M.OTTICO A LUCE TRASMESSA M.FLUORESCENZA

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1 M.OTTICO A LUCE TRASMESSA M.FLUORESCENZA

2 UNITÀ DI MISURA BIOLOGICHE E POTERE DI RISOLUZIONE Il potere di risoluzione dell occhio umano è 0.2 mm (200 µm) Il potere di risoluzione del microscopio ottico arriva circa a 0.2µm (200nm) Il limite di risoluzione del microscopio elettronico è 0.2nm

3 ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO Per un esame dei tessuti è necessario allestire preparati istologici mediante: PRELIEVO, FISSAZIONE, SEZIONAMENTO in fettine di minimo spessore e COLORAZIONE selettiva che permette un aumento di contrasto delle diverse strutture cellulari.

4 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO PRELIEVO DEI TESSUTI OCCORRENTE TEMPO Su animali anestetizzati o sacrificati in modo indolore, o su materiale proveniente da macello, si procede alla dissezione per prelevare gli organi o i tessuti da studiare. Salvo eccezioni il campione deve avere dimensioni inferiori al cm 3. Forbici, pinze, bisturi, lame, piano di paraffina o in materiale plastico. L'operazione va eseguita nel più breve tempo possibile riducendo al minimo i traumi mediante l'uso di lame affilatissime.

5 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO FISSAZIONE OCCORRENTE TEMPO Lo scopo della fissazione è quello di impedire la degenerazione dei tessuti per autolisi e di mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti. Formaldeide al 37%, Paraformaldeide, Acido Picrico ecc. Fissativi in funzione di: Natura del tessuto, Tipo d indagine. I fissativi più usati sono lo Zamboni; NBF 10%/PBS, Paraformaldeide 4%/PBS. Il tempo di soggiorno dei pezzi nel liquido fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni secondo la miscela stessa, il tipo di tessuto e le dimensioni del tessuto.

6 FISICA CHIMICA N 2 LIQUIDO + ISOPENTANO PARA 4%/PBS NBF 10%/PBS fissativi semplici ZAMBONI = miscela fissativa

7 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO FISSAZIONE OCCORRENTE TEMPO Lo scopo della fissazione è quello di impedire la degenerazione dei tessuti per autolisi e di mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti. Formaldeide al 37%, Paraformaldeide, Acido Picrico ecc. Fissativi in funzione di: Natura del tessuto, Tipo d indagine. I fissativi più usati sono lo Zamboni; NBF 10%/PBS, Paraformaldeide 4%/PBS. Il tempo di soggiorno dei pezzi nel liquido fissativo varia da poche ore a 1-2 giorni secondo la miscela stessa, il tipo di tessuto e le dimensioni del tessuto.

8 REGOLE GENERALI DI FISSAZIONE Temperatura Dimensioni del campione ph della soluzione fissatrice

9 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO INCLUSO IN PARAFFINA INCLUSIONE OCCORRENTE TEMPO Il suo scopo è quello di rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere sezionato allo spessore voluto (3-10 µm). Serie di alcoli. Solvente del mezzo includente (Xilene). Mezzo includente (Paraffina, Paraplast). Stufa a C. Contenitori vari. Disidratazione da alcune ore a 1 giorno secondo le dimensioni dei pezzi. Tempo tot del processo 2 giorni.

10 Tampone per Da 20 a 3h Da 20 a 1,30h Stufa sottovuoto

11 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO INCLUSO IN PARAFFINA TAGLIO Il suo scopo è quello di sezionare il pezzo allo spessore voluto (5-8 µm di norma) in modo da poter essere osservato al microscopio dopo opportuna colorazione. OCCORRENTE Lama. Blocchetti di legno. Paraffina solida in scaglie. Microtomo rotativo. Lama diritta. Contenitore delle fette.

12 IL MICROTOMO ROTATIVO Per il sezionamento si sfruttano due movimenti: 1. uno di avvicinamento del campione alla lama e corrisponde allo spessore della sezione che varia da 0,25 a 50 micron. 2. il secondo, perpendicolare alla direzione di avvicinamento, corrisponde al movimento di taglio.

13 Il blocchetto contenente il pezzo da sezionare viene poi sagomato a piramide a base quadrata e montato su un blocchetto di legno al quale viene fatto aderire mediante un po' di paraffina scaldata con una spatolina resa rovente alla fiamma di un bunsen. Una volta solidificata la paraffina e raffreddato il tutto siamo pronti per il taglio al microtomo.

14 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO INCLUSO IN PARAFFINA MONTAGGIO OCCORRENTE Il suo scopo è quello di disporre in modo ordinato le sezioni sui vetrini che poi dovranno essere colorati. Vetrini portaoggetto (polilisinati). Acqua distillata. Pennelli. Aghi montati. Piastra termostatata. Termostato a 37 C.

15 Le sezioni ottenute con il microtomo sono trasferite in acqua calda distillata a 37 C- 45 C e dopo distensione raccolte su vetrini portaoggetti. I vetrini su cui è stato posto il campione incluso saranno posti su piastre riscaldate a 37 C C. In seguito all evaporazione dell acqua il preparato aderirà alla superficie del vetrino.

16 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO CONGELATO TAGLIO Il suo scopo è quello di sezionare il pezzo allo spessore voluto (5-20 µm di norma) in modo da poter essere osservato al microscopio dopo opportuna colorazione. OCCORRENTE Colla termosensibile OCT. Blocchetti di legno. Criostato. Lama diritta. Vetrini trattati o meno con adesivi.

17 IL CRIOSTATO Per il taglio dei pezzi fissati con congelamento viene utilizzato un particolare microtomo che differisce dai comuni microtomi in quanto il campione da sezionare e la lama di taglio vengono entrambi raffreddati in una camera termostatata a valori variabili da C 30 C in modo da mantenere una maggiore consistenza del campione.

18 Il campione congelato viene posto su un portacampione, anch esso refrigerato, adeso ad esso con una colla termosensibile (OCT). Il campione passerà verticalmente sul filo di lama con inclinazioni variabili. Nella fase di risalita il braccio portacampione si retrarrà per consentire il passaggio del campione. Le sezioni così ottenute andranno direttamente raccolte per adesione su vetrini trattati o meno con adesivi.

19 TRASMISSIONE SCANSIONE

20 UNITÀ DI MISURA BIOLOGICHE E POTERE DI RISOLUZIONE Il potere di risoluzione dell occhio umano è 0.2 mm (200 µm) Il potere di risoluzione del microscopio ottico arriva circa a 0.2µm (200nm) Il limite di risoluzione del microscopio elettronico è 0.2nm

21 ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE Le singole cellule o sezioni istologiche possono essere osservate al termine della preparazione al microscopio ottico oppure, se preparate con diverse manualità ma sostanzialmente sovrapponibili, al microscopio elettronico. Per un esame ultrastrutturale dei tessuti è necessario allestire preparati per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM TEM) mediante: PRELIEVO, FISSAZIONE, SEZIONAMENTO, CONTRASTAZIONE

22 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM) PRELIEVO DEI TESSUTI OCCORRENTE TEMPO Su animali anestetizzati o sacrificati in modo indolore, o su materiale proveniente da macello, si procede alla dissezione per prelevare gli organi o i tessuti da studiare. Salvo eccezioni il campione deve avere dimensioni inferiori al cm 3. Forbici, pinze, bisturi, lame, piano di paraffina o in materiale plastico. L'operazione va eseguita nel più breve tempo possibile riducendo al minimo i traumi mediante l'uso di lame affilatissime.

23 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM) FISSAZIONE OCCORRENTE TEMPO Lo scopo della fissazione è quello di impedire la degenerazione dei tessuti per autolisi e di mantenere il più possibile inalterato il quadro strutturale dei tessuti. Paraformaldeide, Glutaraldeide, Tetrossido di Osmio ecc. Fissativi in funzione di: Natura del tessuto, Tipo d indagine. I fissativi più usati sono: miscele di PFA + glutaraldeide/tampone Cacodilato 0,1M, Tetrossido di Osmio Il tempo di soggiorno dei pezzi nel liquido fissativo varia da pochi min. a 1-3 ore secondo la miscela stessa, il tipo di tessuto e le dimensioni del tessuto.

24 REGOLE GENERALI DI FISSAZIONE Temperatura Dimensioni del campione ph della soluzione fissatrice

25 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM) INCLUSIONE OCCORRENTE TEMPO Il suo scopo è quello di rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere sezionato allo spessore voluto ( Å). Serie di alcoli. Solvente di transizione. Mezzo includente (resina epossidica o acrilica). Stufa a 50 o 60 C. Contenitori vari. Disidratazione da alcuni minuti a 1 ora secondo le dimensioni dei pezzi. Tempo tot del processo 2 giorni.

26 EPOSSIDICHE ACRILICHE DURCUPAM ACM LONDON RESIN WHITE (LRW)

27 INCLUSIONE per il TEM CON RESINE EPOSSIDICHE (DURCUPAM ACM) Le fasi dell inclusione Fissazione PFA 2%/ Gluta 0,5%/ Tampone cacodilato 0,1M ph 7,4 Lavaggio in tampone cacodilato 0.1M ph 7.4 a RT 3 X 10 Post-fissazione Tretossido di Osmio 1% in tampone cacodilato 0.1 M ph 7.4 per 30 a 4 C Lavaggio in tampone cacodilato 0.1M ph 7.4 a RT 3 X 10 Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcoli (50, 70, 90, 95, 100 ) Acetato di uranile 0.2% in alcool 100 per 1h. Lavaggio in alcool 100 2X5 Ossido di propilene 3 X 3 Ossido di propilene + resina 3:1 per 20 Ossido di propilene + resina 1:1 per 20 Ossido di propilene + resina 1:3 ON Resina pura 2 cambi di 1h ognuno e poi 1 cambio ON quindi in stufa a 60 C 12-36h. Osservazione I tempi sono riferiti a pezzetti di 1mm 3, a 4 C per 1-3h circa. Per eliminare l eccesso di liquido fissativo. Il Tretossido di Osmio è un ottimo fissativo per i lipidi ma poiché provoca la perdita di N 2 proteico essa viene fatta precedere dalla fissazione aldeidica. Per eliminare l eccesso di liquido fissativo. Le resine epossidiche, essendo idrofobiche, richiedono una buona disidratazione del tessuto. Contrastazione in blocco del campione. Per eliminare l eccesso di liquido di contrastazione. Solvente di transizione del mezzo d inclusione. Il solvente di transizione viene gradualmente sostituito da soluzioni a concentrazione crescente di resina nel solvente stesso, fino ad arrivare alla sola resina. Polimerizzazione della resina con il calore.

28 INCLUSIONE per il TEM CON RESINE ACRILICHE (LRW) Fissazione PFA 4%/ Gluta 0,5%/ Tampone cacodilato 0,1M ph 7,4 Lavaggio in tampone cacodilato 0.1M ph 7.4 a RT 3 X 10 Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcoli (50, 70 ) LRW + alcol 70 2:1 per 20 L.R.W. pura 4 X 20 Campione in stufa a 50 C per 24h oppure L.R.W + acceleratore (1,5µl/ml) Mettere la resina con l acceleratore in un eppendorf da inclusione a 0 C per 24h I tempi sono riferiti a pezzetti di 1mm 3, a 4 C per 1-3h circa. Per eliminare l eccesso di liquido fissativo. LRW essendo idrofilica consente di effettuare disidratazioni rapide e parziali. Miscela di transizione del mezzo d inclusione. Infiltrazione del campione con resina pura Polimerizzazione della resina con il calore Questa miscela si deve preparare in un contenitore a sua volta riposto in un thermos con ghiaccio per evitare l immediata polimerizzazione. Polimerizzazione della resina con il freddo

29 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE (TEM) TAGLIO Il suo scopo è quello di sezionare il pezzo allo spessore voluto ( Å) in modo da poter essere osservato al TEM dopo opportuna contrastazione. OCCORRENTE Lama da rasoio. H 2 O distillata. Ultramicrotomo. Lama di vetro. Vaschetta di raccolta delle sezioni. Vetrini porta oggetto. Retini trattati o meno con adesivi (Formvar).

30 ULTRAMICROTOMO Per l osservazione ultrastrutturale i campioni inclusi in resine epossiche o acriliche dovranno essere sezionati con un ultramicrotomo a spessori variabili dai 600 ai 900 Å. Esso è dotato di uno stereomicroscopio per ingrandire opportunamente i preparati da sezionare che sono normalmente assai piccoli.

31 LA RACCOLTA DELLE SEZIONI SEMIFINI ULTRAFINI La sezione è ottenuta sfruttando il filo di una lama di vetro o diamante che seziona il campione contenuto in una dura resina acrilica o epossidica. Le sezioni sono raccolte in una vaschetta adesa o parte integrante della lama di vetro e colma d acqua. Sul liquido galleggerà la fettina (o un nastro di fettine) dopo essere stata tagliata e prima di essere raccolta su retine metalliche.

32 IL KNIFEMAKER La preparazione delle lame di vetro richiede l utilizzo del knifemaker, un particolare taglialame che consente di ottenere lame di vetro.

33 L ULTRAMICROTOMO E LE GRIDS Le sezioni ultrafini ottenute con gli ultramicrotomi non possono essere maneggiate per la loro estrema fragilità e per le ridotte dimensioni; inoltre non possono essere poste su un supporto di vetro che arresterebbe il fascio elettronico.

34 L ULTRACRIOMICROTOMO E LE GRIDS I retini metallici o grids possono essere di rame o, in caso di indagini immunocitochimiche, di nickel o oro. La loro forma e la compattezza delle bar varia a seconda del tipo di osservazione e si misura in mesch.

35 Colorazione delle semifini Contrastazione delle ultrafini Blue di toluidina Acetato di Uranile + Citrato di Piombo

36 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE (SEM) Le fasi di preparazione per il SEM possono essere così schematizzate: Comuni al TEM PRELIEVO FISSAZIONE DISIDRATAZIONE Specifiche per il SEM CRITICAL POINT DRYING MONTAGGIO RICOPERTURA

37 LE FASI PRINCIPALI DELL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO per la MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE (SEM) Le fasi dell inclusione Fissazione PFA 1%/ Gluta 0,5%/ Tampone cacodilato 0,1M ph 7,4 Lavaggio in tampone cacodilato 0.1M ph 7.4 a RT 3 X 10 Post-fissazione Tretossido di Osmio 1% in tampone cacodilato 0.1 M ph 7.4 per 30 a 4 C Lavaggio in tampone cacodilato 0.1M ph 7.4 a RT 3 X 10 Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcoli (30, 50, 70, 80, 90, 100 ) CRITICAL POINT DRYING MONTAGGIO RICOPERTURA Osservazione I tempi sono riferiti a pezzetti di 1mm 3, a 4 C per 1-3h circa. Per eliminare l eccesso di liquido fissativo. Il Tretossido di Osmio è un ottimo fissativo per i lipidi ma poiché provoca la perdita di N 2 proteico essa viene fatta precedere dalla fissazione aldeidica. Per eliminare l eccesso di liquido fissativo. Il preparato per poter essere osservato al SEM richiede una buona disidratazione del tessuto. SPECIFICO DELLA MICROSCOPIA A SCANSIONE SPECIFICO DELLA MICROSCOPIA A SCANSIONE SPECIFICO DELLA MICROSCOPIA A SCANSIONE

38 CRITICAL POINT DRYING Il critical point drying è la metodica maggiormente utilizzata per la fase di essiccamento che consiste nell allontanamento dei fluidi presenti nel campione (generalmente acqua o solventi utilizzati nella disidratazione), allo scopo di potere successivamente sottoporre il campione ai procedimenti di ricopertura e di osservazione che si eseguono entrambi sottovuoto.

39 MONTAGGIO Il montaggio consiste nel fissare il campione sul supporto di osservazione.

40 RICOPERTURA I campioni biologici devono subire il procedimento di ricopertura metallica, con l impiego di sostanze a elevato peso atomico, per poter ottenere risultati migliori per quanto riguarda la qualità dell immagine.