con la presente sono ad inviarle i risultati preliminari relativi al piano di prove concordato.

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1 Spett.le Elbi S.p.A. Via Buccia, 9 Limena (PD) Italy C.A. Dr. Alberto Sichel Padova, 10 marzo 2016 Oggetto: risultati preliminari del programma di prove sperimentali finalizzate alla valutazione in vitro dell attività antibatterica di dispositivi metallici redox in relazione al potenziale utilizzo nella disinfezione delle acque Egr. Dr. Sichel, con la presente sono ad inviarle i risultati preliminari relativi al piano di prove concordato. Cordiali saluti. Dr.ssa Tatjana Baldovin, PhD Ricercatore Universitario Confermato Laboratorio di Igiene e Sanità Pubblica Via Loredan, Padova Tel (lab.) Fax tatjana.baldovin@unipd.it

2 Valutazione in vitro dell attività antibatterica di dispositivi metallici redox denominati NOXIDEL in relazione al loro potenziale utilizzo nella disinfezione delle acque Introduzione In questo documento sono riportati i risultati preliminari delle prove di laboratorio finalizzate all analisi di efficacia dei dispositivi metallici redox NOXIDEL (nel seguito device) sull abbattimento della carica di sospensioni batteriche in acqua. Allo scopo, l attività antibatterica è stata valutata sui seguenti batteri patogeni: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium (gram +), Candida albicans (lievito), al variare della temperatura (10 C, 20, 37 C, 44 C) e del tempo di contatto con il device in esame. Protocollo operativo Nello svolgimento delle prove è stato seguito il seguente protocollo operativo: Preparazione preliminare di una coltura batterica stock da ceppo batterico ATCC conservata a +4 C; Semina per superficie in piastra Petri su adatto terreno colturale e successiva incubazione; Preparazione di una sospensione batterica madre in SF (100 ml) con concentrazione pari a 10 8 cell/ml misurata con spettrofotometro; Aggiunta delle sospensioni batteriche sottoposte a test (campione e bianco di controllo) in contenitori PET, precedentemente sterilizzati e riempiti con acqua di rubinetto (Vf = 5 L, Cf = 10 6 cell/ml); Lavaggio del device con acqua distillata in condizioni di asepsi e immersione nella sospensione campione; Per ogni tempo di contatto analizzato si è proceduto con: 1/15

3 prelievo di un volume di 4 ml da ciascuna sospensione batterica (campione e bianco di controllo) dopo accurata miscelazione; allestimento di diluizioni seriali (da intero a 10-7 ) in soluzione fisiologica allo 0,9% P/V di NaCl; semina, per inclusione, di ciascuna diluizione (1 ml) in terreno nutritivo Plate Count Agar (PCA, LAB M - UK) in doppio, e successiva incubazione delle piastre nelle condizioni standard di crescita (temperatura e tempo) ottimali per ciascun microrganismo target; Al termine di ogni periodo di incubazione, la stima del numero di microrganismi è stata calcolata attraverso la media delle repliche di semina, tenuto conto del fattore di diluizione e il risultato è stato espresso come Unità Formanti Colonia per ml di volume inoculato; Tutte prove sperimentali sono state condotte su acqua di rete con valutazione del grado di clorazione e conducibilità nell ambito di ogni seduta di sperimentazione. Risultati In allegato sono riportati i grafici dei test più significativi. Conclusioni L analisi preliminare dei risultati, pur non consentendo una valutazione definitiva sull azione battericida, permette, tuttavia, di esprimere alcune considerazioni positive. Nelle condizioni sperimentali di volume, temperatura e concentrazione microbica analizzate, è emerso quanto segue: il device evidenzia un effetto antibatterico sui microrganismi target finora testati (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Candida albicans), sebbene con differenze nell entità dell effetto di abbattimento della carica microbica e nel trend temporale valutato; 2/15

4 l effetto antibatterico è risultato più evidente su E. coli; l effetto si manifesta già nelle prime ore di contatto con il device; per i microrganismi tolleranti alle temperature sperimentali più elevate (44 C), l effetto è maggiore e si manifesta più precocemente (E. coli, Enterococcus f.); alle basse temperature testate (10 C), si rileva un verosimile effetto batteriostatico. Le ulteriori analisi in corso consentiranno di definire meglio i fattori su cui agire per ottimizzare l attività antibatterica nei confronti dei microrganismi che, al momento, sembrano rispondere in maniera meno significativa all azione del device. 3/15

5 Allegato In allegato vengono riportati i grafici relativi all andamento temporale della carica microbica vitale espresso in Unità Formanti Colonie per unità di volume (UFC/ml) e della percentuale di sopravvivenza calcolata come di seguito: dove: V% = ( [UFC/ml] T [UFC/ml] T0 ) 100 V% = Sopravvivenza batterica % (Cell Viability); [UFC/ml] T0 = Unità Formanti Colonie per unità di volume al tempo iniziale T 0 ; [UFC/ml] T = Unità Formanti Colonie per unità di volume al tempo T; 4/15

6 Escherichia coli 5/15

7 6/15

8 7/15

9 Prova dalle 72h fino a 120h 8/15

10 Prova fino a 120h 9/15

11 10/15

12 Sequenza di immagini della prova E. coli a 44 C: confronto tra tempi omologhi 11/15

13 Enterococcus faecium 12/15

14 13/15

15 Candida albicans 14/15