Diagnostica molecolare I

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1 Diagnostica molecolare I Luigi Ruco Antonella Stoppacciaro Sito web: (Societa Italiana di Anatomia Patologica e Citologia)

2 Diagnosi = Capire attraverso, quindi riconoscere ed identificare (classificare) la malattia Diagnosi Clinica Sintomi Segni (Esame obiettivo) Analisi di Laboratorio Diagnostica per immagini Diagnosi Anatomopatologica Alterazioni morfologiche causate dalla malattia nell organo, nel tessuto o nella cellula Alterazioni molecolari causate o associate allo sviluppo della malattia

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4 La malattia come conseguenza di una lesione d organo G.B. Morgagni scrive a Padova il De sedibus et causis morborum per anatomen indagatis che comprende le risultanze delle dissezioni di circa 700 cadaveri di cui descriveva anche la storia dell evolversi dei disturbi in vita. E la prima opera in cui si crea un nesso clinico-patologico, e si attribuisce alla lesione d organo un ruolo centrale nella patogenesi della malattia

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6 Nella seconda metà del 900 si diffonde nella pratica clinica la Surgical Pathology (Anatomia Patologica applicata alla Chirurgia) che consiste nel prelievo chirurgico di frammenti di tessuto a scopo diagnostico biopsia con i quali si allestisce un preparato istologico vetrino che consente di identificare al microscopio ottico specifiche lesioni tissutali e/o cellulari caratteristiche, quindi patognomoniche, delle diverse malattie, di effettuare cioè una diagnosi istologica

7 L esame istologico è una procedura diagnostica molto utilizzata perchè ha: Elevata sensibilita Elevata specificita Basso costo (circa 20 ad esame per il materiale di consumo ed il tempo tecnico) Grado variabile di invasivita

8 Possibili diagnosi radiologiche di un nodulo polmonare unico (spesso reperto occasionale in paziente asintomatico) evidenziato con la TAC Tumore benigno del polmone Tumore maligno del polmone Carcinoma squamocellulare Adenocarcinoma Microcitoma Metastasi polmonare di un tumore maligno insorto in altra sede Organo di origine Istotipo del tumore Processo infiammatorio cronico organizzato (fibrotico) Unica risposta certa: Esame Istologico

9 Agobiopsia Diagnostica M Frustolo agobioptico Agobiopsia TAC-giudata

10 Endoscopia Diagnostica

11 Esame istologico su pezzo operatorio (organo o parte di esso) prelevato chirurgicamente Descrizione macroscopica Forma dell organo (conservata o alterata) Dimensioni nei tre assi Colore e Consistenza Ricerca di lesioni focali (forma, dimensioni, colore e consistenza) Prelievi multipli per esame istologico Sulla lesione Sui margini della resezione chirurgica Stomaco con Ulcera gastrica Rene con Carcinoma del rene

12 La gestione del prelievo bioptico nel laboratorio di anatomia patologica Il 40% degli errori diagnostici avvengono nella fase pre-analitica per difetti organizzativi o di comunicazione

13 La fissazione dei tessuti Il tessuto non fissato va incontro a decomposizione per la digestione proteolitica degli enzimi cellulari e per la putrefazione conseguente alla colonizzazione batterica La formalina (formaldeide) in soluzione acquosa al 10% è il fissativo più comunemente utilizzato Il pezzo da fissare si pone in un barattolo contenente formalina per 4-24 ore (a seconda della dimensione del pezzo) a temperatura ambiente La formalina agisce fissando tra loro le proteine attraverso la formazione di ponti aldeidici, e sterilizzando il frammento attraverso l uccisione dei batteri

14 Il prelievo per l esame istologico Pezzo operatorio Formalina al 10% Biocassette per il processatore di tessuti

15 L inclusione dei tessuti in paraffina L inclusione in paraffina serve ad indurire il frammento in modo da consentire il taglio di sezioni sottili (3-6 µm) con il microtomo La paraffina liquida non è miscibile in acqua, principale costituente dei tessuti, ma è miscibile in xilolo La disidratazione con alcool del pezzo consente di estrarre l acqua e di sostituirla con xilolo Si aggiunge quindi paraffina liquida (55-56 C) che poi solidifica a temperatura ambiente Uno strumento, il processatore di tessuti, compie tutti questi passaggi in modo robotizzato

16 Il processo di inclusione in paraffina

17 Il processatore di tessuti

18 La preparazione dei blocchetti di paraffina per il taglio Paraffina in scaglie Dispensatore di paraffina Formine da inclusione Piastra refrigerata

19 Il taglio delle sezioni istologiche Il frammento di tessuto incluso in paraffina è montato su un supporto di plastica che ne consente l ancoraggio al microtomo (strumento in grado di tagliare sezioni seriate di spessore predeterminato) Le sezioni vengono raccolte dalla lama con un pennello e poste a galleggiare su una superficie d acqua a 37 C Le sezioni vengono raccolte dall acqua con un vetrino e fatte aderire con il calore sprigionato da una piastra calda

20 Il microtomo rotativo consente di tagliare sezioni di 3-6 µm da sezioni incluse in paraffina

21 L operazione di taglio al microtomo Pennelli per raccogliere le fettine Bagno termostatato raccogli-fette Piastra riscaldata stendi-fette

22 In passato una delle criticità era costituita dalla perdita del filo della lama. Oggi si utilizza un portalame su cui si inseriscono lamette a perdere Porta-lame Lamette a perdere

23 La colorazione delle sezioni istologiche Le sezioni istologiche sono trasparenti ed incolori, quindi necessitano di una colorazione per la visione al microscopio L ematossilina è un colorante basico che si lega alle molecole acide (soprattutto DNA dei nuclei) colorandole in blu L eosina è un colorante acido che si lega alle molecole basiche (proteine del citoplasma) colorandole in rosa Per consentire l azione di ematossilina ed eosina occorre però eliminare la paraffina dalle sezioni (sparaffinare) con una procedura inversa a quella già attuata e cioè, xilolo, alcool, acqua

24 La colorazione delle sezioni montate su vetrini E necessario effettuare il percorso inverso, dalla paraffina all alcool, per consentire la permeabilizzazione delle sezioni di tessuto ai coloranti Coloratore automatico Montavetrini automatico

25 Comparsa nel tempo delle colorazioni istochimiche

26 Biopsia epatica con epatite cronica colorata con E&E

27 La conservazione del materiale Il tessuto immerso in formalina si conserva per lunghissimi periodi di tempo (ad es. barattoli con reperti rari nei musei di anatomia patologica). Tuttavia, il protrarsi dell azione della formalina provoca un progressivo mascheramento dei siti antigenici e danneggia il DNA. Importanza della pre-analitica nella determinazione dei risultati Il tessuto incluso in paraffina si conserva per oltre 100 anni a temperatura ambiente conservando intatte le sue antigenicità (se opportunamente fissato) I preparati istologici montati su un vetrino porta-oggetti e protetti da un vetrino coprioggetti si conservano anch essi per lunghissimi periodi di tempo. Se esposti alla luce tendono a scolorirsi Il Ministero della Salute ha previsto l obbligo di conservazione di vetrini/inclusioni presso i laboratori di anatomia patologica per un periodo minimo di 10 anni a tutela del paziente (recidive di malattia, approfondimenti diagnostici) Gli archivi di inclusioni in paraffina dei laboratori di anatomia patologica costituiscono delle ricchissime collezioni di tessuti patologici ben conservati, e potenzialmente utili per ulteriori studi molecolari

28 L archiviazione del materiale (Istoteca) Cassettiera portavetrini Cassettiera portainclusioni

29 Tipi di esame istologico Esame istologico su tessuto incluso in paraffina: L intero processo richiede ore La qualità dei preparati istologici è molto buona Esame istologico su tessuto congelato: Si effettua su frammenti di tessuto induriti per congelamento, tagliati al criostato e colorati con ematossilina-eosina L intero procedura dura minuti La qualità dei preparati istologici è meno buona

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32 Il criostato: consente di tagliare sezioni sottili di tessuti congelati

33 Il pozzetto raffreddato del criostato

34 Criostato Paraffina

35 Tessuti più frequentemente sottoposti ad esame istologico intra-operatorio

36 I frammenti di tessuto congelato si conservano in cassettiere refrigerate a -80 C

37 Paraffina verso criostato La paraffina conferisce al tessuto una consistenza omogenea che facilita il taglio delle sezioni L assenza di fissazione e la presenza disomogenea di acqua nei tessuti congelati ne rendono più difficoltoso il taglio e pregiudicano la qualità delle sezioni La fissazione in formalina e l esposizione a 56 C causano la perdita di antigenicità in molte proteine, e la distruzione dell RNA, limitando l uso dell immunoistochimica e della biologia molecolare Il congelamento preserva inalterato l RNA e tutte le antigenicità del tessuto

38 Criticità tecniche nell allestimento di un preparato istologico Accorciamento dei tempi di allestimento Incremento dei livelli di automazione nelle procedure Miglioramento della qualità del preparato istologico Limitazione dell errore Limitazione dell uso di sostanze tossiche Contenimento dei costi

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40 Pap test Citoaspirato della tiroide

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42 Scansione del vetrino per la telepatologia