PATOLOGIA. Pathos /Logos = studio della malattia ANATOMIA PATOLOGICA. Studio della patologia dei tessuti appartenenti agli organi specializzati

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1 PATOLOGIA Pathos /Logos = studio della malattia Patologia generale studia alterazioni a livello della cellula ANATOMIA PATOLOGICA Studio della patologia dei tessuti appartenenti agli organi specializzati E NECESSARIA LA CONOSCENZA DI ALCUNI CONCETTI DI PATOLOGIA GENERALE

2 ANATOMIA PATOLOGICA ISTOPATOLOGIA ISTOCHIMICA Esame istopatologico definitivo Esame istopatologico estemporaneo IMMUNOISTOCHIMICA CITOLOGIA MICROSCOPIA ELETTRONICA BIOLOGIA MOLECOLARE RISCONTRO DIAGNOSTICO

3 ESAME ISTOPATOLOGICO DEFINITIVO Esame al microscopio ottico dei tessuti affetti da patologie Nell esame istologico definitivo il tessuto può essere conservato per sempre e quindi si avrà un ARCHIVIO nel quale si potranno cercare quelli che sono definiti i PRECEDENTI. Il prelievo del tessuto avviene mediante BIOPSIA o AGOBIOPSIA Dal frustolo di tessuto si ottengono delle sezioni che vengono poste su un vetrino e colorate opportunamente

4 La biopsia deve essere ADEGUATA

5 LOBULO EPATICO E un esagono In poche specie es. maiale è delimitato da connettivo ma anche senza il connettivo si può riconoscere per la disposizione radiale degli epatociti La vena centrolobulare si trova al centro dell esagono. Gli epatociti sono disposti radialmente in filiere singole. Ai 6 angoli dell esagono vi sono gli spazi portali Gli spazi contengono una piccola ramificazione della vena porta, una piccola ramificazione dell arteria epatica e un condottino biliare circondati da connettivo. Il sangue entra nei sinusoidi epatici dalle piccole ramificazioni di arteria epatica e vena porta e confluisce nella vena centrolobulare. per il fegato almeno 4 spazi portali.

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7 Spazio portale Vena centrolobulare

8 Spazio portale normale ad alto ingrandimento

9 I CRITERI CAMBIANO DA TESSUTO A TESSUTO ES. RENE per esaminare le biopsie in caso di trapianto renale è opportuno che vi siano 10 glomeruli e due arterie

10 BIOPSIA ENDOMIOCARDICA Si fa arrivare un biotomo (catetere che ha sulla punta una pinzetta ) per via transvenosa nell atrio destro dove avviene la biopsia Tutto avviene sotto controllo radiologico Vena giugulare o vena femorale Anestesia locale Ago Ago sostituito da una cannula nella quale viene inserito il biotomo Si eseguono 4 o 5 prelievi Rischi: aritmie perforazione della parete con emopericardio Essenziale per la diagnosi di miocardiopatia e di rigetto acuto e cronico nel trapianto di cuore utile nelle miocarditi

11 QUANDO SI LEGGE UN REFERTO ANATOMO PATOLOGICO DI TIPO ONCOLOGICO OLTRE ALLA COMPRENSIONE DELLA DIAGNOSI BISOGNA GUARDARE COSA E SCRITTO RISPETTO AI MARGINI DI RESEZIONE

12 COME SI ALLESTISCE UN PREPARATO PER ISTOPATOLOGIA CIOE COME SI ARRIVA DAL TESSUTO AL VETRINO

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14 FISSAZIONE CROSSLINKING DELLE MACROMOLECOLE Prevenzione della autolisi e della putrefazione Permeabilizazione ai coloranti Soluzione acquosa al 4%, tamponata Temperatura ambiente! Preserva l antigenicità Formaldeide o Formalina

15 Ponti metilenici Il tempo di fissazione Meglio non più di 24 ore

16 Le modalità di fissazione es congiuntiva

17 il frustolo di tessuto per potere essere tagliato in sezioni sottilissime (3-4 micron) deve essere indurito cioè deve essere INCLUSO in PARAFFINA Perché deve essere cosi sottile? Per tagliare le sezioni si usa un apparecchio chiamato MICROTOMO

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19 Biopsia Pezzo operatorio Importanza del prelievo

20 Nella cassettina il frustolo viene orientato

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22 OPPORTUNE VASCHETTE

23 processo fondamentale mediante il quale si elimina l acqua dai tessuti per permettere l infiltrazione della paraffina che è insolubile in acqua

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25 DIAFANIZZAZIONE Una volta che i campioni sono stati privati dell acqua, essi andranno posti in XILOLO, TOLUOLO, CLOROFORMIO al fine di sostituire l alcool dei tessuti con un solvente della paraffina. QUESTI REATTIVI TOSSICI SONO STATI SOSTITUITI DAL BIOCLEAR L immersione nel solvente, oggi di origine vegetale e non tossico rende il tessuto trasparente

26 Bioclear: solvente derivato dalla scorza degli agrumi

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28 Quello che si ottiene è un blocchetto di paraffina su un supporto di plastica. Il supporto di plastica serve per posizionare il blocchetto sul microtomo per essere tagliato in sezioni dello spessore desiderato. Dopo il taglio le sezioni vengono poste su un vetrino portaoggetto per essere colorate Però i coloranti sono solubili in acqua, perciò bisogna eliminare la paraffina: si ripetono tutti i passaggi all inverso, dal bioclear all alcool, questa volta a concentrazioni decrescenti fino all acqua e quindi all immersione dei vetrini nel colorante.

29 I TEMPI DISIDRATAZIONE se pezzo di qualche cm 7-8 ore Se biopsia 3 ore DIAFANIZZAZIONE 3-4 ore a seconda delle dimensioni IMPREGNAZIONE 2 ore TAGLIO In teoria basta un giorno ma per tempi tecnici 2-3 giorni

30 DOPO IL TAGLIO LA SEZIONE E INCLUSA IN PARAFFINA ED E QUINDI IMPERMEABILE AI COLORANTI PERCIO PER POTERE EFFETTUARE LA COLORAZIONE E NECESSARIO EFFETTUARE TUTTI I PASSAGGI IN ORDINE INVERSO

31 DOPO IL TAGLIO Sparaffinatura delle sezioni 15 minuti Alcool decrescenti per idratare minuti Acqua 2-3 minuti COLORAZIONE

32 La colorazione standard è EMATOSSILINA/EOSINA L ematossilina è basica ha affinità per gli acidi nucleici e colora in nuclei in BLU L eosina è acida e colora i residui basici delle proteine nel citoplasma in ROSA I vetrini vengono poi montati cioè ricoperti con un vetrino coprioggetto che viene incollato sul portaoggetto mediante una resina trasparente (eukitt) che si può rimuovere immergendo il vetrino in bioclear.

33 Polmone normale

34 Una volta che si è osservato il vetrino con la colorazione standard si può procedere con l applicazione di tecniche importantissime che servono 1) per facilitare la diagnosi 2) per la diagnosi differenziale Ma soprattutto tali tecniche possono essere applicate sia a preparati istopatologici, in questo caso si parte dal blocchetto ritagliando altre sezioni sia a preparazioni citologiche

35 Istochimica Istochimica enzimatica Immunoistochimica Biologia molecolare Microscopia Elettronica

36 ISTOCHIMICA Mette in evidenza le strutture caratteristiche dei diversi tessuti mediante colorazioni SPECIALI Es. glicidi grassi collagene muco tessuto elastico ferro ecc

37 PAS Colorazione dell acido periodico di Schiff, colora il glicogeno e le glicoproteine in rosso magenta. Colora ad es. le cellule epatiche, ricche di glicogeno, i proteoglicani delle membrane basali, le mucoproteine, le immunoglobuline Es. le glicoproteine delle pareti dei miceti e delle spore. GLICOGENO: è un polimero del glucosio ed è una forma di deposito. Il fegato è ricco di glicogeno. Il glicogeno viene digerito dalla diastasi o amilasi, mentre le glicoproteine no perciò il trattamento con diastasi prima del PAS fa in modo che la reazione sia PAS negativa se è dovuta al glicogeno. In pratica si colorano due vetrini uno trattato con diastasi e l altro no Questo serve a distinguere il glicogeno dalle glicoproteine

38 PAS : epitelio squamoso non cheratinizzante della mucosa vaginale

39 Stesso epitelio trattamento con diastasi seguito da PAS

40 L1 PAS Le leucemie linfoidi acute si colorano con il PAS, le mieloidi acute no

41 Stomaco mucine di tipo intestinale in blu = metaplasia intestinale Pas/Alcian

42 ISTOCHIMICA ENZIMATICA Reazioni chimiche per mettere in evidenza attività enzimatiche specifiche dei diversi tipi di tessuto Es. mieloperossidasi, esterasi (specifiche e non specifiche) Es: dimostrazione dell α-naftilacetatoesterasi Si somministrano come substrati l α-naftilacetato e un sale diazonico colorato (pararosanilina). Le esterasi liberano il naftolo e lo coniugano con il sale colorato (cioè la pararosanilina) il composto precipita e dà dei granuli insolubili colorati.

43 Le conclusioni in questo caso sono due: 1) La cellula ha l enzima quindi è quel tipo specifico di cellula 2) l enzima funziona

44 Neutrofili: cloroacetato esterasi (blu) Monociti: α naftilacetatoesterasi (marrone)

45 IMMUNOISTOCHIMICA Il principio dell immunoistochimica prevede il riconoscimento di un antigene, presente nelle cellule di un preparato istologico o citologico, da parte di un anticorpo specifico L antigene è una molecola di qualsiasi natura, proteica, glicoproteica, lipoproteica o altro capace di di evocare una risposta immune da parte del sistema immunitario. Ogni singolo antigene è costituito da una o più porzioni chiamate epitopi o determinanti antigenici differenti tra loro Gli antigeni possono essere di membrana, citoplasmatici o nucleari

46 Gli anticorpi o immunoglobuline sono molecole proteiche prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi a un determinante antigenico. Cosa sono le plasmacellule? Anticorpi policlonali: costituiti da anticorpi diversi fra loro e diretti contro differenti determinanti antigenici Anticorpi monoclonali: costituiti da anticorpi identici fra loro e diretti contro lo stesso determinante antigenico

47 Concetto di immunogenicità I determinanti antigenici hanno diversa immunogenicità, cioè potere di evocare una risposta immunitaria. E bene immunizzare animali della specie più distante per avere dei buoni anticorpi, quanto più il sistema immunitario riconoscerà come estranea quella proteina migliore sarà la risposta contro di essa. Concetto di blocco dei legami aspecifici Legami aspecifici Un anticorpo può essere cross-reattivo, cioè riconoscere altri antigeni simili a quello di interesse oppure legarsi tramite il segmento Fc della immunoglobulina ai recettori per Fc che sono presenti sulla membrana di molte cellule. A questo punto si avrà un falso positivo per questo é importante usare delle tecniche per bloccare i legami aspecifici

48 CONCETTO DI CONTROLLO Tutte le volte che si effettua una reazione immunoistochimica bisogna inserire dei controlli CONTROLLO POSITIVO: sezione contenente gli antigeni riconosciuti da quell anticorpo il risultato dovrà essere positivo CONTROLLO NEGATIVO sezione non contenente gli antigeni riconosciuti da quell anticorpo il risultato dovrà essere negativo CONTROLLO DI SPECIFICITA anche detto isotype matched control anticorpo dello stesso isotipo (es. se IgG1 che riconosce un antigene presente nella cellula si userà una IgG1 che riconosce un antigene che non è presente in quella cellula e il risultato dovrà essere negativo.

49 Parte variabile 2 catene pesanti 2 catene leggere tenute insieme da legami disolfuro

50 Abbiamo 2 tipi di immunoistochimica 1) L anticorpo è marcato con un tracciante fluorescente o fluorocromo: immunofluorescenza (diretta o indiretta) 2) L anticorpo è marcato con un enzima: immunoistochimica enzimatica

51 IMMUNOFLUORESCENZA L anticorpo è marcato con un tracciante fluorescente o fluorocromo. Fluorocromo: sostanza capace di emettere luce visibile se colpita da radiazioni ad alta frequenza. Il microscopio a fluorescenza permette di evidenziare i siti di legame fra antigeni ed anticorpi coniugati con il fluorocromo grazie alla emissione UV. Si sviluppa un intensa luminosità prodotta dai fluorocromi colpiti dagli UV e visibili nell oscurità

52 L immunofluorescenza viene utilizzata quando gli anticorpi non riconoscono gli antigeni inclusi in paraffina cioè se sono denaturati Es. biopsie renali in caso di glomerulonefrite Infatti il tessuto non è incluso in paraffina, bensì CONGELATO optimum compound tissue L OCT è un gel che congela rapidamente

53 Congelamento La vaschetta viene messa nel criostato e si aspetta un paio di minuti finché il pezzo incluso in OCT non sia ben congelato Fissazione Acetone freddo per 10 minuti

54 IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA

55 IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

56 Montaggio Il nuovo tipo di montante permette di conservare i preparati a 4 C fino a un mese. Il montante non si asciuga, diversamente dall eukitt e il vetrino quindi non si archivia. (Si possono però fotografare i risultati al microscopio e costruire quindi un archivio) Limiti dell immunofluorescenza su tessuto -Mancanza di informazioni topografiche -Naturale estinzione della fluorescenza -Necessità di osservazione in microscopia particolare -Non conservabilità dei preparati

57 IMMUNOISTOCHIMICA ENZIMATICA Si effettua su tessuti inclusi in paraffina ed è quindi molto più utilizzata dell immunofluorescenza e i vetrini se si usa il sistema della perossidasi-dab (diaminobenzidina) si possono conservare in archivio, insieme con i vetrini del corrispondente esame istopatologico L anticorpo è marcato con un enzima Gli enzimi più frequentemente usati sono 2 Perossidasi Fosfatasi alcalina 2 substrati DAB (diaminobenzidina) color marrone scuro AEC (aminoetilcarbazolo) colore rosso

58 PRIMA DI EFFETTUARE LA COLORAZIONE QUASI SEMPRE E NECESSARIO EFFETTUARE LO SMASCHERAMENTO DELL ANTIGENE Lo smascheramento degli antigeni è una procedura che ripristina, almeno in parte, le caratteristiche antigeniche alterate dal processo di fissazione ed è uno step quasi sempre fondamentale nello studio immunoistochimico delle neoplasie

59 SMASCHERAMENTO DELL ANTIGENE Enzimi (es. tripsina) Calore ph Ogni antigene ha il suo smascheramento preferito

60 Nell immunoistochimica enzimatica sono necessari due blocchi BLOCCO DEI LEGAMI ASPECIFICI BLOCCO DELLA PEROSSIDASI ENDOGENA Altrimenti si avrà un falso positivo specie nelle cellule che hanno molta perossidasi come i neutrofili e i monociti

61 Sistema avidina /biotina L avidina è una glicoproteina del bianco dell uovo che ha una elevatissima affinità per la biotina (1x ) Una molecola di avidina lega 4 molecole di biotina Background: biotina endogena

62 Sistema avidina /biotina vengono utilizzati 3 reagenti: un anticorpo primario, un anticorpo secondario legato alla biotina e un complesso avidina-biotina legata alla perossidasi. I siti liberi delle molecole di avidina permettono alla biotina dell anticorpo secondario di legarsi con il complesso. L enzima perossidasi e quindi l antigene che si ricerca vengono visualizzati con un cromogeno.

63 ENVISION Dopo l anticorpo primario si applica un polimero del destrano al quale sono coniugate molte molecole di perossidasi e molti anticorpi secondari quindi si avrà una buona amplificazione senza problemi di background L anticorpo secondario sarà anti-rabbit per gli anticorpi policlonali e anti-mouse per gli anticorpi monoclonali

64 CD34 mielodisplasia

65 CD34

66 STAT-3 ca cervice

67 ESAME ISTOPATOLOGICO ESTEMPORANEO Si effettua durante gli interventi chirurgici Il tessuto è congelato come per l immunofluorescenza non è fissato ed è colorato con ematossilina-eosina. A volte vengono visti i linfonodi Sono importanti i margini di resezione Se i margini non sono indenni da patologia il chirurgo allarga l intervento