gennaio 2008 Validazione di Colilert -18/Quanti-Tray per l enumerazione di E. coli e batteri coliformi in acqua

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1 Validazione di Colilert -/Quanti-Tray per l enumerazione di E. coli e batteri coliformi in acqua gennaio 2 One IDEXX Drive Westbrook, Maine 42 USA idexx.com 2 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved All /TM marks are owned by IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or other countries.

2 Validazione di Colilert-/Quanti-Tray per l enumerazione di E. coli e batteri coliformi in acqua IDEXX LABORATORIES, INC ONE IDEXX DRIVE WESTBROOK, MAINE 42 USA VERSIONE FINALE CORRETTA 3 gennaio 2

3 Validazione di Colilert -/Quanti-Tray per l enumerazione di E. coli e batteri coliformi in acqua 1 Introduzione Il metodo Colilert -/Quanti-Tray è un test appositamente studiato per l enumerazione MPN di E. coli e batteri coliformi in acqua potabile ed altre acque simili, trattate e non trattate. Colilert- rileva simultaneamente E. coli e coliformi totali in acqua. È basato su tecnologia DST (Defined Substrate Technology). Il reagente DST è mescolato con 1 ml di campione e incubato come test di presenza/assenza (PA), oppure come test MPN (Most Probable Number, numero più probabile). Quando i batteri coliformi metabolizzano il nutriente indicatore ONPG, il campione diventa giallo. Quando l E. coli metabolizza un secondo nutriente indicatore, il MUG, il campione diventa fluorescente sotto illuminazione UV. Colilert- consente la rilevazione contemporanea di questi batteri a 1 cfu/1ml entro ore, in presenza di un numero di batteri eterotrofi fino a 2 x 1 6 per campione da 1 ml. Quanti-Tray è stato studiato per la realizzazione di conte batteriche quantitative da campioni di 1 ml utilizzando reagenti DST. La miscela reagente/campione viene inserita in una sacca Quanti-Tray, poi chiusa mediante il sigillatore Quanti-Tray Sealer e messa in incubatrice. La sacca è realizzata in modo da presentare 51 pozzetti di miscela reagente/campione dopo la sigillatura. Il sigillatore è uno strumento a rulli riscaldati azionato a motore, progettato per sigillare Quanti-Tray. Viene conteggiato il numero di pozzetti positivi e, con l ausilio di un apposita tabella, viene determinato l MPN dei batteri coliformi e/o di E. coli. 2 Applicazioni di Colilert -/Quanti-Tray Colilert -/Quanti-Tray è stato ideato in primo luogo per l analisi dell acqua potabile e di acque simili. Con questa funzione è largamente approvato in Nord America (Stati Uniti, Canada e Messico), in Sud America (Brasile, Argentina, Cile e Colombia), in Europa (Danimarca, Germania, Ungheria, Islanda, Irlanda, Italia, Norvegia, Spagna e Regno Unito) e in Estremo Oriente (Giappone e Corea). È inoltre approvato per l analisi delle acque in bottiglia dalla International Bottled Water Association e di acqua purificata per uso farmaceutico dalla US Pharmacopeial Convention. Negli Stati Uniti, inoltre, è stato approvato dall USEPA per la rilevazione di batteri coliformi ed E. coli dall analisi di acque sorgive e sotterranee, e per l enumerazione di E. coli dall analisi di acque ambientali, a scopo ricreativo e di scarico. 3 Identificazione degli organismi target (ISO/TR 43 sezioni e.2) Nel metodo Colilert -/Quanti-Tray, per batteri coliformi si intendono i batteri che producono una colorazione gialla mediante l azione della β-galattosidasi sulla ortonitrofenil-β-d-galattosidasi (ONPG), mentre per E. coli si intendono i batteri coliformi che producono, inoltre, una fluorescenza blu sotto illuminazione UV tramite l azione della β-glucuronidasi sul 4-metilumbelliferil-β-D-glucuronide (MUG). 3.1 La sfida della coltura pura (ISO/TR 43 sezione 1.2.1) Le definizioni delle reazioni per batteri target e non target sono state confermate sfidando Colilert -/Quanti-Tray con colture pure di ceppi di riferimento di E. coli, 1

4 batteri coliformi e batteri non coliformi gram-negativi presi dalla Raccolta di colture di tipo americano. Le reazioni tipiche di questi ceppi di riferimento sono riportate nella Tabella 1. Questi ceppi vengono utilizzati da IDEXX per il normale controllo qualità di Colilert-/Quanti-Tray. Tabella 1 Ceppi di riferimento di E. coli, batteri coliformi e batteri gramnegativi non target utilizzati per confermare le tipiche reazioni positive e negative in Colilert -/Quanti-Tray Batterio N. ATCC* Reazione in Colilert- Escherichia coli 2522 Colorazione giallo intenso Forte fluorescenza blu sotto UV Citrobacter freundii Colorazione giallo intenso Nessuna fluorescenza sotto UV Klebsiella pneumoniae 3 Colorazione giallo intenso Nessuna fluorescenza sotto UV Enterobacter aerogenes 4 Colorazione giallo intenso Nessuna fluorescenza sotto UV Pseudomonas aeruginosa 15 Nessuna crescita Nessuna colorazione gialla Nessuna fluorescenza sotto UV Aeromonas hydrophila Nessuna crescita Nessuna colorazione gialla Nessuna fluorescenza sotto UV * Raccolta di colture di tipo americano 3.2 Studi di sensibilità, specificità e selettività (ISO/TR 43 sezione.2) In termini di metodiche microbiologiche, ISO/TR 43 fornisce la definizione di queste caratteristiche di seguito riportata: Sensibilità frazione dei positivi totali correttamente assegnata nel conteggio presuntivo; Sensibilità frazione dei negativi totali correttamente assegnata nella conta presuntiva; Selettività - rapporto fra il numero di colonie target e il numero totale di colonie nel volume del campione. Per Colilert-/Quanti-Tray, queste caratteristiche sono collegate al numero di pozzetti positivi per i coliformi o l E. coli che effettivamente contenevano batteri target e al numero di pozzetti realmente negativi per i batteri target. La valutazione della sensibilità, della specificità e della selettività di Colilert-/Quanti-Tray è stata ottenuta attraverso l identificazione degli isolati positivi di β-galattosidasi e β- glucuronidasi dai pozzetti positivi generati utilizzando campioni naturali ottenuti aggiungendo acque di fiume all acqua potabile declorinata. Per ottenere campioni di acqua potabile declorinata mischiata da 1 litro sono state utilizzate tre sorgenti di acqua di superficie (due fiumi e un serbatoio di acqua di superficie). Dopo l incubazione, sono stati selezionati 1 pozzetti gialli, ma non fluorescenti, dai 3 campioni (3 5 di ciascuno). Questi ultimi sono stati selezionati in modo da garantire l inclusione di tutte le intensità di colore giallo incontrate. Allo stesso modo, sono stati selezionati 1 pozzetti gialli e fluorescenti per coprire tutte le intensità di fluorescenza incontrate. Dei 3 campioni, erano disponibili solo 54 pozzetti negativi, 2

5 due dei quali presentavano una crescita torbida. Le reazioni positive e/o negative alla β-galattosidasi e alla β-glucuronidasi sono state confermate e gli isolati sono stati individuati utilizzando pannelli di identificazione miniaturizzati BBL Crystal E/NF (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) Calcolo dei tassi di falsi negativi, del tasso di falsi positivi, della sensibilità, della specificità, e della selettività I dati di identificazione di ciascun parametro sono stati suddivisi in quattro categorie: a = numero di pozzetti positivi risultati contenere coliformi o E. coli (veri positivi); b = numero di pozzetti negativi risultati contenere coliformi o E. coli (falsi negativi); c = numero di pozzetti positivi risultati non contenere coliformi o E. coli (falsi positivi); d = numero di pozzetti negativi che presentavano crescita e risultavano non contenere coliformi o E. coli (veri negativi); La sensibilità, la specificità, la selettività, il tasso di falsi positivi e i tassi di falsi negativi per coliformi ed E. coli risultanti dai dati sono stati calcolati nel modo seguente: Sensibilità = a / (a+b) Specificità = d / (c+d) Selettività = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] Tasso falsi positivi = c / (a+c) Tasso falsi negativi = b / (b+d) Un altro parametro, l efficienza (E), che indica la frazione di pozzetti correttamente assegnati, è stato calcolato come E = (a+d) / (a+b+c+d) Coliformi non E. coli Da tutti e 1 i pozzetti gialli, ma non fluorescenti, sottocoltivati, sono stati ottenuti isolati di β-galattosidasi. Non è stata osservata alcuna reazione β-glucuronidasi su queste piastre. Le reazioni dell indolo e dell ossidasi, i profili BBL Crystal E/NF e le identificazioni di questi isolati sono illustrati nell Appendice A1. Tutti sono stati identificati come membri β-galattosidasi positivi e β-glucuronidasi negativi degli enterobatteri diversi dall E. coli. In totale sono state recuperate 23 specie di coliformi (Tabella 2) E. coli Da tutti e 1 i pozzetti gialli fluorescenti sottocoltivati, sono stati ottenuti isolati di β- glucuronidasi. Le reazioni dell indolo e dell ossidasi, i profili BBL Crystal E/NF e le identificazioni di questi isolati sono illustrati nell Appendice A2. Novantanove isolati sono stati identificati come E. coli. L isolato restante è stato identificato come Klebsiella oxytoca. Questo isolato presentava una reazione β-glucuronidasi positiva nel proprio pannello Crystal E/NF Pozzetti negativi 3

6 Sono stati sottocoltivati quarantaquattro pozzetti negativi, di cui soltanto due presentavano una crescita. Questi due pozzetti producevano colonie β-galattosidasi e β-glucuronidasi negative che erano ossidasi positive e indolo negative (Appendice A3). Entrambe sono state identificate come Shewanella putrefaciens dal sistema BBL Crystal E/NF. Dai restanti 52 pozzetti non si è avuta alcuna crescita. Tabella 2 Identificazione di batteri coliformi (numero di isolati) recuperati da pozzetti coliformi non E. coli positivi di Colilert -/Quanti-Tray Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata () Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera ascorbata (3) Citrobacter amalonaticus (1) Leclercia adecarboxylata (1) Enterobacter aerogenes Pantoea agglomerans () Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1) Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (3) Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1) Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1) Escherichia vulneris (4) Serratia fonticola (4) Hafnia alvei (1) Serratia fonticola (1) Klebsiella oxytoca (4) Serratia fonticola (1) Klebsiella oxytoca (6) 3.3 Identificazione delle caratteristiche legate alla sensibilità e alla specificità Batteri coliformi Nell ambito del test Colilert-/Quanti-Tray, i coliformi sono organismi che producono una colorazione gialla con o senza fluorescenza e i risultati per i parametri calcolati sono: Sensibilità = a / (a+b) = 2 / (2+) = 1 Specificità = d / (c+d) = 2 / (+2) = 1 Selettività = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(2+) / (2+++2)] = -,4 Tasso falsi positivi = c / (a+c) = / (2+) = Tasso falsi negativi = b / (b+d) = / (+2) = Efficienza (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (2+2) / (2+++2) = E. coli Nell ambito del test Colilert-/Quanti-Tray, gli E. coli sono organismi che producono una colorazione gialla con o senza fluorescenza e i risultati per i parametri calcolati sono: Sensibilità = a / (a+b) = / (+) = 1 Specificità = d / (c+d) = / (1+) =, Selettività = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(+1) / (++1+)] = -,35 Tasso falsi positivi = c / (a+c) = 1 / (+1) =,1 Tasso falsi negativi = b / (b+d) = / (+) = Efficienza (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (+) / (++1+) =,5 I risultati delle analisi dei dati mostrano che per i batteri coliformi il metodo Colilert- /Quanti-Tray è altamente sensibile e specifico, con un tasso zero di falsi positivi e 4

7 falsi negativi. Il metodo, inoltre, è molto selettivo con un valore di -4, che risulta molto migliore del valore guida di -1 indicato da ISO/TR 43 per i metodi per la conta delle colonie. Il metodo si può dire molto efficace per i batteri coliformi, con un valore di efficacia pari a 1. I dati di identificazione mostrano che Colilert-/Quanti-Tray recupera un ampia gamma di batteri coliformi. Anche per l E. coli, il test Colilert-/Quanti-Tray è molto sensibile e specifico. La selettività (-,35) è inferiore a quella dei batteri coliformi, come ci si aspetterebbe da un sistema di test doppio in cui l E. coli è un sottoinsieme del gruppo dei batteri coliformi. Il valore è migliore anche rispetto al valore guida di ISO/TR 43. Il metodo è molto efficace (E =,5) per la rilevazione di E. coli. 4 Incertezza della conta (ISO 43 sezione e Allegato B) La ripetibilità e la riproducibilità sono due stime dell affidabilità che è possibile ottenere con un metodo analitico. Utilizzando adeguati campioni naturali, possono rappresentare una valutazione dell intero metodo o dell incertezza della conta insieme alla lettura dei risultati di un metodo. Il risultato prodotto da qualsiasi metodo dipende dalla facilità con cui gli analisti possono eseguire una conta di colonie o di reazioni MPN positive. Questa sarà influenzata dalle caratteristiche della morfologia delle colonie di organismi target e non target su un agar di enumerazione, oppure dalla chiarezza delle reazioni positive e negative nei test MPN a base di terreno di coltura. Di conseguenza, le valutazioni dell incertezza della conta possono dare un indicazione di qualsiasi potenziale problema che potrebbe verificarsi a seguito dell ampio utilizzo di un metodo. La ripetibilità (r) e la riproducibilità (R) vengono definite come segue: Ripetibilità Riproducibilità prossimità di accordo fra i risultati di misurazioni successive della stessa misura e svolte nelle medesime condizioni prossimità di accordo fra i risultati di misurazioni sulla stessa misura e svolte in condizioni differenti Nel caso della conta di colonie microbiologiche su piastra agar o reazioni positive in un test MPN, le medesime o differenti condizioni sono rappresentate dall analista che esegue la conta. Pertanto, in questo contesto, la ripetibilità è l accordo fra le conte ottenute con conteggi ripetuti da parte dello stesso analista, mentre la riproducibilità è l accordo fra le conte ottenuto con conteggi ripetuti da parte di due o più analisti. La valutazione della riproducibilità è generalmente più informativa della valutazione della ripetibilità. L Allegato B di ISO/TR 43 fornisce delle linee guida sulla valutazione della ripetibilità e della riproducibilità del conteggio utilizzando deviazioni standard relative (DSR) di conte ripetute. Inoltre, vi è la raccomandazione che, quando si utilizzano colture pure, le DSR siano idealmente <,2 (vale a dire non oltre la deviazione del 2%). Studi sull incertezza dei conteggi sono stati condotti da analisti di IDEXX e i dati sono illustrati nell Appendice B. Il conteggio è stato eseguito in modo che ciascun analista non fosse a conoscenza delle conte degli altri analisti e gli MPN risultanti sono stati registrati come numeri interi. Le DSR calcolate dagli MPN di Colilert- /Quanti-Tray, inoculati con coliforme tipico (Klebsiella pneumoniae ATCC 336) ed E. coli (ATCC 2522) erano: Klebsiella pneumoniae Ripetibilità =,22 Riproducibilità =,2 5

8 Escherichia coli Ripetibilità =, Riproducibilità =,7 I valori del coliforme tipico sono dell ordine del valore guida di <,2 (ISO/TR 43 sezione B1), mentre quelli per E. coli sono molto al di sotto del valore guida, il che indica come sia possibile ottenere un conteggio MPN affidabile per Klebsiella pneumoniae ed E. coli con Colilert-/Quanti-Tray. 5 Robustezza sensibilità al tempo (ISO/TR 43 sezioni e B.4) Due aspetti relativi alla robustezza riguardano Colilert -/Quanti-Tray. Si tratta del periodo di incubazione raccomandato di -22 ore e della durata del prodotto fino a 15 mesi con immagazzinamento a 4-25 C per il mezzo di Colilert-. Nell Appendice C sono illustrate le conte replicate delle analisi delle sospensioni di bassi numeri di colture di riferimento di E. coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii dopo un incubazione di e 22 ore per lo stesso lotto di Colilert- immagazzinato per un periodo fino a 541 giorni a 25 C. 5.1 Robustezza dei tempi di incubazione Si sono avuti 4 risultati accoppiati per le conte dopo incubazione di e 22 ore. Per E. coli, tutte e 4 le conte accoppiate erano le stesse dopo i due tempi di incubazione, mentre per Klebsiella pneumoniae 47 conte (il %) erano le stesse e la conta accoppiata rimanente mostrava un aumento di un solo pozzetto positivo dopo incubazione di 22 ore. Ad ogni modo, per Citrobacter freundii vi erano conte aumentate dopo incubazione di 22 ore rispetto all incubazione di ore di campioni (il 27%). Tutte queste conte più elevate, tranne una, erano aumenti di solo uno o due pozzetti positivi. Questo ceppo di Citrobacter sembra mostrare un tasso di crescita relativamente più basso o una cinetica degli enzimi più debole rispetto agli altri batteri testati. I dati indicano che per E. coli e batteri coliformi robusti, quali Klebsiella pneumoniae, il periodo di incubazione raccomandato di -22 ore è robusto, ma che per alcuni batteri coliformi a crescita più lenta o produttori di enzimi deboli, può esserci un aumento delle conte dopo un incubazione di 22 ore rispetto a un incubazione di ore. L aumento delle conte in un periodo di incubazione stabilito (per es. -24 ore per i tipici metodi a filtrazione di membrana quali ISO 3-1) è un fenomeno noto, soprattutto con i coliformi ambientali. Tuttavia, per considerazioni pratiche e operative, le conte dopo un incubazione di ore sono considerate accettabili, purché l aumento delle conte dopo un incubazione prolungata non sia eccessivo. 5.3 Robustezza dell immagazzinamento di Colilert - Il mezzo di Colilert - ha una durata dichiarata di mesi, immagazzinato a 4-25 C. I dati dei tre batteri testati con lo stesso lotto di mezzo immagazzinato a 25 C non mostrano alcuna differenza di prestazioni con un immagazzinamento fino a 541 giorni, ben oltre l anno previsto. Si è scelta una temperatura di immagazzinamento più elevata in modo da mettere alla prova la stabilità del mezzo di Colilert- più di quanto non lo fosse con un immagazzinamento a temperature di refrigerazione. 6 Limite di esercizio superiore (ISO/TR 43 sezioni e 6.3.3) 6

9 Il test Colilert -/Quanti-Tray è un metodo MPN con una gamma di conteggio arbitraria da a 21, fissata dal numero di pozzetti della sacca Quanti-Tray. In base a ISO/TR 43 sezione 6.3.3, per ragioni pratiche e statistiche, non è possibile stabilire alcun limite superiore per i metodi MPN poiché la precisione non dipende semplicemente dal numero di particelle introdotte nel set di rilevazione. 7 Precisione (ISO/TR 43 sezioni e.5.5) La precisione di un metodo MPN viene descritta dagli intervalli di confidenza del 5% calcolati per ciascun valore MPN (ISO/TR 43 sezione.5.5). Gli intervalli di confidenza per le conte di Colilert -/Quanti-Tray, calcolati utilizzando il programma messo a disposizione on-line dal Bacteriological Analytical Manual (BAM) della US Food and Drug Administration (FDA) ( sono riportati nell Appendice D. Una ripetibilità teorica per ciascun MPN può derivare dall MPN e dai suoi intervalli di confidenza. Nell Appendice D, inoltre, sono illustrati i valori di incertezza relativi per ciascun MPN (log 1 SD, calcolato dai valori degli intervalli di confidenza MPN del 5%) e la ripetibilità (incertezza standard relativa) come coefficienti di variazione (CV%). Questi valori Poisson possono essere utilizzati come valori minimi di precisione a cui è possibile combinare tutti i dati pertinenti posseduti da un laboratorio (per es. alla variazione della decantazione del volume del test o dell incertezza del conteggio) allo scopo di ottenere una stima complessiva di ripetibilità per ciascun MPN. Bibliografia.1 Standard ISO ISO 3-1:2 Qualità dell acqua Rilevazione ed enumerazione di Escherichia coli e batteri coliformi Parte 1: Metodo di filtrazione a membrana. Ginevra: International Organisation for Standardization. ISO/TR 43:2(E) Qualità dell acqua Linee guida sulla validazione dei metodi microbiologici. Ginevra: International Organisation for Standardization. 7

10 Appendice A Dati degli studi di sensibilità, specificità e selettività (v. Sezione 3.2) Appendice A1 Identificazione di isolati da pozzetti gialli ma non fluorescenti di Colilert -/Quanti-Tray Rif. isolati Ossidasi Indolo Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza Y Enterobacter sakazakii,561 Y Pantoea agglomerans,72 Y Kluyvera cryocrescens,2 Y Enterobacter cloacae,62 Y Kluyvera cryocrescens,627 Y Pantoea agglomerans,77 Y Klebsiella oxytoca,25 Y Pantoea agglomerans,41 Y Kluyvera ascorbata,264 Y Enterobacter cloacae,6 Y Citrobacter freundii,335 Y Enterobacter cloacae,26 Y Enterobacter sakazakii,6 Y Kluyvera ascorbata,25 Y Kluyvera ascorbata,72 Y Escherichia vulneris,5764 Y Pantoea agglomerans,32 Y Klebsiella oxytoca,524 Y Serratia liquefaciens,57 Y Enterobacter cloacae,43 Y Cedecea lapagei,35 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter sakazakii,734 Y Leclercia adecarboxylata, Y Klebsiella pneumoniae,154 Y Pantoea agglomerans,776 Y Serratia rubidaea,42 Y Enterobacter asburiae,54 Y Serratia liquefaciens,5545 Y Kluyvera ascorbata,2 Y Klebsiella oxytoca,555 Y Enterobacter cloacae,7 Y Enterobacter cloacae,61 Y Citrobacter freundii, Y Citrobacter freundii,4 Y Pantoea agglomerans,76 Y Citrobacter freundii,73 Y Klebsiella pneumoniae,241 Y Klebsiella pneumoniae,4 Y Escherichia vulneris,475 Y Enterobacter cloacae,43 Y Enterobacter cloacae,673 Y Kluyvera ascorbata,25

11 Y Enterobacter sakazakii,1 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Kluyvera ascorbata,43 Y Klebsiella pneumoniae,53 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cancerogenus,533 Y Kluyvera cryocrescens,422 Y Enterobacter aerogenes,747 Y Citrobacter freundii,62 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cloacae,6 Y Enterobacter cloacae,4 Y Serratia plymuthica,677 Y Serratia odorifera,763 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Enterobacter cloacae,627 Y Enterobacter cloacae,6 Y Kluyvera ascorbata,64 Y Kluyvera ascorbata,3 Y Enterobacter sakazakii,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Enterobacter cloacae,37 Y Enterobacter cloacae,62 Y Serratia plymuthica,32 Y Enterobacter cloacae,21 Y Serratia plymuthica,677 Y Citrobacter freundii,6 Y Serratia fonticola,33 Y Enterobacter cloacae,6 Y Klebsiella pneumoniae,1 Y Escherichia vulneris,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Serratia liquefaciens,61 Y Citrobacter freundii,7 Y Serratia marcescens,547 Y Enterobacter cloacae,72 Y Hafnia alvei,47 Y Kluyvera ascorbata,42 Y Klebsiella oxytoca,715 Y Enterobacter cloacae,226 Y Enterobacter cloacae,7434 Y Kluyvera ascorbata,76 Y Serratia plymuthica,32 Y Kluyvera ascorbata,34 Y Citrobacter freundii, Y Escherichia vulneris,6454 Y Klebsiella pneumoniae,54 Y Pantoea agglomerans,656 Y Serratia spp,,46

12 Y Enterobacter cloacae,57 Y Citrobacter freundii,771 Y Kluyvera ascorbata,36 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter cloacae,4 Y Citrobacter freundii,4 1

13 Appendice A2 Identificazione di isolati da pozzetti gialli e fluorescenti di Colilert -/Quanti-Tray Rif. isolati Ossidasi Indolo Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza F Escherichia coli. F Escherichia coli,737 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,

14 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,35 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,3 F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli,

15 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Klebsiella oxytoca,746

16 Appendice A3 Identificazione di isolati da pozzetti negativi di Colilert - /Quanti-Tray Rif. β-gal β-gal Ossidas Profilo Crystal Indolo isolati i E/NF Identificazione Confidenza N1 N2 N3 N Shewanella putrefaciens,4 N5 N6 N7 N N N1 N N N N N15 N N Shewanella putrefaciens,4 N N1 N2 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N2 N2 N3 N31 N32 N33 N34 N35 N36 N37 N3 N3 N4 N41 N41 N43 N44 N45 N46

17 N47 N4 N4 N5 N51 N52 N53 N54 15

18 Appendice B Dati degli studi sull incertezza dei conteggi (v. Sezione 4) Appendice B1 Incertezza dei conteggi per MPN* di pozzetti gialli non fluorescenti di Colilert -/Quanti-Tray inoculati con Klebsiella pneumoniae ATCC 336 * MPN (Most Probable Number, numero più probabile) registrato come numero intero Campio ne Analista A Lettura 1 Analista A Lettura 2 Analista B Lettura Analista C Lettura Ripetibilità Riproducibilità MPN MPN MPN MPN Media Dev St DSR sq Media Dev St DSR sq ,,, 2,,, ,,, 6,,, ,,, 1,,, 4,,,,,, ,,, 36,,, ,,, 34,67 1,1547, ,,, 31,,, ,,, 27,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,, 41,,, ,,, 4,,, ,,, 56,,,,,,,,, ,,, 7,,, , 2,24, 6,67 2,34, ,,, 1,,, 7 3,5 7,772,7 5,33 6,35, ,,, 5,,, ,,, 5,,, 21 5, 4,2426,1, 3,4641, , 4,2426,24 7, 3,4641, ,,, 1,,, ,,,,33 4,6, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, Somma DSR,7 Somma DSR,5 DSR,221 DSR,24

19 Appendice B2 Incertezza dei conteggi per MPN di pozzetti gialli non fluorescenti di Colilert -/Quanti-Tray inoculati con E. coli ATCC 2522 * MPN (Most Probable Number, numero più probabile) registrato come numero intero Campio ne Analista A Lettura 1 Analista A Lettura 2 Analista B Lettura Analista C Lettura Ripetibilità Riproducibilità MPN MPN MPN MPN Media Dev St DSR sq Media Dev St DSR sq ,,, 6,,, 2,,,,,, 3,,,,,, ,,, 2,,, ,,, 32,,, ,,, 21,,, ,,, 36,,, ,,, 32,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,,, 4,,, ,,, 46, 1,7321, ,,, 7,,, ,,, 7,,, ,,, 66,,, ,,, 7,,, ,,, 5,,, ,,, 1,,, 1,,,,,, 2,,,,,, 21,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 7,,, ,,, 74,,, ,,, 1,,, 26,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, 2,,,,,, 3,,,,,, Somma DSR, Somma DSR, DSR, DSR,6

20 Appendice C Conte replicate da sospensioni di E. coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii di Colilert -/Quanti-Tray dopo un incubazione di e 22 ore utilizzando Colilert- immagazzinato a 25 C per un massimo di 541 giorni (v. Sezione 5) Postproduzione giornaliera h 22 h Numero di pozzetti positivi Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii % % cambia h 22 h cambia h 22 h mento mento % % cambia mento + 5 % + % + % + 1 % + % + 1 % + % + 5 % + 25 % + 15 % + %

21 % + % 1

22 Appendice D Intervalli di confidenza del novantacinque per cento e ripetibilità teoriche per ogni valore MPN per Colilert -/Quanti- Tray a 51 pozzetti (v. Sezione 7) N. di pozzetti con reazione positiva MPN per campione da 1 ml Intervalli di confidenza del 5% Ripetibilità teorica Deviazione standard Inferiore Superiore ripetibilità Log 1 SD <1,, 3,7 - - Incertezza standard relativa CV% 1 1,,3 5,6,4343 1, 2 2,,6 7,3,371 7,7 3 3,1 1,1,,25 57,7 4 4,2 1,7 1,7,22 5, 5 5,3 2,3,3,143 44,7 6 6,4 3,,,74 4, 7 7,5 3,7 15,5,43 37,,7 4,5,1, ,4, 5,3,,5 33, ,76 31,7,4 7, 22,1, 3,2,7 7, 23,,57 2, 15,, 25,7, 27,,4, 27,5,16 26, 15, 1, 2,4,27 26, 1,2, 31,3,12 25,1 2,7, 33,3,1 24,4 22,2,1 35,2,2 23, 1 23, 15,3 37,3,15 23,1 2 25,4,5 3,4,1 22, ,1,7 41,6,5 22,1 22 2, 1, 43,,3 21,6 23 3,6 2,4 46,3,1 21, ,4 21, 4,7,2 2, 25 34,4 23,3 51,2,5 2, ,4 24,7 53,,7 2, 27 3,4 26,4 56,6,56 1,7 2 4,6 2, 5,5,43 1,4 2 42, 2,7 62,5,3 1,1 3 45,3 31,5 65,6,1, 31 47, 33,4 6,,,6 32 5,4 35,4 72,5,7, ,1 37,5 76,2,71, , 3,7,1,73, 35 5,1 42, 4,4,776, 2

23 36 62,4 44,6,,77, , 47,2 3,7,765,6 3 6,7 5,,,761,5 3 73, 53,1,,75,4 4 7,2 56,4 1,2,756,4 41 3,1 5,,3,756,4 42,5 63, 6,2,757,4 43 4,5 6,2 5,4,761,5 44,3 73,1 6,,76,7 45 1,1 7,6 15,7,77, 46,4 5, 4,5,74,3 47, 2,7 15,,1, 4 4,5,3 224,1,5 1, 4 5,2 5,2 272,2,2 21,4 5 2,5 5, 37,6,14 25,2 51 > 2,5 6,1 infiniti