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1 Validazione delle prestazioni del metodo in conformità alla norma ISO/TR per il sistema Enterolert * -DW e Quanti-Tray * per la determinazione quantitativa degli enterococchi nelle acque destinate al consumo umano. APRILE 2010 One IDEXX Drive Westbrook, Maine Stati Uniti idexx.it 2011 IDEXX Laboratories, Inc. Tutti i diritti riservati *Enterolert, Define Substrate Technology, DST e Quanti-Tray sono marchi o marchi registrati di IDEXX Laboratories, Inc. o di suoi affiliati negli Stati Uniti e/o in altri Paesi. La politica di tutela della privacy di IDEXX è disponibile sul sito

2 d1. Introduzione Il metodo Enterolert*- DW, basato sulla tecnologia Defined Substrate Technology* (DST*), è stato elaborato per rilevare gli enterococchi in acqua potabile. Durante la crescita degli enterococchi nel terreno colturale liquido, gli enzimi da essi prodotti metabolizzano un substrato specifico per la β- glucosidasi, modificando il colore del terreno colturale da blu a verde e confermando in questo modo la presenza di enterococchi in campioni di acqua potabile. Il sistema Enterolert-DW e Quanti-Tray* (Enterolert-DW/Quanti-Tray) viene utilizzato per l isolamento e l enumerazione degli enterococchi in campioni di acqua potabile. Una confezione di reagente Enterolert-DW viene aggiunta a un flacone sterile contenente il campione di acqua da analizzare. Una volta aggiunto il reagente in polvere, il recipiente viene agitato per dissolvere la polvere. La miscela contenente il campione/reagente disciolti viene versata in un Quanti-Tray o un Quanti- Tray 2000 e il vassoio viene sigillato con il sigillatore Quanti-Tray Sealer. Il vassoio viene quindi incubato a (41 ± 0,5) ºC per 24 ore. La quantificazione degli enterococchi confermati nel campione viene determinata mediante il conteggio del numero di pozzetti di colore verde nel Quanti-Tray usando il metodo statistico del numero più probabile (MPN). 2. Applicazioni del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è stato concepito per analizzare campioni di acqua potabile e per offrire prestazioni paragonabili a quelle previste dalla norma ISO :2000 Qualità dell acqua Ricerca ed enumerazione degli enterococchi intestinali Parte 2: Metodo di filtrazione su membrana (ISO ) e Microbiologia dell acqua potabile (2006) Parte 5: Isolamento ed enumerazione degli enterococchi intestinali (membrane filtranti) (MoDW 2006, Parte 5) in relazione alle acque potabili. Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray offre risultati quantitativi confermati per gli enterococchi in campioni di acqua potabile entro 24 ore. 3. Identificazione degli organismi target (ISO/TR sezioni e 9.2) Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray rileva gli enterococchi in base all attività della loro β- glucosidasi utilizzando la tecnologia Defined Substrate Technology. Quando nel campione esaminato sono presenti enterococchi, il terreno colturale cambia colore, passando da blu a verde. Il sistema Quanti-Tray offre risultati quantitativi basati sul metodo statistico del numero più probabile (MPN). 3.1 L esame della coltura pura (ISO/TR sezione ) Le reazioni tipiche del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray sono state definite mediante l impiego di colture pure di ceppi di riferimento provenienti dall American Type Culture Collection (ATCC) inoculate nel terreno di coltura. Sono stati testati gli enterococchi bersaglio, oltre ai batteri gramnegativi e gram-positivi non bersaglio. I risultati tipici di questi ceppi di riferimento sono riportati nella Tabella 3.1. Questi ceppi vengono utilizzati da IDEXX per il normale controllo qualità del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray. IDEXX Laboratories, Inc. 1

3 Tabella 3.1 Ceppi di riferimento di enterococchi e di batteri gram-negativi e gram-negativi non bersaglio utilizzati per confermare le tipiche reazioni positive e negative nel sistema Enterolert-DW/Quanti- Tray 2BUBatterio 1BUCeppo BUReazione tipica di Enterolert-DW Enterococcus faecium ATCC Verde Enterococcus faecalis ATCC Verde Enterococcus hirae ATCC 8043 Verde Serratia marcescens** ATCC Blu (nessuna variazione di colore) Staphylococcus aureus*** ATCC 6538 Blu (nessuna variazione di colore) ** Fino a 10 6 UFC/100 ml *** Fino a 10 4 UFC/100 ml 3.2 Studi su sensibilità, specificità, tasso di falsi positivi/negativi, efficienza e selettività (ISO/TR sezione 9.2) In termini di metodiche microbiologiche,la norma ISO/TR fornisce la definizione delle caratteristiche di seguito riportata: a) numero di risultati positivi presuntivi confermati positivi (veri positivi) b) numero di risultati negativi presuntivi confermati positivi (falsi negativi) b) numero di risultati positivi presuntivi confermati negativi (falsi positivi) b) numero di risultati negativi presuntivi confermati negativi (veri negativi) 1) Sensibilità = a/(a + b), frazione dei positivi totali correttamente assegnati nel conteggio presuntivo 2) Specificità = d/(c + d), frazione dei negativi totali correttamente assegnati nel conteggio presuntivo 3) Tasso di falsi positivi = c/(a + c), frazione dei positivi osservati assegnati incorrettamente 4) Tasso di falsi negativi = b/(b + d), frazione dei negativi osservati assegnati incorrettamente 5) Efficienza (E) = (a + d)/n 6) Selettività (F) = lg [(a + c)/n] Per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray, queste caratteristiche sono collegate al numero di pozzetti positivi per gli enterococchi che effettivamente contenevano batteri bersaglio e al numero di pozzetti realmente negativi per i batteri bersaglio. La valutazione della sensibilità, della specificità e della selettività del sistema Enterolert-DW/Quanti- Tray è stata ottenuta attraverso l identificazione degli isolati batterici dai pozzetti positivi e negativi dei campioni testati. I campioni sono stati preparati aggiungendo ai campioni di acqua potabile volumi definiti di acqua reflua trattata o non trattata con cloro Nella presente validazione, i falsi positivi e negativi del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray sono stati identificati mediante l isolamento selettivo e l identificazione batterica in 229 pozzetti positivi e in 186 pozzetti negativi selezionati casualmente tra campioni prelevati in 49 siti negli Stati Uniti, nel Regno Unito e in Italia, Belgio e Spagna. È stato utilizzato il sistema di identificazione biochimica VITEK II (biomérieux, Inc. Durham, NC, USA). I risultati sono descritti in dettaglio rispettivamente nell Appendice I e nell Appendice II. Le caratteristiche di prestazione del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray, definite in base alla norma ISO/TR 13843, sono elencate nella Tabella IDEXX Laboratories, Inc. 2

4 Tabella Sensibilità, specificità, tasso di falsi positivi/negativi, efficienza e selettività del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray Caratteristica Risultati Sensibilità 95% Specificità 98% Tasso di falsi positivi 2% Tasso di falsi negativi 7% Efficienza 96% Selettività -0,3 Gli isolati batterici di quattro (4) pozzetti positivi su 229 sono stati identificati come specie non enterococciche e tredici (13) isolati su 186 pozzetti negativi sono stati identificati come specie di enterococchi. Le specie batteriche che hanno fornito risultati falsi positivi e falsi negativi durante questa validazione sono riportate rispettivamente nelle Tabelle e Tabella Identificazione batterica con falsi positivi mediante VITEK II Specie responsabile dei falsi positivi UOccorrenza (su 229 positivi) Lactococus raffinolactis 1 Elizabethkingia meningoseptica 3 Tabella Identificazione batterica con falsi negativi mediante VITEK II Specie responsabile dei falsi negativi Occorrenza (su 186 negativi) Enterococcus hirae 2 Enterococcus faecium 4 Enterococcus avium 5 Enterococcus faecalis 1 Enterococcus casseliflavus 1 Gli esiti di questa validazione indicano che il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è sensibile e specifico (rispettivamente 95% e 98%). Il metodo, inoltre, è molto selettivo con un valore di -0,3, che risulta molto migliore del valore guida di -1 indicato dalla norma ISO/TR per i metodi per la conta delle colonie. Con un valore di efficienza calcolato di 96%, i dati suggeriscono che il metodo è altamente efficiente. I dati sull identificazione indicano che il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è in grado di rilevare un ampia gamma di specie di enterococchi. 4. Incertezza della conta (ISO sezione e Allegato B) La ripetibilità e la riproducibilità sono due stime dell affidabilità di un metodo che è possibile ottenere con una tecnica analitica. La ripetibilità (r) e la riproducibilità (R) vengono definite come segue: ripetibilità: grado di concordanza tra i risultati ottenuti da numerose prove indipendenti sotto condizioni definite,applicando lo stesso metodo analitico,su di uno stesso materiale,nello stesso laboratorio,eseguito dallo stesso operatore,in un breve intervallo di tempo IDEXX Laboratories, Inc. 3

5 riproducibilità: grado di concordanza tra i risultati ottenuti da numerose prove,applicando lo stesso metodo analitico,su uno stesso materiale,in laboratori differenti,con operatori diversi. Nel caso della conta di colonie microbiologiche su piastra agar o reazioni positive in un test MPN, l analista rappresenta la condizione che rimane invariata oppure che cambia. Pertanto, in questo contesto, la ripetibilità è la concordanza fra le conte ottenute con conteggi ripetuti da parte dello stesso analista, mentre la riproducibilità è la concordanza fra conte successive ottenute da parte di due o più analisti. L Allegato B della norma ISO/TR fornisce le indicazioni per la determinazione del conteggio della ripetibilità e della riproducibilità utilizzando deviazioni standard relative (DSR) di conte ripetute. Contiene inoltre la raccomandazione secondo cui, quando si utilizzano colture pure, le DSR siano idealmente < 0,02 (vale a dire una deviazione non superiore al 2%). In questo caso,sono stati condotti studi sull incertezza dei conteggi e i dati sono illustrati nell Appendice III. Il conteggio è stato eseguito in modo che ciascun analista non fosse a conoscenza delle conte degli altri analisti e i valori MPN risultanti sono stati registrati come numeri interi. Le DSR calcolate dai valori MPN dei sistemi Enterolert-DW/Quanti-Tray inoculati con Enterococcus faecalis ATCC sono riportate nella Tabella 4.1. Tabella 4.1 Ripetibilità e riproducibilità del sistema Enterolert-DW OIncertezza dei conteggi UDeviazione standard relativa (DSR) Ripetibilità (r) 0,006 Riproducibilità (R) 0,005 I valori calcolati per gli enterococchi tipici sono molti inferiori al valore di < 0,02 (ISO/TR sezione B1), il che indica come sia possibile ottenere un conteggio MPN affidabile per gli enterococchi con il metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray. 5. Robustezza (ISO/TR sezioni e B.4) La caratteristica rilevante per la robustezza del metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray è relativa al periodo di incubazione: 24 ore, con il risultato valido fino a 28 ore, come descritto nel metodo. Nell Appendice IV sono riportati i risultati delle conte, in triplo, delle sospensioni delle colture di riferimento di E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. mundtii e E. gallinarum analizzate utilizzando lo stesso lotto di Enterolert-DW dopo un periodo di incubazione di 24 e di 28 ore. Non sono state osservate variazioni nelle conte per 6 dei 7 tipi di ceppi certificati. Le conte di E. gallinarum ATCC sono risultate aumentate di un pozzetto positivo nel periodo tra 24 e 28 ore. Questo ceppo di E. gallinarum ATCC sembra mostrare un tasso di crescita relativamente più basso o un attività enzimatica più debole rispetto agli altri ceppi batterici testati. I dati suggeriscono che il periodo di incubazione raccomandato di almeno 24 ore e non oltre 28 ore è robusto. Tuttavia, per alcuni ceppi di enterococchi che crescono lentamente o possiedono un attività β-glucosidasica ridotta, può esistere un aumento marginale delle conte dopo 28 ore di incubazione rispetto alle conte effettuate dopo 24 ore di incubazione. L aumento delle conte durante un periodo di incubazione stabilito (per es ore per metodi di filtrazione su membrana tipici quali ISO o MoDW 2006, parte 5) è un fenomeno noto, soprattutto con gli enterococchi rilevabili nell ambiente. Tuttavia, per considerazioni pratiche e operative, le conte ottenute con il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray dopo un periodo di IDEXX Laboratories, Inc. 4

6 incubazione di ore sono considerate accettabili, purché l aumento delle conte dopo un incubazione prolungata non sia troppo eccessivo. 6. Limiti superiori di esercizio (ISO/TR sezioni e 6.3.3) Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è un metodo MPN con una scala di conteggio definita tra 0 e 201 per Quanti-Tray e tra 0 e per Quanti-Tray/2000 determinata in base al numero di pozzetti presenti nel Quanti-Tray. In conformità alla norma ISO/TR 13843, sezione 6.3.3, per ragioni pratiche e statistiche, non è possibile stabilire alcun limite superiore per i metodi MPN poiché la precisione non dipende semplicemente dal numero di particelle introdotte nel sistema di rilevazione. 7. Precisione (ISO/TR sezioni e 9.5.5) La precisione di un metodo MPN viene descritta dagli intervalli di confidenza del 95% (IC) calcolati per ciascun valore MPN (ISO/TR 13843, sezione 9.5.5). Nell Appendice V sono riportati gli intervalli di confidenza per le conte del sistema Enterolert- DW/Quanti-Tray, calcolati utilizzando il programma messo a disposizione on-line dal Bacteriological Analytical Manual (BAM) della US Food and Drug Administration (FDA) ( La ripetibilità teorica per ciascun valore MPN può derivare dall MPN e dai suoi intervalli di confidenza. Nell Appendice VI, inoltre, sono illustrati i valori di incertezza relativi per ciascun MPN (log10ds,calcolato dai valori degli intervalli di confidenza del 95% dell MPN) e la ripetibilità (incertezza standard relativa) come coefficienti di variazione (CV%). Questi coefficienti di Poisson possono essere utilizzati come valori minimi di precisione a cui è possibile combinare tutti i dati pertinenti posseduti da un laboratorio (per es. sulla variazione della chiarificazione del volume del test o dell incertezza del conteggio) allo scopo di ottenere una stima complessiva di ripetibilità per ciascun valore MPN. 8. Recuperi relativi (ISO/TR sezione e ISO 17994) Il recupero relativo degli enterococchi spp. con il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è stato confrontato al recupero con i metodi di riferimento ISO e MoDW 2006, parte 5, in conformità ai requisiti descritti nella norma ISO 17994:2004 Qualità dell'acqua - Criteri per definire una equivalenza tra metodi microbiologici (ISO 17994). In questa validazione sono stati utilizzati complessivamente 403 campioni di acqua potabile provenienti da diverse aree geografiche di Regno Unito, Italia, Spagna, Belgio e Stati Uniti. Gli stessi campioni sono stati usati in ciascuno dei tre metodi sottoposti a confronto. Di questi, 198 campioni erano trattati con cloro e 205 campioni non lo erano. I dati confermati delle conte accoppiate per il confronto dei due metodi (sistema Enterolert-DW/Quanti- Tray e ISO oppure sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e MoDW parte 5) sono stati trasformati utilizzando logaritmi naturali (ln) e sono state calcolate le differenze relative delle conte per ciascuna coppia (xi) applicando la formula [ln(ai) ln(bi)] x 100% (dove ai e bi rappresentano le conte confermate accoppiate rispettivamente per il metodo esaminato e per quello di riferimento). Nota: se una delle conte risulta zero, prima della trasformazione logaritmica viene aggiunto 1 a entrambe le conte. La differenza relativa media e la deviazione standard sono state calcolate a partire dai dati. La valutazione dell equivalenza si è basata sulla differenza relativa media e sull incertezza estesa (U) [calcolata dalla deviazione standard del valore medio (U = 2s/ n)], da cui sono stati calcolati i limiti IDEXX Laboratories, Inc. 5

7 inferiore (xl) e superiore (xh) dell intervallo di confidenza. Gli esiti dello studio sono riportati nelle Tabelle 8.1 e 8.2. L analisi ha mostrato che il metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray fornisce valori complessivamente maggiori di recupero rispetto alla norma ISO Questo risultato e dovuto principalmente alle differenze relative ottenute utilizzando matrici di campioni di acqua trattati con cloro. Per i campioni non trattati con cloro, la validazione riporta il risultato come Metodi non diversi per il confronto tra i due metodi. La conclusione generale del confronto tra il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e MoDW 2006, Parte 5 è stata di Metodi non diversi ; i risultati del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray erano più elevati con i campioni trattati con cloro e non mostravano differenze per i campioni non trattati. Le differenze osservate nei recuperi tra il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e i due metodi standard derivavano probabilmente dal peggioramento delle prestazioni dei metodi standard quando venivano usati i campioni trattati con cloro. Questa ipotesi è ulteriormente supportata dal tasso ridotto di falsi positivi (2%) e dall elevata specificità (98%) determinati per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray. Poiché si tratta di una validazione eseguita su aliquote degli stessi campioni, i risultati hanno indicato che i metodi standard non erano stati in grado di rilevare alcuni microrganismi bersaglio nello stesso campione di acqua. I recuperi relativi per ciascun metodo sono riassunti nell Appendice VII. Durante questa validazione sono state osservate differenze significative nel recupero relativo tra i due metodi standard ISO e MoDW 2006, Parte 5. I risultati sono riassunti nella Tabella 8.3. Tabella 8.1 Sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray vs. ISO Matrice campioni di acqua potabile Differenza relativa media (%DR) Incertezza estesa BASSA (%XL) Incertezza estesa ALTA (%XH) Conclusioni Tutte le matrici Enterolert-DW più alto Matrice campioni trattati con cloro Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW più alto Nessuna differenza tra i metodi Tabella 8.2 Sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray vs. MoDW 2006, Parte 5 Matrice campioni di acqua potabile Differenza relativa media (%DR) Incertezza estesa BASSA (%XL) Incertezza estesa ALTA (%XH) Conclusioni Tutte le matrici Nessuna differenza tra i metodi Matrice campioni trattati con cloro Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW più alto Non conclusivo IDEXX Laboratories, Inc. 6

8 Tabella 8.3 ISO vs. MoDW 2006, Parte 5 Matrice campioni di acqua potabile Differenza relativa media (%DR) Incertezza estesa BASSA (%XL) Incertezza estesa ALTA (%XH) Conclusioni Tutte le matrici Metodi significativamente differenti Matrice campioni trattati con cloro Matrice campioni non trattati con cloro Metodi significativamente differenti Metodi significativamente differenti 9. Riferimenti bibliografici ISO :2000 Qualità dell acqua Ricerca ed enumerazione degli enterococchi intestinali - Parte 2: Metodo di filtrazione su membrana. Ginevra: Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione. The Microbiology of Drinking Water (2006) - Part 5 - The isolation and enumeration of enterococci by membrane filtration. Nottingham: Environment Agency The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 3 - Practices and procedures for laboratories. Nottingham: Environment Agency ISO/TR 13843:2000(E) Qualità dell acqua Guida alla validazione dei metodi microbiologici. Ginevra: Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione. ISO 17994:2004 Qualità dell'acqua - Criteri per definire una equivalenza tra metodi microbiologici. Ginevra: Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione. IDEXX Laboratories, Inc. 7

9 Appendice I: Identificazione di isolati da pozzetti positivi con Enterolert-DW/Quanti-Tray UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 1 + E. gallinarum 99% 2 + E. faecium 97% 3 + E. faecium 99% 4 + E. gallinarum 99% 5 + E. gallinarum 99% 6 + E. faecium 99% 7 + E. faecalis 99% 8 + E. faecium 99% 9 + E. faecium 96% 10 + E. gallinarum 99% 11 + E. gallinarum 99% 12 + E. faecium 97% 13 + E. hirae 99% 14 + E. faecalis 99% 15 + E. faecium 98% 16 + E. gallinarum 99% 17 + E. faecium 98% 18 + E. gallinarum 93% 19 + E. faecalis 99% 20 + E. avium 92% 21 + E. faecalis 99% 22 + E. durans/hirae IC basso 23 + E. faecalis 99% 24 + E. seriolicida 99% 25 + E. faecalis 99% 26 + E. seriolicida 99% 27 + E. seriolicida 95% 28 + E. gallinarum 98% 29 + E. seriolicida/l. lactis ssp lactis IC basso 30 + E. faecium 99% 31 + Lactococus raffinolactis 90% 32 + E. gallinarum 99% 33 + E. seriolicida 99% 34 + E. faecium 99% 35 + E. faecium 99% 36 + E. faecium 99% 37 + E. gallinarum 99% 38 + E. faecium 99% 39 + E. faecium 99% IDEXX Laboratories, Inc. 8

10 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 40 + E. faecium 98% 41 + E. hirae 95% 42 + E. hirae 99% 43 + E. faecium 98% 44 + E. hirae 95% 45 + E. hirae 99% 46 + E. gallinarum 99% 47 + E. faecium 99% 48 + E. faecium 99% 49 + E. faecium 99% 50 + E. hirae 99% 51 + E. durans/faecium IC basso 52 + E. faecalis 99% 53 + E. gallinarum 93% 54 + E. durans 98% 55 + E. faecium 96% 56 + E. faecium 99% 57 + E. faecalis 99% 58 + E. hirae 99% 59 + E. faecium 92% 60 + E. hirae 99% 61 + E. faecium 99% 62 + E. faecium 99% 63 + E. faecium 94% 64 + E. faecium 99% 65 + E. durans 97% 66 + E. faecium 98% 67 + E. faecalis 99% 68 + E. hirae 95% 69 + E. faecium 99% 70 + E. faecalis 99% 71 + E. faecium 96% 72 + E. casseliflavus 89% 73 + E. faecalis 99% 74 + E. casseliflavus 99% 75 + E. seriolicida 99% 76 + E. seriolicida / lactis IC basso 77 + E. durans/faecium/hirae IC basso 78 + E. casseliflavus 97% 79 + E. gallinarum 99% 80 + E. casseliflavus 89% 81 + E. durans/hirae IC basso IDEXX Laboratories, Inc. 9

11 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 82 + E. gallinarum 98% 83 + E. gallinarum 99% 84 + E. hirae 95% 85 + E. faecalis 99% 86 + E. seriolicida /lactis IC basso 87 + E. faecium 95% 88 + E. seriolicida /lactis IC basso 89 + E. faecium 98% 90 + E. avium 95% 91 + E. gallinarum 99% 92 + E. faecium 93% 93 + E. gallinarum 99% 94 + E. gallinarum 99% 95 + E. gallinarum 99% 96 + E. faecium 98% 97 + E. faecium 99% 98 + E. faecium 99% 99 + E. faecalis 99% E. gallinarum 99% E. seriolicida /lactis IC basso E. faecium 96% E. faecium 99% E. faecium 92% E. gallinarum 99% E. faecium 99% E. durans/gallinarum/hirae IC basso E. gallinarum 99% E. faecalis 99% E. faecium 98% Elizabethkingia meningoseptica 95% E. gallinarum 99% Elizabethkingia meningoseptica 99% E. faecium 98% E. casseliflavus 99% E. faecium 99% E. casseliflavus/gallinarum IC basso E. faecium 99% E. casseliflavus 99% E. gallinarum 99% E. faecium/gallinarum IC basso E. gallinarum 98% E. hirae 99% IDEXX Laboratories, Inc. 10

12 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza E. raffinosus 91% E. faecium 99% E. faecalis 85% E. faecalis 99% Elizabethkingia meningoseptica 99% E. hirae 99% E. durans 95% E. casseliflavus 93% E. seriolicida / lactis IC basso E. faecium 86% E. casseliflavus/gallinarum IC basso E. gallinarum 98% E. casseliflavus/gallinarum IC basso E. faecium 99% E. hirae 99% E. faecium 98% E. gallinarum 99% E. faecium 98% E. gallinarum 99% E. faecium 99% E. faecium 99% E. gallinarum 98% E. durans/faecium IC basso E. faecium 99% E. faecium 99% E. durans 85% E. gallinarum 99% E. faecium/gallinarum IC basso E. faecium 99% E. faecium 94% E. faecium 99% E. faecalis 99% E. hirae 91% E. durans 94% E. faecium 99% E. faecium 98% E. durans 98% E. faecalis 99% E. durans 92% E. faecalis 99% E. durans/faecium IC basso E. faecium 99% IDEXX Laboratories, Inc. 11

13 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza E. faecium 99% E. faecium 98% E. gallinarum 99% E. faecalis 99% E. casseliflavus/gallinarum IC basso E. durans 98% E. faecium 99% E. hirae 99% E. faecium 99% E. gallinarum 99% E. faecium 98% E. hirae 95% E. avium 90% E. gallinarum 98% E. faecalis 99% E. gallinarum 99% E. faecium 99% E. hirae 99% E. faecium 95% E. gallinarum 98% E. gallinarum 99% E. gallinarum 99% E. faecium 93% E. faecium 99% E. faecium 93% E. faecium 99% E. gallinarum 99% E. gallinarum 99% E. faecium 99% E. faecalis 99% E. faecium 99% E. gallinarum 99% E. faecium 98% E. faecium 98% E. durans/faecium IC basso E. faecium 91% E. faecium 99% E. faecalis 99% E. faecalis 99% E. faecium 97% E. gallinarum 99% E. faecium 99% IDEXX Laboratories, Inc. 12

14 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza E. faecium 98% E. gallinarum 99% E. faecalis 99% E. faecium 99% E. casseliflavus/e. gallinarum IC basso E. faecalis 95% E. faecium 99% E. durans 93% E. faecium 98% E. durans 99% E. faecalis 99% E. faecium 97% E. seriolicida /lactis IC basso E. faecium 98% E. faecium 99% E. faecalis 99% E. faecium 97% E. faecalis 99% E. faecalis 99% E. faecalis 99% E. faecium 99% E. faecium 98% IDEXX Laboratories, Inc. 13

15 Appendice II: Identificazione di isolati da pozzetti negativi con Enterolert-DW/Quanti-Tray UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 1 - Nessuna ND 2 - Nessuna ND 3 - E. hirae 99% 4 - E. hirae 95% 5 - Nessuna ND 6 - Nessuna ND 7 - Nessuna ND 8 - Nessuna ND 9 - Nessuna ND 10 - Nessuna ND 11 - Nessuna ND 12 - Nessuna ND 13 - Nessuna ND 14 - Nessuna ND 15 - E. faecium 99% 16 - E. faecium 98% 17 - Nessuna ND 18 - Nessuna ND 19 - Nessuna ND 20 - Nessuna ND 21 - Nessuna ND 22 - Nessuna ND 23 - Nessuna ND 24 - Nessuna ND 25 - Nessuna ND 26 - Nessuna ND 27 - Nessuna ND 28 - Nessuna ND 29 - Nessuna ND 30 - Nessuna ND 31 - Nessuna ND 32 - E. faecium 99% 33 - Nessuna 34 - Nessuna 35 - E. avium 99% 36 - E. avium 99% 37 - Nessuna ND 38 - Nessuna ND 39 - Nessuna ND 40 - Nessuna ND IDEXX Laboratories, Inc. 14

16 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 41 - Nessuna ND 42 - Nessuna ND 43 - Nessuna ND 44 - Nessuna ND 45 - Nessuna ND 46 - Nessuna ND 47 - Nessuna ND 48 - Nessuna ND 49 - Nessuna ND 50 - Nessuna ND 51 - Nessuna ND 52 - Nessuna ND 53 - Nessuna ND 54 - Nessuna ND 55 - Nessuna ND 56 - Nessuna ND 57 - Nessuna ND 58 - E. avium 99% 59 - Nessuna ND 60 - Nessuna ND 61 - Nessuna ND 62 - Nessuna ND 63 - Nessuna ND 64 - Nessuna ND 65 - Nessuna ND 66 - Nessuna ND 67 - Nessuna ND 68 - Nessuna ND 69 - Nessuna ND 70 - Nessuna ND 71 - Nessuna ND 72 - Nessuna ND 73 - Nessuna ND 74 - Nessuna ND 75 - Nessuna ND 76 - Nessuna ND 77 - Nessuna ND 78 - Nessuna ND 79 - Nessuna ND 80 - Nessuna ND 81 - Nessuna ND IDEXX Laboratories, Inc. 15

17 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 82 - Nessuna ND 83 - Nessuna ND 84 - Nessuna ND 85 - Nessuna ND 86 - Nessuna ND 87 - Nessuna ND 88 - Nessuna ND 89 - E. avium 99% 90 - Nessuna ND 91 - Nessuna ND 92 - Nessuna ND 93 - Nessuna ND 94 - Nessuna ND 95 - E. faecalis 99% 96 - Nessuna ND 97 - Nessuna ND 98 - Nessuna ND 99 - Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND E. casseliflavus 99% Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND IDEXX Laboratories, Inc. 16

18 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza E. avium 99% Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND E. faecium 98% Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND IDEXX Laboratories, Inc. 17

19 UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND Nessuna ND IDEXX Laboratories, Inc. 18

20 Appendice III: Incertezza dei conteggi per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray Campione Enterolert-DW/Quanti-Tray in MPN/100 ml Ripetibilità Riproducibilità Analista A Conta 1 Analista A Conta 2 Analista B Conta Analista C Conta Media DS DSR Media DS DSR ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 1,4142 0, ,67 1,1547 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0, ,00 0,0000 0,0000 Somma Somma DSR 0,0011 DSR 0,0008 DSR 0,0061 DSR 0,0051 IDEXX Laboratories, Inc. 19

21 Appendice IV: Valutazione della robustezza di Enterolert-DW con ceppi identificati E. faecium ATCC E. faecalis ATCC E. faecalis ATCC E. durans ATCC E. hirae ATCC 8043 E. mundtii ATCC E. gallinarum ATCC Numero di pozzetti positivi Rip 24 ore 28 ore % variazione % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % IDEXX Laboratories, Inc. 20

22 Appendice V: Tabella degli MPN N. pozzetti Limiti intervallo di confidenza al 95% positivi MPN/100 ml Inferiore Superiore 0 <1,0 0,0 3,7 1 1,0 0,3 5,6 2 2,0 0,6 7,3 3 3,1 1,1 9,0 4 4,2 1,7 10,7 5 5,3 2,3 12,3 6 6,4 3,0 13,9 7 7,5 3,7 15,5 8 8,7 4,5 17,1 9 9,9 5,3 18, ,1 6,1 20, ,4 7,0 22, ,7 7,9 23, ,0 8,8 25, ,4 9,8 27, ,8 10,8 29, ,2 11,9 31, ,7 13,0 33, ,2 14,1 35, ,8 15,3 37, ,4 16,5 39, ,1 17,7 41, ,8 19,0 43, ,6 20,4 46, ,4 21,8 48, ,4 23,3 51, ,4 24,7 53, ,4 26,4 56, ,6 28,0 59, ,9 29,7 62, ,3 31,5 65, ,8 33,4 69, ,4 35,4 72, ,1 37,5 76, ,0 39,7 80, ,1 42,0 84, ,4 44,6 88, ,9 47,2 93, ,7 50,0 99, ,8 53,1 104, ,2 56,4 111, ,1 59,9 118, ,5 63,9 126,2 IDEXX Laboratories, Inc. 21

23 N. pozzetti Limiti intervallo di confidenza al 95% positivi MPN/100 ml Inferiore Superiore 43 94,5 68,2 135, ,3 73,1 146, ,1 78,6 158, ,4 85,0 174, ,8 92,7 195, ,5 102,3 224, ,2 115,2 272, ,5 135,8 387,6 51 > 200,5 146,1 infiniti IDEXX Laboratories, Inc. 22

24 Appendice VI: Intervalli di confidenza del 95% e ripetibilità teorica per ogni valore di MPN per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray a 51 pozzetti N. pozzetti positivi MPN per campione da 100 ml IC al 95% Inferiore Superiore DS ripetibilità (Log 10 SD) Ripetibilità teorica Incertezza standard relativa (CV%) 0 <1,0 0,0 3, ,0 0,3 5,6 0, ,0 2 2,0 0,6 7,3 0, ,7 3 3,1 1,1 9,0 0, ,7 4 4,2 1,7 10,7 0, ,0 5 5,3 2,3 12,3 0, ,7 6 6,4 3,0 13,9 0, ,9 7 7,5 3,7 15,5 0, ,8 8 8,7 4,5 17,1 0, ,4 9 9,9 5,3 18,8 0, , ,1 6,1 20,5 0, , ,4 7,0 22,1 0, , ,7 7,9 23,9 0, , ,0 8,8 25,7 0, , ,4 9,8 27,5 0, , ,8 10,8 29,4 0, , ,2 11,9 31,3 0, , ,7 13,0 33,3 0, , ,2 14,1 35,2 0, , ,8 15,3 37,3 0, , ,4 16,5 39,4 0, , ,1 17,7 41,6 0, , ,8 19,0 43,9 0, , ,6 20,4 46,3 0, , ,4 21,8 48,7 0, , ,4 23,3 51,2 0, , ,4 24,7 53,9 0, , ,4 26,4 56,6 0, , ,6 28,0 59,5 0, , ,9 29,7 62,5 0, , ,3 31,5 65,6 0, , ,8 33,4 69,0 0, , ,4 35,4 72,5 0, , ,1 37,5 76,2 0, , ,0 39,7 80,1 0, ,0 IDEXX Laboratories, Inc. 23

25 N. pozzetti positivi MPN per campione da 100 ml IC al 95% Inferiore Superiore DS ripetibilità (Log 10 SD) Ripetibilità teorica Incertezza standard relativa (CV%) 35 59,1 42,0 84,4 0, , ,4 44,6 88,8 0, , ,9 47,2 93,7 0, , ,7 50,0 99,0 0, , ,8 53,1 104,8 0, , ,2 56,4 111,2 0, , ,1 59,9 118,3 0, , ,5 63,9 126,2 0, , ,5 68,2 135,4 0, , ,3 73,1 146,0 0, , ,1 78,6 158,7 0, , ,4 85,0 174,5 0, , ,8 92,7 195,0 0, , ,5 102,3 224,1 0, , ,2 115,2 272,2 0, , ,5 135,8 387,6 0, ,2 51 > 200,5 146,1 infiniti - - IDEXX Laboratories, Inc. 24

26 Appendice VII:Enterolert-DW vs. ISO e MoDW 2006, parte 5, risultati del recupero relativo Numero campione Matrice campioni trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 25

27 Numero campione Matrice campioni trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 26

28 Numero campione Matrice campioni trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 27

29 Numero campione Matrice campioni trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 28

30 Numero campione Matrice campioni trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 29

31 Numero campione Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 30

32 Numero campione Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 31

33 Numero campione Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 32

34 Numero campione Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 33

35 Numero campione Matrice campioni non trattati con cloro Enterolert-DW (MPN/100 ml) ISO MoDW 2006, parte IDEXX Laboratories, Inc. 34