La gestione tecnica della biopsia renale

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Guglielmo Tortora
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1 La gestione tecnica della biopsia renale Tecniche di allestimento di routine Valentina Bartolucci U.O.C. Anatomia Patologica Università Campus Biomedico

TRASPORTO E CONSEGNA Una volta eseguito il prelievo, la biopsia renale viene adagiata su un foglio di carta bibula imbibito di soluzione fisiologica e trasportata in una capsula

2 TRASPORTO E CONSEGNA Una volta eseguito il prelievo, la biopsia renale viene adagiata su un foglio di carta bibula imbibito di soluzione fisiologica e trasportata in una capsula di petri. E necessario mantenere il campione umido, preferibilmente a una temperatura di +4 C per ritardare i fenomeni autolitici e impedire l eccessiva disidratazione del campione.

Midollare GLOMERULO Il frustolo viene diviso in tre porzioni

3 VALUTAZIONE E PRELIEVO Corticale Si osserva il frustolo al microscopio per valutarne l idoneità. Midollare GLOMERULO Il frustolo viene diviso in tre porzioni ognuna destinata a una lavorazione diversa: CONGELAMENTO MICROSCOPIA OTTICA MICROSCOPIA ELETTRONICA

Tale sostanza non penetra negli interstizi del tessuto, ma circonda il frammento,

4 CONGELAMENTO Il prelievo viene inserito in una cryomold e ricoperto di OCT L OCT è una soluzione acquosa a base di alcol polivinilico. Tale sostanza non penetra negli interstizi del tessuto, ma circonda il frammento, proteggendolo dal "trauma" del congelamento e costituendo inoltre un supporto solido necessario per il successivo taglio delle sezioni al criostato.

CONGELAMENTO Esistono diversi metodi per congelare i campioni di tessuto «a fresco» ISOPENTANO RAFFREDDATO CON AZOTO LIQUIDO: L azoto allo stato

L immersione del frustolo in quest ultimo subito prima della solidificazione permette il congelamento rapido e uniforme del tessuto, senza sbalzi

5 CONGELAMENTO Esistono diversi metodi per congelare i campioni di tessuto «a fresco» ISOPENTANO RAFFREDDATO CON AZOTO LIQUIDO: L azoto allo stato liquido si trova alla temperatura di -197 C, e l isopentano solidifica a -80 C. L immersione del frustolo in quest ultimo subito prima della solidificazione permette il congelamento rapido e uniforme del tessuto, senza sbalzi di temperatura. E una metodica indaginosa. SPRAY CONGELANTE: Si spruzza direttamente sulla mold finchè il tessuto non è uniformemente congelato. Buon rapporto performance/costo ma è necessaria una buona manualità.

CONGELAMENTO CRITICITA Un congelamento troppo lento o un frustolo troppo

Non bisogna dare il tempo all acqua, intrappolata nel frustolo, di

congelamento l integrità ottenuto delle utilizzando strutture lo del

al campione provoca la formazione di bolle e deformazione Al contrario,

6 CONGELAMENTO CRITICITA Un congelamento troppo lento o un frustolo troppo «bagnato» provoca la formazione di cristalli di ghiaccio. Non bisogna dare il tempo all acqua, intrappolata nel frustolo, di espandersi durante il congelamento perché questo va compromettere Un congelamento l integrità ottenuto delle utilizzando strutture lo del spray troppo vicino tessuto. al campione provoca la formazione di bolle e deformazione Al contrario, un frustolo essiccato, una volta dell OCT rendendo complessa la fase successiva del taglio. congelato avrà un aspetto friabile e si taglierà con difficoltà

7 CONGELAMENTO ERRORI

8 TAGLIO AL CRIOSTATO Il campione viene montato su un supporto metallico e rifilato con una lametta per poter posizionare le sezioni sul vetrino il più vicine le une alle altre

9 TAGLIO AL CRIOSTATO Viene tagliata una sezione spessa 5 µm A questo punto bisogna osservare il vetrino al microscopio per valutare la presenza di glomeruli. Il campione viene sgrossato a 10 µm

10 TAGLIO AL CRIOSTATO Osservazione al microscopio Vetrino non colorato Vetrino colorato con ematossilina eosina (metodo rapido)

11 TAGLIO AL CRIOSTATO Osservazione al microscopio GLOMERULO

12 TAGLIO AL CRIOSTATO Osservazione al microscopio

13 TAGLIO AL CRIOSTATO Se il glomerulo non è presente sulla prima sezione viene raccolta un altra sezione scendendo di circa 20 µm. Questa operazione viene ripetuta finché il glomerulo non viene scoperto.

14 TAGLIO AL CRIOSTATO Vengono allestiti 8 vetrini per immunofluorescenza mettendo una sezione su ciascun vetrino e poi ricominciando il giro finché non si ottengono vetrini con 3 sezioni ciascuno

15 IMMUNOFLUORESCENZA Si può procedere subito con l allestimento dell immunofluorescenza oppure conservare i vetrini a -20 C. L immunofluorescenza può essere di due tipi DIRETTA Il fluorocromo è legato direttamente all anticorpo primario INDIRETTA Il fluorocromo è legato all anticorpo secondario Anticorpi utilizzati: IgA IgG IgM C1q C3c Fibrinogeno K - λ

16 IMMUNOFLUORESCENZA I vetrini vengono reidratati in PBS 1X Si preparano gli anticorpi con diluizione 1:40, tranne fibrinogeno che si diluisce 1:80. Si dispensa l anticorpo e si lascia incubare 40 minuti in camera umida. Si eseguono 3 lavaggi in PBS da 15 minuti ciascuno, al buio. Si monta il coprioggetto con montante acquoso. La fluorescenza si può osservare subito al microscopio oppure i vetrini vengono conservati a +4 C (brevi periodi)

17 Ross et al. BMC Nephrology 2012, 13:81

18 MICROSCOPIA OTTICA Fissazione Il frammento destinato alla microscopia ottica viene fissato in formalina neutra tamponata per almeno 2 ore e successivamente processato. Inclusione Dopo la processazione il frustolo bioptico viene incluso, poi sgrossato a 10 µm e conservato a -20 C. Taglio Dopo alcune ore a -20 C la paraffina si può procedere con il taglio ad uno spessore di 1,5 µm. Il taglio deve essere effettuato velocemente per evitare il riscaldamento del blocchetto, ma allo stesso tempo mantenendo una velocità costante per permettere un taglio uniforme privo di artefatti.

19 MICROSCOPIA OTTICA Si taglia un nastrino, tutto dello spessore 1,5 µm, da cui vengono allestiti 4 vetrini: 1 Verrà colorato in Ematossilina Eosina 3 Verranno colorati con il PAS Il campione verrà considerato adeguato se contiene almeno glomeruli

20 MICROSCOPIA OTTICA Artefatti La biopsia renale è un campione delicato. Gli artefatti sono frutto di errori che possono intercorrere in diverse fasi del processo: TRASPORTO Esposizione a temperature elevate durante il trasporto. Essiccamento del campione Ritardo nella fissazione ALLESTIMENTO Essiccamento del campione durante la processazione Poca paraffina nel blocchetto Lame usurate Blocchetto caldo Velocità di taglio

21 MICROSCOPIA OTTICA Artefatti

MICROSCOPIA OTTICA Ulteriori colorazioni Dopo aver visionato i primi vetrini, il patologo può richiedere in un secondo momento ulteriori vetrini: Sezioni a vari livelli colorati con PAS per

22 MICROSCOPIA OTTICA Ulteriori colorazioni Dopo aver visionato i primi vetrini, il patologo può richiedere in un secondo momento ulteriori vetrini: Sezioni a vari livelli colorati con PAS per visualizzare più glomeruli (spessore 1,5 µm) Rosso Congo -ricerca amiloide- (spessore 6 µm) Immunoistochimica (spessore 3 µm) Altre colorazioni istochimiche (PASM, Tricromica di masson, AFOG, etc )

23 MICROSCOPIA ELETTRONICA Fissazione Il frammento destinato alla microscopia elettronica viene fissato nel liquido di Karnowsky (paraformaldeide 4%, glutaraldeide 2% in tampone cacodilato). Questo fissativo permette di conservare meglio i dettagli morfologici rispetto alla sola formalina. La fissazione deve durare almeno 2 ore a temperatura ambiente, successivamente si può eseguire la processazione che viene eseguita manualmente.

24 MICROSCOPIA ELETTRONICA Processazione TAMPONE PBS 1X 2 X 30 min. OSMIO 2X60 min. a +4 C Tetrossido di osmio Agente TAMPONE ossidante PBS 1X Lega 2 i lipidi X 30 min. Aumenta il contrasto ALCOL 70 1X15 min. Ossido di propilene Solvente di transizione tra alcol e resina RESINA/OSS. 1:1 1X60 min. OSSIDO DI PROPILENE 2X30 min. ALCOL 100 3X30 min. ALCOL 95 3X30 min. RESINA 1X60 min. RESINA 24h INCLUSIONE POLIMERIZZAZIONE 60 C

MICROSCOPIA ELETTRONICA Resina La resina utilizzata per includere i frammenti di tessuto per microscopia elettronica è una miscela di diversi composti chimici: EMBED 812: Resina DDSA:

25 MICROSCOPIA ELETTRONICA Resina La resina utilizzata per includere i frammenti di tessuto per microscopia elettronica è una miscela di diversi composti chimici: EMBED 812: Resina DDSA: Agente indurente MNA: Agente indurente DMP-30: Accelera la polimerizzazione Sono composti molto viscosi, è necessario prestare attenzione nella preparazione della resina per non creare bolle

26 MICROSCOPIA ELETTRONICA Taglio Il taglio delle sezioni per microscopia elettronica viene eseguito con l ausilio di un ultramicrotomo in grado di tagliare sezioni molto sottili.

27 MICROSCOPIA ELETTRONICA Taglio Semifini Le sezioni semifini vengono tagliate con l ausilio di una lama di vetro ad uno spessore di 1 µm e colorate con blu di toluidina. Vengono allestite per valutare la presenza o meno del glomerulo prima di procedere con l allestimento dei retini. Ultrastruttura Le sezioni destinate al microscopio elettronico vengono tagliate ad uno spessore tra gli 60 e i 80 nm Vengono tagliate con una lama di diamante e poste su retini di rame. I retini vengono colorati con metalli pesanti (Acetato di uranile, Citrato di piombo) Alla fine si ottiene un immagine «in negativo» delle strutture da analizzare.

28 Si esegue un segno con una punta di diamante Si dà un colpo netto Allestimento lama di vetro Filo della lama Vaschetta porta sezioni Filo della lama

29 Blocchetto Sezioni Retino Sezioni galleggiano sull acqua Pinze

30 Grazie per l attenzione

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