del medico veterinario per visite in allevamento, controlli routinari ed eventuali terapie risulta di grande aiuto in questo tipo di allevamento. Per via di quanto descritto la specie, pur godendo di buona reperibilità sul mercato, non è molto diffusa come animale da compagnia considerate le accortezze gestionali e i prezzi non sempre accessibili. Altre specie indigene comuni ma caratterizzate da diffusione esclusiva in allevamenti sportivi ed amatoriali sono il ciuffolotto (Pyrrhula pyrrhula), l organetto (Carduelis flammea) e il lucherino eurasiatico (Spinus spinus). Detenzione e riproduzione in cattività di queste specie sono regolamentate dalla legge 157/1992 e dalle derivate leggi regionali. La famiglia Estrildidae, in gergo esotici, comprende un gruppo di passeriformi comuni sia negli allevamenti che come animali da compagnia. Si tratta di uccelli granivori dall aspetto robusto ma dalle ridotte dimensioni (8-17 cm) caratterizzati in molti casi da livree molto colorate che spesso sono parte del dimorfismo sessuale. La sottofamiglia Estrildinae ha diffusione prevalentemente afrotropicale mentre la sottofamiglia Lonchurinae è diffusa in Oceania e sud-est asiatico. Il diamante mandarino (Taeniopygia guttata) è certamente una delle specie di esotici più diffusa, è riprodotta in cattività da secoli per via della sua rusticità. Ricopre un ruolo rilevante anche nella ricerca scientifica essendo spesso utilizzato come organismo modello grazie alla rapidità del ciclo vitale. Il diamante di Gould (Erythrura gouldiae) è un altro comune uccello da gabbia esotico. Di origine Australiana, è stato oggetto di indiscriminate catture in natura che hanno minacciato fortemente la sopravvivenza della specie nei primi anni 80. L irrigidimento legislativo e dei controlli unitamente alla crescita della popolazione domestica ha permesso a queste popolazioni di riprendersi negli ultimi anni. La riproduzione in cattività è spesso mediata dall utilizzo di balie di passero del Giappone (Lonchura striata domestica), altra comune specie esotica dalla bassa selettività nei confronti dei nidiacei. Dal punto di vista legislativo, le specie sopracitate sono escluse dalle liste CITES ma 10

12 l esclusione non vale per tutti gli esotici: il padda (Lonchura oryzivora) gode di buona diffusione ma è compreso in allegato B. Figura 3: Diamante di Kittlitz (Erythrura trichroa, archivio personale) Psittaciformi maggiormente diffusi La famiglia Psittacidae nell ordine Psittaciformes comprende la maggior parte delle specie di pappagalli esistenti. Le più emblematiche sono senza dubbio quelle di grandi dimensioni, in particolare le are, le amazzoni ed il pappagallo cenerino. L ara gialloblu (Ara ararauna) è certamente la più nota e diffusa specie del genere Ara. Può misurare fino a cm ed è una specie docile che ben si adatta alla vita da animale da compagnia oltre a costituire attrazione in diversi parchi. In natura è presente in buon numero in tutta la parte centro-settentrionale dell America del sud. Altre specie del genere molto diffuse sono l ara ali verdi (Ara chloroptera) e l ara scarlatta (Ara macao). Anche tra le amazzoni sono presenti specie dalla spiccata propensione alla vita domestica grazie alla loro intelligenza e socialità, in particolare si menzionano per diffusione l amazzone fronte gialla (Amazona ochrocephala) e l amazzone fronte azzurra (Amazona aestiva). Sono anch esse specie sudamericane ma dalla forma più compatta. Tra i grandi pappagalli, il cenerino (Psittacus erithacus) è quello che probabilmente gode di maggiore diffusione in cattività. In natura popola l Africa equatoriale con nuclei separati di popolazioni appartenenti a diverse sottospecie. L innata predisposizione alla riproduzione dei suoni di questa specie lo ha reso uno dei più popolari uccelli parlatori, è infatti molto diffuso come animale da compagnia. La specie ha grande rilevanza scientifica per via di queste abilità: sono spesso selezionati da questa specie soggetti per lo studio dello lo sviluppo cognitivo e la capacità di espressione mediante linguaggio vocale. Pepperberg 11

13 (1981) descrive come le vocalizzazioni non siano semplici riproduzioni ma possano essere associate a dei concetti e combinate dall animale per esprimere necessità e descrivere situazioni. Tuttavia, nonostante la fama e la diffusione, la specie è stata recentemente spostata dall allegato B all allegato A in seguito ad una decisione della commissione CITES. Tutte le specie sinora descritte hanno buona reperibilità sul mercato, come animali da compagnia richiedono però un impegno non indifferente per spazi e spese. Figura 4: Coppia di pappagalli cenerini (Psittacus erithacus) in allevamento (Archivio personale). La famiglia Psittacidae comprende anche specie di ridotte dimensioni che si sono adattate molto bene alla vita in cattività e che numericamente sono i pappagalli più diffusamente tenuti come petbird. Unitamente a queste caratteristiche, il successo è dovuto anche allo svincolo legislativo, si fa riferimento infatti a specie di psittacidi che non compaiono nelle liste CITES. Il parrocchetto ondulato o cocorita (Melopsittacus undulatus) è un uccello originario dell Australia dal corpo slanciato e dalla lunga coda. Misura al massimo 20 cm ma in cattività è stata selezionata una razza gigante detta inglese che può misurare 24 cm. Il ciclo riproduttivo rapido, la frugalità e la resistenza lo rendono diffusissimo e molto accessibile. Presenta inoltre un dimorfismo sessuale evidente ed è dunque un ottima specie per coloro che iniziano ad allevare. L inseparabile a faccia rosa (Agapornis roseicollis) è una specie africana dalla corporatura compatta e robusta. Misura circa 16.5 cm e in natura popola Namibia, Sudafrica e Angola ed è suddiviso in due sottospecie (A.r. roseicollis e catumbella). In cattività i soggetti si sono caratterizzati da una taglia maggiore e da colori più brillanti. L imprinting è particolarmente efficace in questa specie, può portare l animale ad avere un legame molto forte con il proprietario. Si menziona infine il parrocchetto dal collare (Psittacula krameri), una specie originaria dell Africa centro-settentrionale di media taglia (40 cm con lunga 12

14 coda). Di questa categoria è sicuramente il più conosciuto e diffuso. Oltre alla comune reperibilità in commercio, sono presenti popolazioni selvatiche alloctone in Italia. Sono segnalate popolazioni stabili da diversi anni a Genova, Roma, Milano, Palermo e Bolzano. Questo rappresenta un problema emergente per l ecosistema. L impatto su quest ultimo può essere infatti pesante in assenza dei fattori limitanti le popolazioni aliene, tipici dei loro habitat di origine (Pasqua, 2005). Figura 5: Giovani inseparabili (Agapornis roseicollis, archivio personale) La famiglia Cacatuidae comprende specie dalla caratteristica cresta erettile. Popola un areale ristretto comprendente Australia e relative isole. A questa famiglia appartiene il cacatua cresta gialla (Cacatua sulphurea), pappagallo di grandi dimensioni (48 cm) dalla buona fama e diffusione in cattività ma dalla critica situazione in natura. Si stimano poche migliaia di esemplari rimasti nelle isole di origine, questa situazione è imputabile alla distruzione dell habitat e alla cattura indiscriminata. Altre specie di grossa taglia comuni come animali da compagnia sono il cacatua delle Molucche (Cacatua moluccensis) ed il cacatua bianco (Cacatua alba). Ai cacatuidi appartiene anche la calopsitta (Nymphicus hollandicus), pappagallo medio-piccolo dall ottimo adattamento alla vita in cattività. Deve il suo successo alla socievolezza oltre che alla sua resistenza. Tra i piccoli pappagalli è quello più predisposto alla riproduzione di suoni. Questa specie è esclusa dalle liste CITES ed è uno dei pappagalli più comunemente scelti come animale da compagnia. 13

15 2.2 Principali enterobatteriacee isolate da specie aviarie Il microbioma intestinale nelle specie aviarie Per microbioma si intende l insieme del patrimonio genetico e delle interazioni ambientali della totalità dei microorganismi di un ambiente definito (Turnbaugh et al., 2007). Questo concetto può essere applicato ad un intero organismo o ad una parte di esso. Lo studio del microbioma nelle specie aviari è tutt oggi oggetto di studio, in particolare sono carenti informazioni ben codificate riguardanti la composizione del microbioma in situazioni fisiologiche per ogni specie. In generale, sembra che la presenza commensale di specie batteriche appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae sia proporzionalmente minore rispetto alle altre specie batteriche, soprattutto nelle specie granivore e onnivore (Brittingham et al., 1988). Il divario diminuisce nel microbioma degli uccelli rapaci dove una maggiore presenza di enterobatteri è considerata fisiologica dal punto di vista clinico (Drewes e Flammer 1986). Brittingham et al. (1988) ricercando 6 generi di specie batteriche, osserva le seguenti prevalenze da isolamenti tramite tampone cloacale da 364 passeriformi e picchi selvatici: Pseudomonas spp. 22%, Streptococcus spp. 18%, Staphylococcus spp. 15%, Escherichia spp. 1%, Yersinia spp. 1%, Salmonella spp. 0%. Dall intestino del corvo comune (Corvus frugilegus), Vlahovic et al. (2010) hanno isolato Salmonella spp., E. coli, Bacillus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Acinetobacter spp. e Campylobacter jejuni. Ricercando enterobatteri da feci di uccelli migratori passanti per l isola di Ustica, Foti et al. (2011) hanno isolato ceppi di Salmonella bongori, Y. enterocolitica e Klebsiella pneumoniae. Braconaro et al. (2015) hanno isolato, per mezzo di tamponi cloacali da diverse specie di passeriformi selvatici, una popolazione batterica composta da: Acinetobacter spp., Bacillus spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp., 14

16 Pasteurella spp., Proteus spp., Serratia spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp., Klebsiella spp. e Micrococcus spp. Per quanto riguarda gli psittacidi, la popolazione presenta similitudini con le altre specie non carnivore. Xenoulis et al. (2010) isolano infatti da campioni fecali provenienti da un gruppo eterogeneo di psittacidi: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., E. coli, Lactobacillus spp. e Pantoea spp. In un successivo studio su 300 pappagalli oggetto di sequestro per traffico illegale, sono stati isolati da campione fecale: E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus vulgaris, Serratia spp. e Salmonella spp. (Hidasi et al., 2013). Sono stati evidenziati svariati fattori che influenzano il microbioma intestinale delle specie aviarie. Già prima della nascita vi è un determinante innato e cioè la specie ospite. Nello studio di Kropackova et al. (2017) questo determinante viene definito come risultato delle differenti espressioni geniche che influenzano in maniera sia diretta che indiretta la selezione delle specie batteriche costituenti il microbioma. La composizione del microbioma è poi influenzata dall habitat e dall alimentazione, al fine di ottimizzare lo sfruttamento di specifiche risorse. Sono stati infatti osservati microbiomi dal profilo biochimico simile in gruppi eterogenei di passeriformi selvatici in base al territorio di studio (Maul et al., 2005). Le condizioni ambientali influenzano dunque la composizione del microbioma, anche a prescindere dalla predisposizione di specie (Heeb e Lucas, 2005). Un altro fattore che condiziona il microbioma intestinale aviare è il grado di sviluppo dell animale, studi che lo dimostrano sono stati condotti su nidiacei di rondine arboricola bicolore (Trachycineta bicolor, Mills et al., 1999) e su nidiacei di pappagallo amazzone codarossa (Amazona brasiliensis, Vaz et al., 2017). Sono infine state osservate differenze nel microbioma intestinale tra gruppi a vita libera e in cattività di uccelli della stessa specie. Scupham et al. (2008) lo hanno osservato nei tacchini mentre Xenoulis et al. (2010) in diverse specie di psittaciformi. 15

17 Per quanto riguarda il singolo organismo ospite, si osservano variazioni anche in base ai diversi tratti dell apparato digerente. Nel tacchino, ad esempio, la maggiore biodiversità si è osservata nel cieco (Wilkinson et al., 2017) Escherichia coli Escherichia coli è la principale specie rappresentante il genere Escherichia che comprende bacilli spesso capsulati e mobili. E. coli è un batterio anaerobio facoltativo scoperto nel 1885 da Escherich. E. coli è storicamente utilizzato come organismo modello, sono dunque ben noti i profili antigenici che può assumere. E. coli conta 171 sierotipi somatici O, 80 capsulari K e 56 flagellari H. Gli antigeni relativi alle fimbrie F, in particolare F4, F5 e F6, sono di primaria importanza per la potenziale azione patogena del batterio poiché permettono a E. coli di aderire alla mucosa intestinale e colonizzarla (Barnes e Gross, 2001). I ceppi enteropatogeni sono convenzionalmente suddivisi in base al meccanismo che determina la patogenicità. I ceppi enterotossigeni (ETEC) sono provvisti di adesine e dopo la colonizzazione dell epitelio causano sintomatologia tramite la produzione di tossine termolabili e termostabili. L accumulo di AMP ciclico e GMP ciclico causa lo squilibrio elettrolitico da cui deriva la diarrea. I ceppi enteroinvasivi (EIEC) aderiscono, invadono e distruggono la mucosa intestinale liberando endotossine in seguito a morte. I danni riportati dalla mucosa possono permettere lo sviluppo di setticemie e tossiemie. I ceppi enteropatogeni (EPEC) non producono enterotossine ma possono portare alla distruzione dei microvilli e delle cellule mucosali tramite fattori di adesività localizzata. I ceppi enteroadesivi (AEEC) aderiscono all apice dei microvilli causandone la distruzione. Ne consegue la perdita di forma e funzione della cellula che si atrofizza. La conseguente diarrea è causata dal malassorbimento. I ceppi enteroemorragici (EHEC) sono caratterizzati dalla produzione della citotossina Shiga-like. Quest ultima danneggia gli endoteli dei vasi intestinali provocando gravi emorragie in questo distretto (Martino et al., 2005). E. coli è la principale specie di Enterobacteriaceae commensale nel tratto digerente di uomo ed animali. Essendo inoltre la specie più rilevante dal punto di vista clinico tra i coliformi fecali, è anche uno dei principali indicatori della contaminazione fecale di acqua ed alimenti (James et al., 2004). In relazione al consumo o alla fruizione da parte dell uomo, per i diversi ambiti, esistono dei limiti parametrici basati sulla presenza di E. coli che possono determinarne o meno l accettabilità. 16

18 Nell uomo può infatti causare, oltre ad enterite, infezioni del tratto urinario, meningite, peritonite, setticemia e polmonite (James et al., 2004). Figura 6: Isolamento di Escherichia coli su agar MacConkey (Archivio personale) In medicina veterinaria, E. coli causa enterite e setticemie in tutte le specie. Si segnalano inoltre meningiti nei suinetti, mastiti in bovini e suini, infezioni genito urinarie nel cane e nel gatto (Marques et al. 2016), onfaliti e granulomi nei polli. Nei suini, inoltre, è l agente eziologico della malattia degli edemi (Martino et al., 2005). E. coli può causare la colibacillosi negli uccelli, in questi casi i ceppi vengono denominati Avian Pathogenic E. coli (APEC): si tratta di un importante causa di mortalità sia nel pollame allevato che nell avifauna (Diaz-Sanchez et al., 2012). L ingestione orale di E. coli presente nell ambiente e derivato dalle feci difficilmente è sufficiente per lo sviluppo della colibacillosi, solitamente concorrono fattori predisponenti quali stress, scarsa igiene, sovraffollamento, deficienze nutrizionali ed infezioni concomitanti (Zwart, 2008). Oltre alla rilevanza come patogeno, E. coli è una delle specie batteriche che più frequentemente può sviluppare e trasmettere resistenze agli antimicrobici. La tendenza è quella di un aumento delle osservazioni di resistenza da parte di E. coli (Ahmadi et al., 2007). E. coli viene isolato con relativa facilità nelle specie aviarie. Nel pollo soprattutto, E. coli risulta essere l enterobatteriacea più frequentemente isolata. In medicina veterinaria sono numerosi gli studi che indagano la presenza, persistenza ed importanza di E. coli nei broiler, nonchè quelli che ne esaminano la contaminazione derivante. Nello studio di Vasiu et al. (2014), tramite tampone 17

19 cloacale si osserva E. coli con una prevalenza del 68.75%. E. coli è comune anche in altre specie da reddito come l anatra domestica (Cairina moschata, da Silva et al., 2014). Nella realtà urbana, E. coli può essere trasportato e disperso dagli uccelli sinantropi. E. coli è infatti facilmente isolato da specie come il piccione (Columba livia, Askar et al., 2011). Nello studio di Aruji et al. (2004) sono stati effettuati prelievi da cloaca e cieco di 45 corvi (Corvus macrorhynchos) e 33 di questi hanno portato all isolamento di E. coli. Nello stesso studio, i ceppi isolati si sono dimostrati resistenti a penicillina G, vancomicina, eritromicina, lincomicina, bicozamicina e sulfadimetossina. E. coli viene isolato anche da uccelli selvatici a vita libera e può presentare comunque profili di multiresistenza. Nello studio di Giacopello et al. (2016) E. coli è isolato da rapaci (17 su 32), uccelli acquatici (4 su 12) e passeriformi (9 su 11). In questo studio, i profili di resistenza di alcuni ceppi comprendevano contemporaneamente cefotaxime, ceftazidime e ceftriaxone. In relazione alla fauna selvatica migratoria è stato condotto anche uno studio sulla ricerca del solo E. coli che ha evidenziato una prevalenza del 28,8% su 170 campioni (Zullo, 2014). Negli uccelli da gabbia, E. coli è un isolamento che può verificarsi, in particolare nel canarino (Serinus canaria) quando i soggetti non si presentano clinicamente sani. Giacopello et al. (2015) hanno osservato una prevalenza del 35,2% su tutti i ceppi isolati da canarini con sintomatologia clinica. Si segnala infine lo studio di Zakri et al. (2016) che ha portato all isolamento di E. coli a partire da un gruppo eterogeneo di uccelli da gabbia provenienti da un negozio di animali con una prevalenza del 32,96% Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica è un batterio appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae scoperto da Schleifstein e Coleman nel Si tratta di un coccobacillo ovoidale Gram-negativo mobile a temperature inferiori ai 30. È un batterio anaerobio facoltativo asporigeno dotato di flagelli. Essendo classificato come psicrofilo può sopravvivere e proliferare anche a 4 C. Sotto il profilo antigenico Y. enterocolitica possiede un antigene O somatico di natura polisaccaridica, un antigene K capsulare ed un antigene H flagellare. La specie comprende un gruppo di ceppi eterogenei suddivisi per le caratteristiche fenotipiche in 6 biotipi (1A, 1B, 2-5) tra i quali solo 1A non è 18

20 considerato patogeno. La suddivisione in base al sierotipo prende in considerazione l antigene somatico O per il quale sono noti almeno 57 sierotipi. Solo pochi sierotipi sono stati associati a patologie in uomo o animali. La virulenza di Y. enterocolitica è determinata dalla presenza di geni di origine sia plasmidica che cromosomica. Il principale gene associato a ceppi di Y. enterocolitica patogeni è risultato essere ysta (Peruzy et al., 2017). In Europa il principale sierotipo patogeno per numero di isolamenti è O:3, seguito da O:9 mentre negli Stati Uniti si ha un alta prevalenza del sierotipo O:8. Y. enterocolitica è un agente zoonosico la cui principale patologia correlata è una enterocolite solitamente autolimitante. Le lesioni consistono in ascessi localizzati alle placche di Peyer e linfoadenite mesenterica. Sono state osservate complicanze la cui principale è l intussuscezione intestinale (May et al., 2014). Con meno frequenza sono segnalate infezioni extra intestinali, in particolare a carico dell apparato muscolo scheletrico come osteomielite e artrite settica (Chan e Gandhi, 2014). La yersiniosi è considerata una patologia non comune, tuttavia Y. enterocolitica è un microorganismo ubiquitario e spesso la sua presenza non è sottoposta a ricerca in cibo e acqua. Considerando inoltre la diffusone di Y. enterocolitica, è possibile che il rapporto di causa-effetto con le patologie gastrointestinali nell uomo sia sottostimato (Galindo et al., 2011). La yersiniosi è stata osservata in tutti i continenti ma risulta maggiormente diffusa in Europa (Bottone, 1999). Nel 2011, l Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare ha confermato 7017 casi di yersiniosi nell Unione (EFSA, 2011). L infezione da parte di Y. enterocolitica avviene tramite ingestione di alimenti contaminati. È noto come Y. enterocolitica possa contaminare carni di bovino, pollo e suino (Mayrhofer et al., 2004). Nello stesso studio è stato osservato che i ceppi isolati hanno presentato solo raramente resistenza ai farmaci antimicrobici. Y. enterocolitica è stato isolato anche da altri alimenti di origine animale, come le uova. I ceppi isolati da uova da Favier et al. (2005) erano sensibili ad amikacina, ciprofloxacina, cloramfenicolo e sulfametoxazolo. Il latte vaccino può essere contaminato da Y. enterocolitica (Jamali et al., 2015) mentre quello di capra sembra essere meno soggetto a contaminazione (Arnold et al., 2006). Spesso risulta difficile individuare con certezza la fonte contaminante per via della grande varietà di specie che albergano Y. enterocolitica. 19

21 Figura 7: Colonie di Yersinia enterocolitica su endo agar, particolare. Immagine rielaborata da La più frequente causa di yersiniosi nell uomo a livello mondiale è il sierotipo enteropatogeno O:3. Il reservoir di questo sierotipo è il suino che rappresenta la principale fonte causale di patologie dovute da Y. enterocolitica nell uomo (Valentin-Weigand et al., 2014). In particolare Y. enterocolitica può giungere all uomo tramite carni suine poco cotte. Contaminazioni modeste o minime possono rappresentare comunque un rischio essendo Y. enterocolitica in grado di replicare a temperature di refrigerazione. La contaminazione fecale può originare inoltre da ovini e bovini (McNally et al., 2004). Risulta rilevante la presenza di Y. enterocolitica anche in topi (Mus musculus, Pocock et al., 2001) e ratti (Rattus norvegicus, Rouffaer et al., 2017): sebbene non sempre gli isolamenti evidenzino ceppi enteropatogeni è indubbio che la presenza di queste specie negli allevamenti e nei macelli costituisca un rischio potenziale. Per quanto riguarda gli uccelli, la presenza di Y. enterocolitica è stata individuata in molte specie differenti. Pohjola et al. (2016) hanno svolto una ricerca su 51 allevamenti rurali di polli in Finlandia, Y. enterocolitica è stato isolato ma nessun ceppo è risultato essere enteropatogeno. Motallebi et al. (2000) hanno invece isolato alcuni ceppi di Y. enterocolitica da polli che si sono dimostrati virulenti in seguito ad infezione sperimentale nel topo. Y. enterocolitica è stato isolato anche in altre specie aviarie d allevamento. Jamali et al. (2014) hanno condotto una ricerca su un gruppo di animali composto da 291 anatre e 180 oche, isolando Yersinia spp. nel 12.3% dei casi. 20

22 Si è osservata una prevalenza simile in isolamenti da materiale fecale di uccelli selvatici migratori in Svezia. Niskanen et al. (2003) hanno isolato Yersinia spp. con una percentuale del 12.8% su 468 campioni da 57 specie differenti. Il 5.6% dei campioni conteneva Y. enterocolitica e in particolare 10 ceppi appartenevano al sierotipo O:3 enteropatogeno. Trattandosi di specie migratrici è stato dunque dimostrata anche la possibilità di trasporto sulla lunga distanza di ceppi patogeni da parte degli uccelli. Levrè et al. (1989) hanno condotto uno studio simile su un gruppo di uccelli selvatici comprendente sia specie stanziali che migratrici. Yersinia spp. è stato isolato da 26 soggetti su 217 (11.98%) per un totale di 37 ceppi batterici. 28 ceppi sono risultati appartenere a Y. enterocolitica. La prevalenza di Y. enterocolitica rispetto alle altre specie del genere Yersinia è stata osservata anche nella passera scopaiola (Prunella modularis) da Kiskova et al. (2011). Alla sola specie Y. enterocolitica appartenevano il 47.4% dei ceppi di Yersina spp. isolati. Nello stesso studio è stato osservato un aumento della prevalenza nei mesi primaverili e che la presenza di Y. enterocolitica non ha alterato i parametri biometrici, suggerendo che Y. enterocolitica è fisiologicamente parte del microbioma intestinale della specie. Kato et al. (1985) hanno isolato direttamente Y. enterocolitica da 9 specie di uccelli per un totale si 500 soggetti osservando una prevalenza del 6,8%. In relazione alla presenza di Y. enterocolitica in uccelli da gabbia sono stati condotti pochissimi studi. Si segnala il primo isolamento in Inghilterra di Y. enterocolitica da un gruppo di cocorite (Melopsittacus undulatus) da parte di Giles e Carter (1980). In questo caso l isolamento è stato condotto post mortem da 8 esemplari su 25 deceduti. Gli isolamenti sono stati ottenuti da polmoni, intestino e fegato Citrobacter freundii Citrobacter freundii, scoperto da Werkman e Gillen nel 1932, è un batterio anaerobio facoltativo di forma bastoncellare e negativo alla colorazione di Gram. Appartiene alla famiglia delle enterobatteriacee e nonostante la presenza di flagelli alcuni ceppi risultano immobili. C. freundii può colonizzare sia l ambiente che l intestino di uomo e diverse specie animali. Poche indagini sono state condotte sul genoma di C. freundii, si è però osservata una grande variabilità fenotipica. La maggior parte dei ceppi di questa specie non sono considerati patogeni. 21

23 Figura 8: Colonie di Citrobacter freundii lattosio fermantanti su agar MacConkey, particolare. Immagine rielaborata da Alcuni ceppi di C. freundii sono stati responsabili di infezioni opportunistiche nosocomiali in pazienti immunocompromessi, principalmente bambini. Le infezioni principali sono state individuate a carico del tratto urinario dove C. freundii rappresenta la specie più frequentemente isolata all interno del genere (Gill et al., 1999). Le infezioni da C. freundii possono colpire raramente anche il tratto respiratorio e altri distretti anatomici normalmente sterili nell uomo. Nonostante la bassa incidenza però, il trattamento di queste patologie risulta complesso per via dell innata resistenza del batterio (Gursu et al., 2011). Più in generale, all interno di Citrobacter spp., si osserva un particolare tropismo per il sistema nervoso centrale che può portare alla formazione di ascessi (Plakkal et al., 2013) C. freundii si isola comunemente dal terreno dove ha rilevanza nel ciclo dell azoto riducendo nitrati in nitriti nell ambiente. Può contaminare cibo e acqua, in particolare ne è stata osservata la presenza su carni di pollo e bovino crude (Gwida et al., 2014) e su uova (Stepień-Pyśniak, 2010). Nello studio di Hofacre et al. (2001) C. freundii viene elencato tra le specie batteriche isolate da alimenti di origine animale che con maggior frequenza hanno presentato resistenza a farmaci antimicrobici. Nelle specie aviarie l isolamento di C. freundii da intestino, cloaca o materiale fecale risulta documentato più volte. Nelle specie domestiche viene segnalato in pollo e anatra (Anas platyrhynchos) da Liao et al. (2015). Altri isolamenti da materiale fecale di anatra attestano la presenza di Citrobacter spp. nel 5% dei campioni (Murugayan et al., 2015). 22

24 C. freundii è stato isolato anche da specie sinantropi. Nello studio di Yong et al. (2008) C. freundii è elencato tra le principali enterobatteriacee isolate da feci di corvo (Corvus macrorhynchos). Tramite tamponi cloacali da nidiacei di gabbiano del Caspio (Larus cachinnans) sono stati isolati numerosi ceppi di Citrobacter spp. con spiccata resistenza per il sulfametoxazolo associato a trimethoprim. Lo studio è stato condotto in Italia da Gionechetti et al. (2008). La presenza di C. freundii è stata verificata anche nel piccione (Columba livia, Liao et al., 2015). La presenza di C. freundii è stata osservata anche in altre specie selvatiche. Giacopello et al. (2016) hanno isolato C. freundii nel 16.4% degli isolamenti da 55 uccelli. Il gruppo comprendeva specie appartenenti agli ordini Falconiformes, Accipitriformes, Strigiformes, Charadriliformes, Ciconiiformes e Passeriformes. Isolando enterobatteriacee da uccelli rapaci, Rouffaer et al. (2014) hanno osservato una prevalenza del 12% per C. freundii. Prevalenze sovrapponibili alle precedenti si ritrovano in uno studio condotto su 89 uccelli marini selvatici dove C. freundii è stato isolato nel 15,13% dei soggetti (Steele et al., 2005). In relazione agli uccelli da gabbia, in letteratura gli studi su C. freundii sono pochi, tuttavia Hellmann et al. (1985) affermano che C. freundii è una delle enterobatteriacee più comunemente isolate da feci di uccelli detenuti in negozi di animali. Le principali specie su cui è stata condotta l indagine sono: il parrocchetto ondulato (Melopsittacus undulatus), il ciuffolotto (Pyrrhula pyrrhula) e l astrilde (Estrilda astrild). L autore suggerisce l ipotesi che il grande numero di enterobatteriacee osservate possa essere correlato alle condizioni di detenzione poco idonee come quelle che si possono ritrovare nei negozi di animali Salmonella spp. Salmonella spp. comprende specie di enterobatteri bastoncellari anaerobi facoltativi dotate di flagelli peritrichi e per la maggior parte mobili. Il genere Salmonella è stata scoperta da un assistente di Daniel Elmer Salmon, medico veterinario, nel La struttura antigenica di Salmonella spp. è complessa per via della presenza di una doppia fase all interno dei gruppi antigenici flagellari H. Nello stesso sierotipo, infatti, possono assumere due forme alternative. Sono inoltre presenti antigeni somatici O e, per alcune sierovarianti, capsulari di superficie Vi (Martino et al., 2005). Le due principali specie di Salmonella spp. sono Salmonella bongori e Salmonella enterica. Quest ultima 23

25 specie è suddivisa in 6 sottospecie che comprendono oltre 2400 sierotipi. La maggior parte delle sierovarianti di Salmonella spp. di interesse clinico rientrano in S. enterica subsp. enterica (Rubino et al., 2017). Nell uomo Salmonella spp. può causare diverse forme di gastroenterite dalla gravità variabile. Il sierotipo typhi di S. enterica subsp. enterica è l agente eziologico della febbre tifoide. Le fonti di contagio sono rappresentate dall ingestione di alimenti contaminati, secondariamente anche dal contatto con soggetti portatori. Salmonella spp. alberga infatti nell apparato gastroenterico di mammiferi, rettili, uccelli e uomo (Martino et al., 2005). In patologia aviare, le malattie causate da S. enterica subsp. enterica sono descritte e classificate soprattutto nelle specie avicole. La pullorosi è una malattia acuta sistemica che colpisce i pulcini nelle prime 2-3 settimane di vita, l agente eziologico è S. pullorum. La tifosi è una malattia setticemica ad andamento acuto o cronico che colpisce polli e tacchini adulti, è causata da S. gallinarum. La paratifosi infine, è causata da vari sierotipi di Salmonella spp. che possono infettare una grande varietà di ospiti oltre agli avicoli. La paratifosi causa un aumento della mortalità, soprattutto se l infezione coinvolge le uova (Gast, 2001). L infezione di sierovarianti paratifoidi può essere asintomatica negli avicoli adulti, i quali rappresentano uno dei principali reservoir di Salmonella spp. per la trasmissione all uomo (Chousalkar e Gole, 2016). Più in generale, Salmonella spp. viene isolato dall intestino di specie avicole in diversi studi. Chang (2000) ad esempio, isola Salmonella spp. da broiler da carne con una prevalenza del 25,9%. I sierotipi osservati sono stati enteritidis, virchow e virginia e ogni ceppo isolato ha presentato resistenza multipla agli antimicrobici. Per via della patogenicità del genere, Salmonella spp. viene studiato anche nell ambiente urbano. In questa realtà, piccioni (Columba livia) costituiscono uno dei principali reservoir e la presenza delle loro feci nell ambiente è fonte di contaminazione, soprattutto delle riserve d acqua (Krampitz e Hollander, 1999). Salmonella spp. viene isolato anche in uccelli selvatici che possono dunque avere un ruolo nella diffusione di ceppi patogeni. In uno studio condotto su 94 quaglie migratrici (Coturnix coturnix) sane, Salmonella spp. è stato isolato nel 24.4% dei campioni (Youssef e Mansour, 2014). Sono tuttavia 24

26 descritte anche prevalenze molto più basse. Giacopello et al. (2016) isolano da 55 tamponi cloacali effettuati su un gruppo misto di uccelli selvatici 2 ceppi di S. thyphimurium e 1 di S. duesseldorf. Nelle specie di passeriformi e psittaciformi da gabbia, Salmonella spp. può causare gravi infezioni, soprattutto in situazioni di nutrizione insufficiente e sovraffollamento in presenza di clima freddo e umido (Zwart, 2008). Salmonella spp. viene tuttavia osservato anche in soggetti asintomatici. Zakri et al. (2016) isolano Salmonella spp. con una prevalenza del 7.82% da un gruppo eterogeneo di specie aviarie campionate in un negozio di animali, da un totale di 117 soggetti Proteus spp. Proteus spp. comprende specie di batteri Gram-negativi a bastoncello. I batteri appartenenti a questo genere sono asporigeni e mobili grazie ai numerosi flagelli. Questa caratteristica li distingue macroscopicamente in coltura su piastra dove le colonie crescono a tipici sciami. Osservando la mobilità di Proteus spp. sulle superfici solide, Huser lo descrisse per primo nel Attualmente il genere si suddivide tra Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri e Proteus hauseri. A questi si aggiungono tre genotipi ancora senza nome (numero 4,5 e 6) per un totale di 80 possibili antigeni O all interno del genere. Proteus spp. è isolato da intestini di diversi animali domestici e selvatici. Quando presente in terreno ed acqua è utilizzato come indicatore di contaminazione fecale. Uno dei rischi principali consiste nella contaminazione da parte di ceppi resistenti agli antibiotici provenienti da intestini di soggetti trattati (Drzewieeka, 2016). Proteus spp. è noto per essere un patogeno opportunista nell uomo ed è frequentemente isolato da infezioni urinarie e ferite contaminate. La mobilità che caratterizza P. mirabilis è direttamente collegata alla predisposizione per le infezioni a carico del tratto urinario. Inoltre, P. mirabilis può avvalersi di altri caratteri di virulenza per questo tipo di infezione, quali l enzima ureasi, fimbrie, adesine, proteasi e la possibilità di creare biofilm (Schaffer e Pearson, 2015). Anche negli animali da compagnia Proteus spp. è spesso responsabile di infezioni urinarie. Marques et al., (2016) hanno condotto uno studio multicentrico a livello europeo sulle infezioni urinarie di cani e gatti (16 laboratori da 14 paesi). Proteus spp. è stato confermato essere uno degli isolamenti più comuni. In particolare a riguardo si segnala una crescente resistenza verso i fluorchinoloni. Proteus spp. viene isolato inoltre da latte proveniente da bovine affette da mastite subclinica (Das et al., 2017). Anche 25

27 in medicina aviare Proteus spp. può essere responsabile di infezioni ascendenti, nello studio di Dadeech et al. (2015) viene descritta una salpingite da P. mirabilis in alcune galline ovaiole. In questo studio i ceppi isolati hanno mostrato particolare resistenza alle tetracicline. Nella maggioranza degli studi pubblicati dove viene isolato Proteus spp. in relazione alle specie aviarie, questo viene trovato nell intestino. Vasiu et al. (2014) isolano Proteus spp dalla cloaca di broiler da carne con una prevalenza del 18.75%. Nello stesso studio, Proteus spp. viene rilevato sulle superfici delle strutture dell allevamento anche dopo disinfezione con prodotti a largo spettro. Anche in altre specie d allevamento viene osservata la presenza di Proteus spp. come commensale intestinale. Ceppi di Proteus spp. isolati da quaglie d allevamento (Coturnix coturnix) sane si sono rivelati patogeni in animali da laboratorio sottoposti ad infezione sperimentale (Tatarenko et al., 2016). Proteus spp. sembra essere una delle enterobatteriacee più frequentemente isolate anche dalle anatre domestiche (Cairina moschata, Da Silva et al., 2014). Proteus spp. viene osservato anche in animali sinantropi. Nel corvo (Corvus macrorhynchos) viene isolato in diversi studi (Aruji et al., 2004; Yong et al., 2008). Nello studio sul gabbiano del Caspio (Larus cachinnans) svolto da Gionechetti et al. (2008) Proteus spp. viene isolato da tempone cloacale e sottoposto ad antibiogramma. Si sono osservate spiccate resistenze verso sulfametoxazolo/trimethoprim e cloramfenicolo. Viene formulata l ipotesi che, per via delle abitudini alimentari e della capacità di spostarsi per lunghe distanze, il gabbiano possa essere diffusore di ceppi batterici resistenti tra le aree urbane. La presenza di Proteus spp. viene segnalata anche nell intestino di specie aviarie selvatiche. Nello studio di Youssef e Mansour (2014) viene indagato il ruolo della quaglia comune (Coturnix coturnix) allo stato selvatico come potenziale agente di diffusione di patogeni zoonotici. Gli isolamenti sono stati condotti direttamente dall intestino di animali cacciati e Proteus spp. viene isolato nel 7.4% dei campioni. La prevalenza sembra essere più alta nei rapaci: uno studio analogo condotto sull avvoltoio collorosso (Cathartes aura) la prevalenza è stata del 50% in isolamenti da intestino (Winsor et al., 1981). 26

28 Nonostante gli studi sugli uccelli da gabbia non siano numerosi, Proteus spp. viene segnalato anche nel canarino (Serinus canaria) da campione fecale. In particolare sembra che la prevalenza sia più che occasionale quando si tratta di animali non perfettamente sani (Giacopello et al., 2015) Shigella spp. Il genere Shigella comprende specie batteriche bastoncellari Gram-negative che risultano essere anaerobie facoltative, immobili e asporigene. La prima specie appartenente a Shigella spp. ad essere scoperta è stata Shigella dysenteriae nel 1897 da Kyoshi Shiga durante un epidemia di diarrea in Giappone. La corrente classificazione sierologica distingue altre 3 specie, in ordine cronologico di scoperta sono: Shigella flexneri, Shigella sonnei e Shigella boydii. Sono stati distinti 15 sierotipi di S. dysenteriae, 19 di S. flexneri, 20 di S. boydii e un singolo sierotipo per S. sonnei. Shigella spp. condivide buona parte del genoma con Escherichia coli, sono infatti correlati dal punto di vista evolutivo. Shigella spp. è responsabile della dissenteria bacillare o shigellosi nell uomo. L infezione avviene per contatto diretto con persone infette o tramite cibo e acqua contaminati. Caratteristica tipica di Shigella spp. è la possibilità di poter causare patologia anche con cariche infettanti molto basse, pari a poche centinaia di microorganismi vitali (Gaurav et al., 2013). S. flexneri è la principale causa di dissenteria bacillare nei paesi in via di sviluppo (60% dei casi), mentre Europa e nord America il patogeno più frequentemente isolato è S. sonni, nell 80% dei casi (The et al., 2016). Shigella spp. colonizza la mucosa intestinale penetrando nelle cellule dell epitelio, soprattutto del colon. Il risultato è la degradazione dell epitelio stesso che porta ad una colite acuta con profusa diarrea mucosa e concomitante perdita di sangue. L escrezione massima corrisponde al picco sintomatico, questa caratteristica unita alla possibilità di contaminare cibo e acqua anche tramite insetti, fanno di Shigella spp. un agente di primo rilievo nelle infezioni alimentari (Gaurav et al. 2013). Sempre secondo Gaurav, la sensibilità di Shigella spp. ai più comuni ed economici antibiotici sta calando negli ultimi anni, ostacolando così la scelta del trattamento la shigellosi. 27

29 Figura 9: Isolamento di Shigella spp. su agar MacConkey (Archivio personale) Shigella spp. è stato rinvenuto nell intestino di uccelli sani in diversi studi ma può causare patologia anche tra questi. La shigellosi è stata documentata per la prima volta nel 2004 nei polli (Xu et al. 2004). Successivamente è stato confermato che particolari ceppi di S. flexneri posso portare a infezione primaria della mucosa intestinale del pollo in vivo (Shi et al., 2014). I risultati di questo studio suggeriscono che i ceppi di Shigella spp. isolati da uomo e pollo hanno patogenicità simile e la possibilità di infezione crociata è di rilevanza per la sanità pubblica. La maggior parte della letteratura riporta però la presenza di ceppi di Shigella spp. commensali nel tratto gastroenterico delle specie aviarie. Blajman et al. (2017) studiando la modulazione del microbioma intestinale del pollo hanno osservato principalmente Shigella spp. come enterobatteriacea commensale insieme a E.coli. Lo stesso è stato osservato da Oklaey et al. (2013) nel cui studio la presenza di Shigella spp. è costante tra i campioni. Nello studio di Abo-Amer e Shobrak (2015) sono stati isolati ceppi di S. dysenteriae da un gruppo di 21 specie aviarie domestiche. Sono stati eseguiti tamponi cloacali da pollo, piccione, anatra e quaglia e Shigella spp. è stato isolato dal 18% degli animali. In questo studio, 15 ceppi di S. dysenteriae sono risultati essere multi resistenti a farmaci antimicrobici. In uno studio condotto tramite tampone cloacale su 215 piccioni si è isolato Shigella spp. nel 7% dei casi (Askar et al., 2011). Si è osservata la presenza di Shigella spp. anche in altre specie sinantropi, come i gabbiani (Larus spp). Karaguzel et al. (1993) hanno isolato ceppi di S. sonni da un gruppo di 28

30 616 campioni fecali. La prevalenza osservata fu dello 0.60%: tutti i campioni positivi provenivano da zone dove venivano concentrati liquami di scarico dalle città. Shigella spp. è stato osservato anche nell avifauna selvatica a vita libera. Shigella spp. è stato infatti isolato da campioni fecali di marabù africano (Leptoptilos crumeniferus, Nyakundi e Mwangi, 2011) e da campioni cloacali per la raccolta del seme in rondini arboricole bicolore (Trachycineta bicolor, Lombardo e Thorpe, 2000). Per quanto riguarda gli uccelli da gabbia, non sono stati condotti molti studi. Viene tuttavia segnalato un recente studio in cui si è isolato Shigella spp. da 10 campioni fecali da un gruppo misto di 117 uccelli presso un negozio di animali (Zakri et al., 2016) Serratia spp. Serratia spp. è un genere di batteri Gram-negativi anaerobi facoltativi mobili. Sono dei bastoncelli che in alcuni casi possono formare endospore. La principale specie, scoperta nel 1823 da Bizio e conosciuta soprattutto come causa di infezioni nosocomiali, è Serratia marcescens. Sono note altre specie appartenenti a questo genere, si segnalano Serratia plymuthica, Serratia liquefaciens, Serratia rubidaea Serratia odoriferae, Serratia ficari, Serratia quinivorans, Serratia grimesii e Serratia fonticola come occasionali agenti di infezione per l uomo alternativi a S. marcescens (Mahlen, 2011). Il genere Serratia è conosciuto per la capacità di produrre una grande varietà di enzimi extracellulari, i quali sono parte integrante delle sue strategie di sopravvivenza nei diversi ambienti. Può colonizzare infatti diversi ambienti come acqua, suolo e tratti digerenti di diverse specie animali (Petersen et al., 2013). S. marcescens è stato individuato come causa di diverse infezioni opportunistiche nell uomo, come setticemia, polmonite, cheratite, endocardite, infezioni del tratto urinario, meningite e fascite necrotizzante. Sono numerose le caratteristiche del ceppo infettante che possono portare a patologia, contribuiscono infatti fattori di proteasi, emolisi e adesione (Petersen et al., 2013). Serratia spp. è stata isolato da diverse fonti alimentari di origine animale. Schwaiger et al. (2012) isolano Serratia spp. da carne di pollo e suino, in particolare la prevalenza maggiore è stata osservata in carni vendute al banco, deducono infatti che la contaminazione sia di origine ambientale. I ceppi 29

31 analizzati da questo studio hanno mostrato buona sensibilità agli antibiotici. Coton et al. (2012) isolano Serratia spp. da forme di formaggio, sia dalla superficie che dal centro. In questo caso Serratia spp. è risultato essere tra i generi che hanno presentato maggior resistenza agli antimicrobici. Serratia spp. è stato osservato anche nel latte crudo, S. marcescens è stata una delle principali specie di enterobatteriacee osservate nello studio di Ercolini et al. (2009). Figura 10: Isolamento di Serratia spp. su agar MacConkey (Archivio personale). Anche in medicina veterinaria S. marcescens può rivelarsi un agente eziologico. Nel bovino molti studi identificano S. marcescens come causa di mastite (Pinzon-Sanchez e Ruegg, 2011; Ruegg et al., 1992) e in alcuni casi questo tipo di infezione ha presentato resistenza agli antibiotici (Kurjogi et al., 2011). Nel cavallo Serratia spp. è stato osservato in diverse infezioni miste, probabilmente nosocomiali (Colahan et al., 1984). Serratia spp. è risultato sporadicamente patogeno anche in alcune specie di uccelli. Si riporta un caso in cui l infezione da S. marcescens ha portato a morte un colibrì codadirondine (Eupetomena macroura, Saidenberg et al., 2007). S. liquefaciens è stato osservato come patogeno opportunista nell aspergillosi polmonare dei pappagalli (Simpson ed Euden, 1991). In letteratura Serratia spp. viene citato più volte come isolamento da specie aviarie asintomatiche. Nello studio di Rogers (2006) da 243 campioni fecali di uccelli selvatici catturati presso allevamenti bovini, Serratia spp. è stata isolato nel 7% dei casi. Il gruppo di specie comprendeva il passero domestico (Passer domesticus), il passero corona bianca (Zonotrichia leucophrys), il merlo di Brewer 30

32 (Euphagus cyanocephalus), il merlo ad ali rosse (Agelaius phoeniceus) e il vaccaro testabruna (Molothrus ater). Serratia spp. è stato isolato anche da feci di sula mascherata (Sula dactylatra) e berta di Christmas (Puffinus nativitatis) nell isola di Pasqua (Ardiles-Villegas et al., 2011). Nonostante l area di studio fosse particolarmente isolata, due ceppi di S. odorifera presentavano il profilo enzimatico ESBL (extended-spectrum beta-lactamase) e dunque geni di resistenza a farmaci antimicrobici. Vaz et al. (2017) isolano da un gruppo di 22 pappagalli amazzoni codarossa (Amazona brasiliensis) S. liquefaciens dal 13% dei tamponi cloacali prelevati. Una prevalenza simile è stata osservata da Murugayan et al. (2015) su 175 campioni fecali freschi di anatra dove Serratia spp. è stato isolato nell 11% dei casi. Serratia spp. è stato isolato anche da campioni fecali di uccelli rapaci in cattività (Bangert et al., 1988). Alcaraz et al. (2016) hanno condotto uno studio sul microbioma fecale della calopsitta (Nymphicus hollandicus), comune specie considerata da compagnia. Nello studio si sottolinea come Serratia spp. sia frequentemente osservato nel microbioma fecale di questa specie e di come questo possa costituire un rischio potenziale per via della patogenicità del batterio. 31

33 2.3 Introduzione all antibiotico resistenza Cenni storici sullo sviluppo degli antimicrobici La scoperta dell antibiotico viene convenzionalmente fissata nel 1928, quando Alexander Fleming si accorse per puro caso che le colture di Penicillium erano in grado di inibire la crescita di Staphylococcus spp. sulle piastre del suo laboratorio (Fleming, 1929). Sono tuttavia riportati numerosi esempi di utilizzo di muffe o piante per contrastare le infezioni batteriche già nelle antiche culture greca, egiziana e cinese. In nessun caso però si era a conoscenza di quale fosse il principio attivo e, ovviamente, nessuno era mai stato in grado di isolarlo. Il primato di Fleming sta soprattutto nell aver identificato, isolato e reso disponibile nel 1942 il principio attivo della penicillina con l aiuto di Ernst Chain e Howard Walter Florey. A questo i tre scienziati devono il premio Nobel per la medicina del 1945 (Arseculeratne e Arseculeratne, 2016). Se per antibiotico si intende, in senso stretto, una sostanza prodotta da un microorganismo capace di ucciderne altri, si definiscono diversamente le sostanze di sintesi, i chemioterapici. Il primo chemioterapico in commercio fu il Prontosil già nel Si trattava di un colorante appartenente alla classe dei sulfamidici studiato da Gerhard Domagk. Il Prontosil non è altro che un precursore della solfanilammide, il farmaco vero e proprio liberato dopo la bioattivazione nell organismo del paziente (Aminov, 2010). I sulfamidici furono quindi la prima classe di farmaci antimicrobici ad essere disponibile in commercio. Con l introduzione di questi nuovi farmaci, in pochi anni si assistette ad un drastico calo di morbilità e mortalità per le infezioni batteriche. Precedentemente, meno di un secolo fa, era possibile morire per patologie che oggi non destano particolare preoccupazione. Di pari passo con questo drastico cambiamento dell epidemiologia a livello mondiale, vi era la scoperta e la commercializzazione di nuove classi di farmaci antimicrobici. Negli anni che vanno dal 1950 al 1960 sono stati scoperti circa metà degli antibiotici oggi disponibili, questa viene infatti da molti definita la Golden era (Davies e Davies, 2010). Tra il 1940 e il 1962 sono state scoperte più di 20 nuove classi di antibiotici. Da allora tuttavia, solo due nuove classi hanno raggiunto il mercato. Lo sviluppo di nuovi farmaci analoghi ad altri 32

34 esistenti ha tenuto il passo con lo sviluppo dell antibiotico resistenza fino a circa 20 anni fa. Al giorno d oggi, la frequenza di immissione sul mercato di nuovi farmaci antimicrobici non tiene il passo rispetto allo sviluppo di resistenze, in particolare dei batteri Gram-negativi (Coates et al., 2011). Oggi i farmaci antimicrobici sono di fondamentale importanza come risorsa principale per contrastare le patologie infettive batteriche. Il loro valore va oltre quello commerciale e spesso alle buone intenzioni per un corretto utilizzo non corrispondono altrettante azioni. Considerando le crescenti scoperte sui meccanismi di resistenza e sui relativi reservoir, è possibile anche iniziare a prevedere il fenomeno. Un utilizzo consapevole è essenziale per le prossime generazioni (Davies e Davies, 2010). Figura 11: Evoluzione dell'antibiotico resistenza. Da Davies et al. (2010) Resistenza agli antimicrobici La resistenza agli antimicrobici è la capacità dei batteri di sopravvivere all azione di tali sostanze ed è distinta in naturale ed acquisita. La resistenza naturale deriva dalla innata mancanza da parte del microorganismo delle strutture o dei processi biologici bersaglio su cui agiscono gli antimicrobici. La resistenza naturale è uno dei primi fattori che sono presi in considerazione per la scelta di una molecola adatta per un trattamento. La resistenza acquisita è invece un fenomeno che si verifica 33

35 grazie a diversi meccanismi su base genetica e possono interessare sia il genoma cromosomico che extra-cromosomico. Le modifiche al patrimonio genetico ottenute tramite questi meccanismi possono permettere al batterio che le subisce di acquisire nuove resistenze che vanno a sommarsi a quelle naturali (Russo e Turin, 2005). Come per qualsiasi popolazione di esseri viventi, il principio della selezione (naturale o artificiale) può essere applicato anche ai batteri. Quando si interviene su una popolazione batterica con un antimicrobico naturalmente efficace, questo può selezionare ceppi che per variabilità genetica sono in grado di restare vivi, vitali e talora infettanti anche dopo il contatto con la sostanza. I ceppi resistenti sono quindi in grado di moltiplicarsi senza competizione. Su scala maggiore, il diffondersi dei ceppi resistenti può farli divenire i principali rappresentanti di una determinata specie batterica, con la conseguenza che le infezioni da essa derivate abbiano meno opzioni di trattamento. L antibiotico resistenza, infatti, è una conseguenza inevitabile in termini di adattamento evolutivo delle specie microbiche (Silbergeld et al., 2008). Di crescente rilevanza soprattutto negli ultimi anni, il problema dell antibiotico resistenza è stato classificato al pari del surriscaldamento climatico per via dell impatto che ha sull umanità (Nolte, 2014). La diffusione che l antibiotico resistenza ha nel mondo è dovuta al largo uso dei farmaci antimicrobici unitamente all enorme traffico di merci e persone che è sempre più intenso. Si stima che a questo fenomeno possano essere dovute fino a morti l anno in tutto il mondo (O Neill e Mossialos, 2016). Per decenni, una grande varietà di farmaci antimicrobici non sono stati usati solo a fini terapeutici, ma anche per profilassi, soprattutto nel settore zootecnico ed agrario. Questo tipo di situazione ha portato rapidamente alla selezione ed alla diffusione di ceppi batterici che risultano resistenti alle sostanze antimicrobiche più comuni e non solo, dato che uso ed abuso di antimicrobici porta ad un prevalente sviluppo di ceppi batterici resistenti sia tra specie patogene che commensali (Silbergeld et al., 2008). Una delle principali cause dell antibiotico resistenza è infatti un utilizzo non ponderato e corretto degli stessi, come ad esempio un trattamento della durata o dalle dosi insufficienti (Chopra et al., 2002). Una lunga lista di infezioni, tra cui polmoniti, tubercolosi e gonorrea stanno diventando sempre più difficili da curare per via dell efficacia sempre minore degli antibiotici (Zaman et al., 2017). 34

36 In ambito veterinario, la diffusione dell antibiotico resistenza rende più complesso il controllo delle patologie infettive degli animali ma soprattutto accresce il rischio che batteri resistenti possano essere trasmessi all uomo. Questo può avvenire direttamente tramite contatto diretto con animali e alimenti da loro derivati o indirettamente, attraverso più complessi cicli ambientali. In questo modo, resistenze acquisite dai batteri in seguito a trattamenti sulle diverse specie animali possono arrivare all uomo. Il concetto di One Health è più che mai calzante poiché le precauzioni per contrastare il fenomeno dell antibiotico resistenza possono essere efficaci solo se sono prese sia in medicina umana che veterinaria. L antibiotico resistenza è un problema di salute pubblica molto attuale e l Organizzazione Mondiale della Sanità è parte attiva nel monitorare e nell arginare il fenomeno con continue raccomandazioni. Tuttavia, gli studi sono concordi sulla costante crescita del fenomeno. Vi sono ancora grosse limitazioni tecniche che impediscono un controllo capillare in tutto il mondo, nei paesi in via di sviluppo ad esempio, quasi tutti gli antibiotici sono disponibili senza la necessità di alcuna ricetta (Zaman et al., 2017). Il raggiungimento di risultati importanti nella lotta al fenomeno della resistenza agli antimicrobici non può prescindere dall informazione e dalla sensibilizzazione dell opinione pubblica. Grazie alla sempre maggiore facilità nello scambio di informazioni, la maggior parte delle persone sembra essere al corrente del rischio, tuttavia non sembra che questo porti ad azioni concrete nella riduzione dell utilizzo degli antimicrobici (Grigoryan et al., 2007). Va considerato infine che il problema della resistenza antimicrobica è anche di carattere economico e l impatto è dovuto al costo aggiuntivo per i trattamenti, a procedure più costose, a degenze più lunghe e a eventuali invalidità (Nolte, 2014) Meccanismi di acquisizione e trasmissione della resistenza Un meccanismo fondamentale per cui un organismo batterico acquisisce una resistenza che naturalmente non avrebbe è la mutazione. Le mutazioni sono alterazioni del genotipo di un organismo dovute a modificazioni ereditabili della sequenza nucleotidica di DNA (Russo e Turin, 2005). Queste modifiche sono casuali e perciò l esito può essere vantaggioso, svantaggioso o nullo per l organismo che muta. In un contesto naturale, la capacità di resistere ai farmaci antimicrobici può essere naturalmente presente in alcuni dei miliardi di microorganismi di una popolazione, sempre secondo il principio della casualità (Hughes e Andersson, 2017). In questo contesto tuttavia, l antibiotico resistenza non necessariamente rappresenta un vantaggio per la sopravvivenza di questi particolari organismi. Più in generale, in ambiente naturale, una qualsiasi mutazione risulta 35

37 rilevante quando interviene una pressione selettiva favorevole. Ne consegue che quando una popolazione entra in contatto con una sostanza antimicrobica, eventuali resistenze risultano essere l unica determinante della sopravvivenza e permettendo solo ai microorganismi mutati di tramandare i propri geni. Altre modifiche al DNA cromosomico si hanno con la ricombinazione che è definita come l incorporazione stabile di nuovi geni nel cromosoma. Questi geni possono provenire dal genoma di un'altra cellula batterica o da DNA extra-cromosomico (Russo e Turin, 2005). Vengono di seguito descritte le tre principali modalità di trasferimento di materiale genetico tra batteri donatori e riceventi: trasduzione, trasformazione e coniugazione. Il trasferimento per trasduzione coinvolge virus batteriofagi. I fagi sono virus capaci di infettare e penetrare all interno di determinati batteri di cui sfruttano l apparato biosintetico per replicarsi. La lisi batterica che porta a completamento il ciclo libera i virioni precedentemente formati a spese della cellula ospite. La trasduzione ha origine durante la replicazione del fago, quando il DNA della cellula batterica ospite viene frammentato. Alcuni di questi frammenti di DNA batterico possono accidentalmente essere incorporati nel DNA dei nuovi fagi che divengono difettivi, poiché non contengono tutte le informazioni necessarie per un ciclo replicativo completo. Un fago trasducente può dunque trasportare ad una cellula batterica materiale genetico proveniente da un altro organismo, se i ceppi batterici sono correlati. Questi geni possono essere potenzialmente anche quelli codificanti per la resistenza agli antimicrobici. Questo fenomeno è di grande importanza soprattutto per i batteri Gram-negativi (Russo e Turin, 2005). Anche la trasformazione è un fenomeno che può avvenire soltanto tra batteri appartenenti allo stesso ceppo. Consiste nel trasferimento di DNA nudo, recante eventualmente geni di resistenza, da una cellula donatrice ad una ricevente che è in grado di adsorbire DNA libero in ambiente. La ricombinazione avviene solo nel caso in cui il materiale sia omologo, tuttavia geni plasmidici possono essere espressi senza ricombinazione (Russo e Turin, 2005). Alcuni batteri hanno la capacità di unirsi ad altri batteri per trasferire materiale genetico attraverso una particolare struttura anatomica chiamata sex pilus. Durante questo fenomeno, chiamato coniugazione, vi è il trasferimento di porzioni di DNA da parte di una cellula donatrice ad una 36

38 ricevente. La cellula donatrice è dotata di un fattore F che codifica per la sintesi del sex pilus. Se il fattore F è libero nel citoplasma sotto forma di plasmide questo viene trasferito con la coniugazione dopo replicazione, in questo modo la cellula ricevente ottiene la facoltà di coniugarsi attivamente. Il plasmide F può anche contenere geni di resistenza, che sono quindi trasmessi con la coniugazione. Se il fattore F è incluso nel cromosoma del donatore, questo trasferirà alle cellule riceventi parti del suo DNA cromosomico che una volta a destinazione può ricombinarsi. In questo tipo di coniugazione difficilmente viene trasmesso anche il fattore F. Un fattore F integrato nel cromosoma può essere escisso e portare con sé frammenti di DNA cromosomico nel divenire plasmide. Questo spiega come i plasmidi possano contenere geni aggiuntivi oltre a quelli per la sintesi del sex pilus (Russo e Turin, 2005). Figura 12: Coniugazione in microscopia elettronica. Courtesy Charles C. Brinton Jr. da Oltre al fattore F, esistono altri tipi di plasmidi che possono essere trasmessi tra batteri mediante coniugazione, trasduzione o trasformazione. Tali plasmidi possono condizionare il trasferimento di diversi caratteri, tra cui l antibiotico resistenza. Il fattore R è un plasmide inter-trasferibile tra tutte le specie di enterobatteri. Il fattore R comprende il gene portatore del carattere di antibiotico resistenza (elemento R) e un transfer factor (TF), cioè il gene che conferisce l attitudine alla coniugazione e alla formazione del sex pilus. L elemento R può anche esistere come tale libero nel citoplasma e può essere trasferito tramite trasduzione. I due elementi, che quindi possono esistere separati, sono ciascuno in grado di replicarsi in modo autonomo. Generalmente, i plasmidi R composti da elementi R e TF conferiscono resistenza a più antimicrobici. Gli elementi R liberi, più piccoli dei plasmidi R, normalmente codificano resistenza per un solo antibiotico. Il rischio prodotto 37

39 da questo tipo di trasmissione è particolarmente alto poiché questa può avvenire anche tra specie batteriche di generi diversi. E. coli, ad esempio, possiede il fattore R ed è in grado di trasmettere resistenze multiple ad altre Enterobacteriaceae patogene per l uomo quali Serratia spp. e Salmonella spp. (Russo e Turin, 2005) Specie aviarie e antibiotico resistenza Le diverse specie aviarie nelle relative realtà sono parte integrante del fenomeno di formazione e diffusione della resistenza agli antimicrobici. Sono stati infatti condotti diversi studi per indagare l impatto che specie sia da reddito che selvatiche possono avere sul fenomeno in questione. Galliani (2013), ad esempio, osserva la resistenza agli antimicrobici di ceppi di E. coli isolati da galline ovaiole. L autrice evidenzia resistenze a diverse sostanze e sottolinea il rischio che gruppi di animali ospiti di questi ceppi possono costituire. È nell interesse della salute pubblica monitorare l entità e la forma che l antibiotico resistenza assume nelle specie avicole. L utilizzo di antimicrobici negli allevamenti è una importante causa di sviluppo delle resistenze e l alimento stesso è mezzo di trasmissione di ceppi resistenti all uomo (Hoelzer et al., 2017). Anche la resistenza di batteri commensali di specie aviarie selvatiche è stata spesso oggetto di studio, in particolare per la possibilità di questi uccelli di compiere enormi spostamenti in tutto il pianeta. Graciolli Tomazi (2017), sottoponendo ad antibiogramma ceppi di E. coli isolati da avifauna selvatica, conclude che l antibiotico resistenza è un fenomeno che non coinvolge solo l ambiente urbano o le aree di produzioni animali. Si tratta infatti di una problematica che coinvolge aree di territorio molto più estese e gli uccelli sono una delle principali cause di questa diffusione. Conclusioni simili sono quelle ottenute da Zullo (2014) nel suo studio, che ha riguardato specie di avifauna selvatica campionate nel Parco Nazionale dell Asinara. I pattern fenotipici di resistenza osservati in questo studio non presentano particolari differenze tra specie migratorie e stanziali, nonostante queste ultime risiedano per tutta la vita in un area geografica particolarmente isolata. Per quanto riguarda infine il monitoraggio dell antibiotico resistenza in uccelli da gabbia e da voliera, studi in merito sono stati condotti, anche se in numero minore rispetto a specie da reddito e selvatiche. Horn et al. (2015) hanno analizzato la resistenza delle più comuni enterobatteriacee isolate da canarini (Serinus canaria). Hanno concluso che il canarino può albergare specie batteriche 38

40 dal potenziale zoonosico, le quali spesso (55,7%) presentano profili di multiresistenza. La particolarità delle specie da gabbia è quella di convivere con l uomo come animale domestico a tutti gli effetti, risulta quindi particolarmente importante il controllo del fenomeno dell antibiotico resistenza anche in queste specie (Horn et al., 2015). 39

41 3 MATERIALI E METODI 3.1 Raccolta dei campioni Lo studio è realizzato a partire da campioni fecali raccolti freschi dal fondo della gabbia dei soggetti in esame. Il campionamento ha convolto sia animali detenuti come pet-bird che animali d allevamento. Sono stati utilizzati due metodi differenti per le due classi. Per i pet-bird il campionamento è stato individuale, la raccolta delle feci ha riguardato ogni singolo soggetto separatamente. Per quanto riguarda i soggetti da allevamento, il singolo campione è stato formato tramite pool di coppie di riproduttori o da gruppi di soggetti comunque appartenenti alla stessa specie e detenuti della stessa gabbia. Sono stati effettuati anche alcuni campionamenti a pool in un negozio di animali. In tutti i casi il campionamento è stato effettuato tramite un foglio di alluminio sterilizzato posizionato sotto la gabbia il tempo necessario per l emissione spontanea delle feci, con l obbiettivo di effettuare un campionamento il più possibile esente da materiale alimentare ed altri scarti. I fogli di alluminio contenenti le feci campioni sono stati ripiegati e sigillati, dunque conservati a temperatura di refrigerazione fino al momento dell elaborazione in laboratorio. Tutti i soggetti campionati non sono stati sottoposti a trattamento antibiotico fino ad almeno 6 mesi dal prelievo. Sono stati così ottenuti 23 campioni da pet-bird, 28 campioni da allevamento e 13 campioni da un negozio di animali. I 64 campioni comprendono specie appartenenti agli ordini Passeriformes e Psittaciformes. 3.2 Analisi dei campioni Colture batteriche Ogni fase seguente di questo studio è stata condotta nel laboratorio di Patologia Avicunicola della Facoltà di Medina Veterinaria di Milano. I campioni sono stati prelevati dall involucro con una spatola sterilizzata su becco Bunsen e trasferiti in una provetta di plastica monouso sterile. In caso di campionamento proveniente da allevamento, nella provetta è introdotto materiale fecale di più soggetti. 40

42 Il contenuto della provetta è stato successivamente stemperato con acqua sterile prima di essere seminato su piastra di Petri allestita con agar MacConkey (Oxoid) tramite un tampone cotonato monouso sterile. Figura 13: Preparazione dei campioni alla prima fase di coltura (Archivio personale) Le piastre così ottenute sono state successivamente incubate alla temperatura di 37 per 24 ore. Contemporaneamente, i tamponi utilizzati sono stati introdotti in provette di vetro contenenti terreno liquido Brain Heart Infusion Broth (BHI, Oxoid) e conservati a temperatura di refrigerazione come riserva per la prima fase di semine. Le colture su agar MacConkey sono state valutate prima della seconda sessione di semine prevista dallo studio. In caso di coltura mista, sono state scelte per la fase successiva le colonie maggiormente rappresentate. Nei casi in cui non è stata evidenziata alcuna crescita batterica, la semina su agar MacConkey è stata ripetuta a partire dalla riserva dello stesso campione conservata in brodo BHI. I ceppi coltivati durante questa fase, sono stati dunque trasferiti con semina tramite ansa sterilizzata su becco Bunsen su piastre allestite con Mueller-Hinton agar. L obbiettivo di questo passaggio è quello di ottenere colture batteriche pure per la successiva tipizzazione biochimica. 41

43 Tabella I: composizione dei terreni di coltura utilizzati. Componenti MacConkey Concentrazione Digerito pancreatico di gelatina Digerito pancreatico di caseina Digerito peptidico di tessuto animale Lattosio Sali biliari Cloruro di sodio Rosso neutro Cristalvioletto Agar 17 g/l 1,5 g/l 1,5 g/l 10 g/l 1,5 g/l 5 g/l 0,03 g/l 0,001 g/l 13,5 g/l Componenti Mueller- Hinton Idrolisato di caseina, acido Amido Estratto di cuore, in pasta Agar Componenti Brodo BHI Miscela speciale di peptoni Infuso di cuore e cervello Dig. pancreatico di caseina Estratto di lievito Destrosio Cloruro di sodio Concentrazione 17,5 g/l 1,5 g/l 5 g/l 12 g/l Concentrazione 12 g/l 3,5 g/l 10 g/l 2 g/l 2 g/l 5 g/l identificazione di specie Una volta ottenute le colture pure, i ceppi sono stati tipizzati tramite l utilizzo di RapID ONE System (Remel). RapID ONE è un sistema qualitativo miniaturizzato che utilizza substrati convenzionali e cromogeni per l identificazione di Enterobacteriaceae di rilevanza clinica ed altri bacilli gramnegativi, ossidasi-negativi isolati nei campioni. I pannelli dei kit RapID ONE sono in plastica e monouso, sono composti da pozzetti contenenti i reagenti disidratati (Tabella II). Inizialmente, è stata preparata una sospensione delle colonie coltivate in precedenza. Con un tampone monouso sterile il campione è stato trasferito nel fluido di inoculazione compreso nel kit. Si è utilizzato lo standard Mc Farland n. 2 per la torbidità di questa sospensione. Dopo la contemporanea reidratazione dei pozzetti con il fluido di inoculo contenente il campione, i pannelli sono stati incubati a 37 per 4 ore. I pannelli pronti sono stati letti valutando lo sviluppo di colore all interno dei diversi pozzetti. In determinati pozzetti è necessario aggiungere ulteriori reagenti per completare la lettura. La combinazione di valori positivi e negativi genera un codice che può essere inserito nel database elettronico ERIC (Electronic RapID Compendium) che permette di identificare il ceppo batterico. 42

44 Figura 14: Serie di pannelli utilizzati per la tipizzazione biochimica (Archivio personale) Tabella II: Contenuto dei pozzetti RapID ONE. N. pozzetto Codice reazione Reagente Concentrazione % 1 URE Urea 0,25% 2 ADH Arginina 1,0% 3 ODC Ornitina 1,0% 4 LDC Lisina 1,0% 5 TET Tiolo alifatico 0,2% 6 LIP Estere di acidi grassi 1,0% 7 KSF Aldeide dello zucchero 1,0% 8 SBL Sorbitolo 1,0% 9 GUR ρ -nitrofenil-β, D-glucoronide 0,1% 10 ONPG σ-nitrofenil-β, D-galattoside 0,1% 11 βglu ρ-nitrofenil-β 0,1% 12 βxyl ρ-nitrofenil-β, D-xiloside 0,1% 13 NAG ρ-nitrofenil-acetil-β, D-glucosammide 0,1% 14 MAL Malonato 0,5% 15 PRO Prolina- β-naftilammide 0,1% 16 GGT γ-glutamil-β-naftilammide 0,1% 17 PYR Pirrolidonil-β-naftilammide 0,1% 18 ADON Adonitolo 1,0% 18 IND Triptofano 0,4% 43

45 3.2.3 Antibiogrammi L ultima fase del processo di elaborazione è stato l antibiogramma, secondo la tecnica di Kirby- Bauer. Sono state utilizzate a tale scopo piastre di Petri allestite con Mueller-Hinton agar sulle quali sono stati seminati i campioni. Per la semina, sono state scelte le colture pure su Mueller-Hinton agar che nella fase precedente sono state tipizzate come enterobatteriacee. La semina è stata effettuata tramite tampone sterile con prelievo dalla coltura pura e passaggio in brodo di arricchimento BHI. La torbidità acquisita dal brodo BHI seminato per questo passaggio è stata di 0,5 secondo lo standard Mc Farland. Le piastre sono state seminate nella loro interezza per 3 volte in modo uniforme e sono state lasciate ad asciugare per 10 minuti. Sulle piastre così preparate, sono stati disposti i dischetti in carta bibula contenenti concentrazioni note di farmaci antimicrobici (Tab. III). Le piastre sono dunque state incubate a 37 per 24 ore per permettere la crescita batterica. Tabella III: Antimicrobici compresi nell antibiogramma. Antimicrobico Dose disco Sigla Alone sensibilità Alone intermedio Alone resistenza Apramicina 15 µg APR 10 mm 11 mm 12 mm Neomicina 10 µg N 12 mm mm 15 mm Streptomicina 25 µg S 11 mm mm 15 mm Ciprofloxacina 5 µg CIP 15 mm mm 21 mm Enrofloxacina 5 µg ENR 17 mm mm 22 mm Levofloxacina 5 µg LEV 13 mm mm 17 mm Flumequina 30 µg UB 12 mm 12,5-20 mm 21 mm Colistina solfato 25 µg CT 8 mm 9-10 mm 11 mm Polimixina B 300 U PB 8 mm 9-11 mm 12 mm Cotrimossazolo 25 µg SXT 10 mm mm 16 mm Triple-sulfa 300 µg S3 12 mm mm 17 mm Doxiciclina 30 µg DO 12 mm mm 16 mm Tetraciclina 10 µg TE 14 mm mm 19 mm Amoxicillina e ac. clavulanico 30 µg AMC 13 mm mm 17 mm Cefotaxime 30 µg CTX 14 mm mm 23 mm Ceftazidime 30 µg CAZ 14 mm mm 18 mm Cloramfenicolo 30 µg C 12 mm mm 18 mm Florfenicolo 30 µg FFC 15 mm 16 mm 17 mm 44

46 I risultati dell antibiogramma sono stati valutati misurando l alone di inibizione di crescita manualmente con un righello. I risultati in mm sono stati rapportati ai valori di riferimento standard dell European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) che classifica il risultato metrico in sensibile, intermedio o resistente (Tabella IV). Tabella IV: Categorie di suscettibilità antimicrobica EUCAST (2013). EUCAST: Categorie in base al breakpoint clinico Sensibile (S): il livello di attività del farmaco nei confronti del microorganismo è associato ad un elevata probabilità di successo terapeutico. Intermedio (I): il livello di attività del farmaco nei confronti del microorgnismo è associato ad un effetto terapeutico incerto. Non è escluso che l infezione possa essere trattata appropriatamente in distretti corporei in cui il farmaco è attivamente concentrato o utilizzando alti dosaggi. La categoria rappresenta inoltre una misura contro modesti ma difficilmente controllabili fattori tecnici che possono causare discrepanze interpretative. Resistente (R): il livello di attività del farmaco nei confronti del microorganismo è associato ad un elevata probabilità di fallimento terapeutico. Figura 15: Allestimento degli antibiogrammi (Archivio personale) 45

47 4 RISULTATI E DISCUSSIONE 4.1 Ceppi batterici isolati Panoramica degli isolamenti effettuati In totale sono stati eseguiti 64 campionamenti da soggetti provenienti da 10 proprietari, 15 allevamenti ed un negozio di animali. Di questi ne sono risultati idonei ad ogni fase del processo di elaborazione, 41. Le specifiche di ogni singolo campione sono riassunte dalla tabella V. Sono stati inoltre raccolti ulteriori 21 campioni, tuttavia non è stato possibile tipizzare i 19 isolamenti da essi derivati per motivi tecnici. Tabella V: Origine, specie e isolamento dei campioni. A=Allevamento, N=Negozio e P=Pet-bird Origine-N Specie Isolamento A-1 Canarino (Serinus canaria) Shigella spp. A-2 Canarino (Serinus canaria) Klebsiella pneumoniae A-4 Diamante fetonte (Neochmia phaeton) Shigella spp. A-5 Diamante di Kittlitz (Erythrura trichroa) Proteus vulgaris A-7 Cappuccino tricolore (Lonchura malacca) Shigella spp. A-10 Cardinalino del Venezuela (Spinus cucullata) Pantoea agglomerans A-11 Cardellino (Carduelis carduelis) Citrobacter freundii A-12 Canarino (Serinus canaria) Citrobacter freundii A-13 Cardellino (Carduelis carduelis) Acinetobacter calcoaceticus A-14 Canarino (Serinus canaria) Shigella spp. A-15 Canarino (Serinus canaria) Citrobacter freundii A-17 Parrocchetto dal collare (Psittacula krameri) Serratia marcescens A-19 Parrocchetto ali cremisi (Aprosmictus erythropterus) Yersinia enterocolitica A-20 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Citrobacter freundii A-21 Parrocchetto alessandrino (Psittacula eupatria) Serratia liquefaciens A-22 Groppone rosso (Psephotus haematonotus) Serratia marcescens A-23 Parrocchetto capinero (Pyrrhura rupicola) Shigella spp. A-24 Pappagallino del Pacifico (Forpus coelestis) Shigella spp. A-26 Pappagallo cenerino (Psittacus erithacus) Escherichia coli A-27 Canarino (Serinus canaria) Klebsiella oxytoca N-5 Canarino (Serinus canaria) Providencia rettgeri N-6 Diamante di Gould (Erythrura gouldiae) Yersinia enterocolitica N-8 Passero del Giappone (Lonchura striata domestica) Acinetobacter calcoaceticus N-9 Calopsitta (Nymphicus hollandicus) Shigella spp. N-10 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Citrobacter freundii 46

48 Tabella V (Continua) Origine-N Specie Isolamento N-12 Diamante di Gould (Erythrura gouldiae) Acinetobacter calcoaceticus N-13 Rosella orientale (Platycercus eximius) Shigella spp. P-1 Rosella cremisi (Platycercus elegans) Yersinia enterocolitica P-2 Inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis) Serratia odorifera P-3 Calopsitta (Nymphicus hollandicus) Acinetobacter calcoaceticus P-4 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Yersinia enterocolitica P-5 Inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis) Yersinia enterocolitica P-7 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Yersinia enterocolitica P-8 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Yersinia enterocolitica P-9 Amazzone fronte gialla (Amazona ochrocephala) Yersinia enterocolitica P-12 Cocorita (Melopsittacus undulatus) Yersinia enterocolitica P-15 Pappagallo cenerino (Psittacus erithacus) Yersinia enterocolitica P-16 Canarino (Serinus canaria) Enterobacter aerogenes P-20 Pappagallo cenerino (Psittacus erithacus) Escherichia coli P-21 Inseparabile faccia rosa (Agapornis roseicollis) Escherichia hermannii P-22 Conuro del sole (Aratinga solstitialis) Yersinia kristensenii Le prevalenze degli isolamenti sono riassunti nel grafico I. Grafico I: Prevalenza dei ceppi batterici isolati Yersinia enterocolitica 3 (7%) 4 (10%) 7 (17%) 10 (24%) 8 (20%) Shigella spp. Citrobacter freundii Serratia spp. Acinetobacter calcoaceticus 4 (10%) Escherichia spp. 5 (12%) Altri 47

49 I campioni analizzati appartengono a 22 specie aviarie, in particolare si tratta di 8 specie dell ordine Passeriformes per un totale di 17 campioni e di 14 specie dell ordine Psittaciformes per un totale di 24 campioni. I ceppi batterici isolati appartengono a 11 generi differenti per un totale di 15 specie differenti, a cui si aggiungono gli isolamenti di Shigella spp. per i quali non è stato possibile arrivare all'identificazione di specie Isolamenti di Yersinia enterocolitica La specie più frequentemente isolata è stata Yersinia enterocolitica, l isolamento ha riguardato 10 campioni. Una prevalenza del 24% non è comune ma è già stata osservata. Nello studio di Kato et al. (1985) si osservano, in diverse specie di uccelli selvatici, prevalenze che vanno dal 23.8% per la gazza ali azzurre (Cyanopia cyanus) al 2.1% nel piccione (Columba livia). Nessuna delle specie della suddetta fonte appartiene all ordine degli psittaciformi. In questo studio invece, si osserva una spiccata prevalenza di specie ospite per gli isolamenti di Y. enterocolitica, infatti 4 isolamenti su 10 sono attribuiti a cocorite (Melpsittacus undulatus). Dei 6 ceppi rimanenti, 5 sono stati isolati da altri psittaciformi e solo 1 da un passeriforme. Sono stati condotti pochi studi sulla presenza di Y. enterocolitica nei pappagalli, anche se una concordanza con questi risultati si ritrova nello studio di Giles e Carter (1980), i quali hanno isolano Y. enterocolitica con una prevalenza del 23% da 26 cadaveri di un gruppo di cocorite venuto a morte in modo improvviso. Yersinia enterocolitica non è comunemente considerato un patogeno per le specie aviarie ed è dunque possibile che in questo caso l infezione possa essere stata di carattere opportunistico per parte delle cocorite coinvolte nella moria. I risultati di questo studio dimostrano infatti che Y. enterocolitica è presente con buona prevalenza in cocorite ed altri pappagalli sani. Sempre in un pappagallo (Aratinga solstitialis) è stata isolata Yersinia kristensenii, la cui patogeniticità accertata nel topo è dovuta ad una tossina mai osservata in altre specie del genere Yersinia (Robins-Browne et al., 1991). Si sottolinea come la maggior parte degli isolamenti di Y. enterocolitica (8 su 10) siano stati ottenuti da pet-bird, questo dato è di assoluta rilevanza in quanto si tratta di un agente eziologico che potenzialmente può essere una zoonosi, anche se per esserne certi è necessario indagarne il sierotipo. I campioni P1, P4 e P7 in particolare, appartengono a pappagalli dello stesso proprietario, sono animali che entrano in contatto l uno con l altro e da tutti è stato isolato Y. enterocolitica. 48

50 Ulteriori studi sarebbero utili per comprendere la precisa diffusione del microorganismo e la possibilità di trasmissione tra uccelli domestici. A prescindere dalle predisposizioni delle specie ospiti, si segnala una causa legata al metodo che può aver contribuito all ottenimento di una prevalenza così marcata di Y. enterocolitica. La procedura ha infatti previsto la conservazione dei campioni a temperatura di refrigerazione (4 C) in attesa delle analisi e Yersinia enterocolitica è un batterio psicrofilo che può essersi moltiplicato durante questa fase rendendo il suo isolamento più probabile Isolamenti di Shigella spp. In questo studio sono stati isolati 8 ceppi appartenenti a Shigella spp. e non ci sono particolari differenze tra ordini o specie ospiti. Alcuni autori sostengono che Shigella spp. non sia normalmente isolato dagli uccelli da gabbia (Gerlach, 1994) anche se in questo studio sono rientrati unicamente soggetti di specie comuni e clinicamente sani. Considerato inoltre che la shigellosi negli uccelli è stata osservata sia nei polli da parte di Shigella flexneri (Shi et al., 2014), che nei pappagalli (Amazona autumnalis) per causa di Shigella sonnei (Rosskopf e Woerpel, 1989), si può supporre che i ceppi isolati appartengano ad altre specie o a sierovarianti non patogene delle sopracitate. Considerando che Shigella spp. mostra gli stessi caratteri di patogenicità quando è in grado di colpire sia uomo che uccelli (Shi et al., 2014), è possibile che la presenza di questi ceppi in uccelli da gabbia non sia una grave minaccia per la salute umana, fintanto che gli uccelli stessi non accusano sintomatologia Isolamenti di Citrobacter freundii I 5 ceppi di Citrobacter freundii isolati costituiscono il 12% degli isolamenti, questa specie è l unica del genere Citrobacter ad essere stata isolata in questo studio. Non si evidenziano particolari prevalenze in base alla specie o all origine dei soggetti campionati, anche se il numero degli isolamenti è limitato per considerazioni di questo tipo. In uno studio dai caratteri molto simili è stato isolato Citrobacter freundii con una prevalenza del 5% da un gruppo eterogeneo di 109 uccelli tra passeriformi e psittaciformi provenienti dal commercio illegale di specie selvatiche (Matias et al., 2016). In quest altro studio sono stati isolati anche altre specie di Citrobacter ma con una prevalenza 49

51 molto bassa (<1%). C. freundii sembra essere dunque il principale esponente del genere Citrobacter che può essere isolato dagli uccelli da gabbia e assume rilevanza in quanto è anche la specie di Citrobacter spp. principalmente isolata da infezioni opportuniste del tratto urinario nell uomo (Gill et al, 1999) Isolamenti di Serratia spp. In questo studio sono stati isolati 4 ceppi appartenenti a Serratia spp: da 2 campioni è stato isolato Serratia marcescens e dai restanti Serratia odorifera e Serratia liquefaciens. Il numero di ceppi non è affatto sufficiente per determinare quale specie sia la più rappresentativa di Serratia spp. negli uccelli da gabbia, si sottolinea comunque come tutti e 4 gli isolamenti siano stati ottenuti da psittaciformi. La prevalenza in questo studio è del 10% e prevalenze simili sono già state descritte in letteratura in specie di uccelli analoghe (Matias et al. 2016). In particolare, lo studio di Alcaraz et al. (2016) conferma che Serratia spp. sia un isolamento che ricorre nelle specie di pappagallo utilizzate come pet-bird. Nei pappagalli infatti la presenza di Serratia marcescens può fungere da indicatore dello stato di salute: è segnalata per la sua caratteristica di proliferare maggiormente in pappagalli affetti da patologie croniche debilitanti (Gerlach, 1994). Serratia spp. sembra dunque essere emesso in quantità moderate dagli uccelli da gabbia, tuttavia il rischio sanitario che costituisce aumenta quando la salute dell animale viene a mancare Isolamenti di Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus è un coccobacillo Gram-negativo immobile che non è stato precedentemente descritto in questa tesi poiché appartenente alla famiglia delle Moraxellaceae. A. calcoaceticus risulta tuttavia isolato da 4 campioni in questo studio. A. calcoaceticus è spesso associato come complesso ad Acinetobacter baumanii. Entrambi sono comunemente descritti come batteri colonizzanti il suolo e possono dunque aver contaminato i relativi campioni. Tuttavia si riporta lo studio di Dahiru e Enabulele (2015) basato sulla ricerca di A. baumanii nelle feci di uccelli selvatici quale contaminante dei prodotti ortofrutticoli. A. baumanii è stato isolato dal 31,25% dei campioni fecali e ha anche presentato resistenza agli antimicrobici. Considerato il ruolo di patogeno opportunista del complesso A. calcoaceticus-baumanii in ambito ospedaliero, sarebbe utile approfondire la ricerca anche negli uccelli da gabbia. 50

52 4.1.7 Isolamenti di Escherichia spp. Contrariamente a quanto atteso, gli isolamenti di Escherichia coli sono stati solamente 2, a cui si aggiunge l isolamento di un ceppo di Escherichia hermannii. I due ceppi di E. coli provengono entrambi da pappagalli cenerini (Psittacus erithacus). In medicina aviare, nella pratica clinica, E. coli viene considerato un patogeno ancora più importante di Salmonella spp. in alcune specie (Gerlach, 1994). Non si può escludere che nelle specie di uccelli da gabbia la presenza di E. coli sia più bassa rispetto alle specie avicole e selvatiche, per via di una sensibilità maggiore alle patologie causate da questo microorganismo. Giacopello et al. (2014) evidenziano una prevalenza di E. coli del 35,2% in canarini con segni clinici di malattia e suppongono che questa percentuale sia superiore al normale pur non avendo altri riferimenti relativi ad uccelli sani. Il presente studio sembra confermare questa ipotesi. Nella calopsitta (Nymphicus hollandicus), uno studio analogo condotto non ha evidenziato alcun isolamento di E. coli (Alcaraz et al., 2016) Altri isolamenti Si segnalano infine altri isolamenti sporadici di un solo ceppo batterico per specie. Proteus vulgaris è stato isolato da un diamante di Kittlitz (Erythrura trichroa). Proteus spp. è un isolamento che ricorre in avicoli e specie selvatiche ma pochi studi sono stati condotti negli uccelli da gabbia. In ogni caso, Proteus spp. non sembra costituire un particolare rischio per la salute di queste specie (Gerlach, 1994). Pantoea agglomerans è stato isolato da un cardinalino del Venezuela (Spinus cucullata). P agglomerans appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae e viene isolato da ambiente e feci sia umane che animali. Negli uccelli da gabbia P. agglomerans è stato isolato nei pappagalli da Xenoulis et al. (2010). Enterobacter aerogenes è stato isolato da un canarino. Al genere Enterobacter appartengono enterobatteriacee che sono segnalate in alcuni studi come isolamento da specie aviarie, anche da gabbia (Machado et al., 2016). Sempre da canarini sono stati isolati Klebsiella oxytoca e Klebsiella pneumoniae. Lo studio di Machado et al. (2016) conferma anche in questo caso che Klebsiella spp. è già stato isolato da uccelli da gabbia. La presenza di Klebsiella spp. è rilevante in quanto patogeno opportunista che mostra sempre più resistenza gli antimicrobici negli ultimi anni (Bi et al., 2017). Si segnala infine l isolamento di Providencia rettgeri da un canarino, si tratta di un enterobatteriacea non comune ma Providencia spp. è già stata segnalata nelle specie aviarie (Matias et al., 2016). 51

53 4.2 Risultati della sensibilità agli antimicrobici Figura 16: Antibiogramma pronto per la lettura (Archivio personale) Panoramica degli antibiogrammi Nella tabella VI sono riportati gli esiti degli antibiogrammi per ogni campione isolato. Gli antimicrobici sono divisi per classe e sono evidenziati i ceppi che hanno mostrato piena resistenza a più di 3 classi e dunque multiresistenti. Tabella VI (Pagina seguente) Legenda: Aminoglicosidi Chinoloni Polipeptidi Sulfamidici Tetracicline β Lattamici Cefalosporine Fenicoli Ceppo multiresistente (+)= Sensibile (-)= Resistente (+/-)= Intermedio 52