MICROSCOPIO OTTICO. L oggetto è illuminato da raggi di luce che raggiungono l obiettivo che è una lente che ha il compito di ingrandire l oggetto

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1 MICROSCOPIO OTTICO L oggetto è illuminato da raggi di luce che raggiungono l obiettivo che è una lente che ha il compito di ingrandire l oggetto Poiché i raggi provenienti da una fonte di luce non sono perfettamente paralleli verranno deviati dall oggetto in maniera diversa dando luogo alla DIFFRAZIONE I raggi luminosi hanno varie lunghezze d onda quindi ci saranno angoli di diffrazione diversi questo produrrà aberrazioni cromatiche Poiché la lente dell obiettivo ha una superficie curva i raggi che arrivano perpendicolarmente verranno deviati in maniera diversa da quelli che arrivano tangenzialmente: aberrazioni di sfericità Quanto più è alta la curvatura della lente dell obiettivo maggiori saranno le differenze nelle deviazioni

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3 Nel microscopio l obiettivo ingrandisce l immagine OBIETTIVO: è una lente convergente la lente esterna dell obiettivo si chiama lente frontale. Minore è il suo diametro, cioè quanto più forte è la curvatura maggiore sarà l ingrandimento Distanza frontale: distanza tra la lente frontale e la superficie inferiore del vetrino coprioggetto quando l oggetto è a fuoco. Minore è tale distanza maggiore è l ingrandimento DIAFRAMMA regola la quantità di luce quindi corregge le aberrazioni cromatiche CONDENSATORE: lente che rende paralleli i raggi di luce e quindi serve quindi a rendere omogenea la diffrazione cioè a correggere le aberrazioni di sfericità

4 Le lenti oculari ulteriormente ingrandiscono l immagine data dall obiettivo La distanza tra obiettivo e oggetto è regolabile mentre quella tra obiettivo e oculari è fissa

5 APERTURA NUMERICA Funzione della quantità di luce che un obiettivo può accettare Se c è una buona apertura significa che l obiettivo accetta anche raggi divergenti e non c è bisogno di chiudere il diaframma e si vedrà l oggetto bene in presenza di molta luce AN = n sen u n = indice di rifrazione del mezzo interposto, quindi una misura della propagazione della luce in un mezzo u = metà dell angolo del cono di raggi provenienti dall oggetto che vengono accettati dall obiettivo Quindi se 2u = 180 u/2 = 90 quindi il seno di 90 = 1

6 Seno = proiezione di un angolo sull asse verticale l angolo di 90 Coincide con l asse verticale e quindi seno di 90 = 1

7 POTERE DI RISOLUZIONE La più piccola distanza alla quale due punti possono essere distinti Formula di Abbe 0.61 λ n sen u λ = lunghezza d onda Se l apertura numerica = 1 il potere di risoluzione diventa funzione della lunghezza d onda quanto più piccola è la lunghezza d onda minore sarà la distanza alla quale due punti saranno distinti

8 Potere di risoluzione del MO = 0.2 µ = 200 nm = 10 6 m Batteri = 0.5 µ Potere di risoluzione del ME = 2 Α = 0,2 nm = 10 9 m ME elettroni attraversano il preparato la fetta deve essere sottilissima dato che gli elettroni hanno basso potere di penetrazione vuoto lenti elettromagnetiche schermo che emette fluorescenza verde se colpito da elettroni

9 FISSAZIONE CROSSLINKING DELLE MACROMOLECOLE Prevenzione della autolisi e della putrefazione Permeabilizazione ai coloranti Formaldeide o Formalina

10 Glutaraldeide Elevato potere di penetrazione

11 Fissativo di Carnowsky: 4% paraformaldeide 5% glutaraldeide 5 volte più veloce della glutaraldeide Quanto deve durare la fissazione? Almeno 2 ore, e sarebbe bene interromperla dopo 24 ore

12 POST-FISSAZIONE tetrossido di osmio 1 ora, i lipidi assumono una colorazione scura

13 Deidratazione in etanolo a concentrazioni crescenti Inclusione (o embedding) in resina (resine epossidiche) Si tagliano le sezioni semifini Semifini si colorano con blu di toluidina 1% Uso delle sezioni semifini Taglio delle sezioni fini (100nm = 0.1µ)

14 tossicità da ciclosporina (acuta) Sezione semifini blu di toluidina

15 COLORAZIONE DELLE SEZIONI FINI Gli elettroni sparati nel vuoto ad alta velocità attraverserebbero il preparato piombando tutti sullo schermo perciò per ottenere un immagine è necessario trattenere gli elettroni in maniera differenziata a seconda delle diverse strutture cellulari. Gli elettroni vengono trattenuti dagli atomi dei metalli pesanti ecco perché la colorazione dei tessuti per la ME prevede che le sezioni fini poste su griglie di rame siano colorate con acetato di uranile e citrato di piombo

16 La ME non può essere sostituita dalla IIC Biopsie renali Diagnostica non tumorale Biopsie endomiocardiche Biopsie muscolari (degenerazione sarcomeri) Biopsie dei nervi periferici (degenerazione degli assoni) Malattie bollose la conoscenza del livello della bolla rispetto alla membrana basale è di grande aiuto per la diagnosi del tipo di malattia

17 MEMBRANA BASALE come appare al ME 3 strati LAMINA LUCIDA subito al di sotto della cellula LAMINA DENSA da cui partono filamenti di 2-6 nm che si ancorano ai desmosomi LAMINA FIBRORETICOLARE con collagene di tipo VII Nomenclatura Membrana basale è presente al di sotto dell epitelio Lamina esterna è sottile interrotta si trova intorno alla cellula e non al di sotto (periciti cellule di Schwann adipociti alcuni tipi di cellule tumorali cellule muscolai liscie)

18 Storage diseases o tesaurismosi (glicogenosi e sfingolipidosi) Si vedono inclusi all interno dei lisosomi quando la malattia è di origine lisosomiale Virus Solo se in grandissime quantità (colture di virus) Dismorfologia ciliare

19 Microscopio elettronico a trasmissione 1 milione di volts Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico ad alto voltaggio 10 milioni di volts, sezioni più spesse, fotografie a profondità diversa simultanea e quindi possibilità di avere immagini tridimensionali Occupa 2 piani Microscopio analitico Utilizza un fascio sottilissimo di elettroni che si scontra con gli elettroni degli orbitali più esterni degli atomi viene deviato in maniera tipica a seconda del tipo di atomo

20 La diagnosi di TUMORE. NON si fa al microscopio elettronico Quando si pensa di fare la ME.. Pezzo di 4X10 mm da sezionare in cubi di 1-2 mm con un bisturi mentre sono immersi nel fissativo Se NON si ha il fissativo

21 IL DANNO DA ANOSSIA REVERSIBILE min Rigonfiamento mitocondriale Dilatazione e rigonfiamento REG min Piccole densità mitocondriali Marginazione e aggregazione cromatina Evidenti densità mitocondriali = inizio del danno irreversibile RENE FEGATO PANCREAS 2-max 20 ore RT diagnosi possibile oltre no

22 Non è mai troppo tardi. Da paraffina cambi di bioclear per una settimana e processare per ME Si osserveranno citoplasmi danneggiati e membrane discontinue Ma sarà possibile riconoscere desmosomi, filamenti miofibrille, granuli neuroendocrini melanosomi e virus in caso di infezioni gravissime (soggetti immunodeficienti) Durata della processazione: una settimana

23 Immunoelettromicroscopia elettronica Pre-embedding si fa la reazione prima della inclusione in resina usando anticorpi marcati con oro colloidale Post-embedding bisogna usare resine permeabili agli anticorpi