Clinica. Microscopia. Elettronica

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Vittore Andreoli
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1 DIAGNOSTICA ULTRASTRUTTURALE Giovanna Finzi Istologia e Anatomia Patologica Ospedale di Circolo Varese

2 DIAGNOSI DELLE GLOMERULONEFRITI Clinica Microscopia Ottica DIAGNOSI Immunofluorescenza Microscopia Elettronica

3 IL GLOMERULO RENALE PODOCITI MEMBRANA BASALE GLOMERULARE CELLULE ENDOTELIALI CELLULE E MATRICE MESANGIALE

4 QUANDO E RICHIESTA LA MICROSCOPIA ELETTRONICA? Quando c è il sospetto di: minimal change disease, sindrome di Alport, malattia membrane sottili, glomerulopatia fibrillare, glomerulonefrite membranosa, glomerulonefrite membrano-proliferativa, glomerulonefrite postinfettiva, glomerulopatia da rigetto cronico di trapianto, Quando in microscopia ottica il quadro è apparentemente normale, non corrispondente alla clinica o difficile da interpretare Nel dubbio di malattie concomitanti

5 IN LETTERATURA E RIPORTATO CHE : Stirling, Curry and Eyden: Diagnostic electron microscopy, RMS-Wiley, 2013

6 SE VIENE CHIESTA LA M.E. (NEL 30% DEI CASI CIRCA), LA BIOPSIA RENALE VIENE COSI DIVISA: UNA PARTE (50%) FISSATA IN FORMALINA PER LA MICROSCOPIA OTTICA UNA PARTE (30%) A FRESCO CHE VIENE SUBITO CONGELATA PER L IMMUNOFLUORESCENZA UNA PARTE (20%) FISSATA IN LIQUIDO DI KARNOVSKY (FORMALDEIDE+GLUTARALDEIDE) PER LA MICROSCOPIA ELETTRONICA IMPORTANTE CHE LA FISSAZIONE SIA TEMPESTIVA E CHE IL MATERIALE SIA ADEGUATO (CORTICALE)) IN TUTTE E 3 LE BIOPSIE AL MICROSCOPIO ELETTRONICO NELLA MAGGIOR PARTE DEI CASI SERVE L ANALISI DEI GLOMERULI!!!

7 E SE NON ARRIVA LA BIOPSIA PER M.E., MA A POSTERIORI CI SI RENDE CONTO CHE SERVE? recuperare del materiale da una parte della biopsia in paraffina recuperare la biopsia congelata recuperare la sezione dal vetrino

8 RECUPERO DA PARAFFINA

9 RECUPERO DA PARAFFINA FUSIONE PEDICELLI (MINIMAL CHANGE DISEASE) DEPOSITI SOTTOEPITELIALI (GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA)

10 RECUPERO DA TESSUTO CONGELATO

11 RECUPERO DA TESSUTO CONGELATO DEPOSITI SOTTOENDOTELIALI DEPOSITI SOTTOEPITELIALI (GLOMERULONEFRITE MEMBRANOPROLIFERATIVA) (GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA)

oggetto in xilolo Reidratazione Osmificazione Deidratazione Infiltrazione Inclusione Distacco delle piramidi in azoto

12 Materiale di partenza: Recupero per esame ultrastrutturale di sezioni istologica su vetrino sezioni >/= 5 micron di spessore, su vetrini NON POLARIZZATI colorate in EE, montante acrilico per istologia METODO Distacco copri-oggetto oggetto in xilolo Reidratazione Osmificazione Deidratazione Infiltrazione Inclusione Distacco delle piramidi in azoto liquido Tosoni A. Zini E. Barbiano di Belgiojoso G. Nebuloni M. Anatomia Patologica Ospedale-Polo Universitario Luigi Sacco Milano

13 OSSERVAZIONE AL M.E.: Occorre valutare 1-3 glomeruli, non sclerotici. Occorre effettuare l osservazione prima a piccolo ingrandimento (1000X), poi scendere nel dettaglio (generalmente fino a 20000X, o oltre), con documentazione fotografica con cui discutere col patologo e col nefrologo. Se alla fine il quadro ultrastrutturale non corrisponde a quello della microscopia ottica o alla clinica, occorre riprendere in considerazione tutti gli aspetti.

14 COSA GUARDARE AL M.E. Presenza, localizzazione e caratterizzazione di eventuali depositi nella membrana basale glomerulare (GBM) o nel mesangio. Variazioni di spessore e struttura della GBM. Modificazioni delle componenti cellulare e stromale del mesangio Alterazioni caratteristiche delle cellule del glomerulo (fusione dei pedicelli, presenza di TRI, )

15 DEPOSITI

16 Depositi sottoepiteliali (glomerulonefrite post-infettiva)

17 Depositi sottoendoteliali (nefrite da Lupus)

18 Depositi intramembranosi (glomerulonefrite membranoproliferativa di tipo II)

19 Depositi mesangiali (nefropatia da depositi di IgA)

20 DEPOSITI STRUTTURATI AMILOIDOSI RENALE (DIAM 10 NM) CRIOGLOBULINEMIA (DIAM NM) GLOMERULONEFRITE FIBRILLARE (DIAM 20 NM) GLOMERULONEFRITE IMMUNOTACTOIDE (DIAM 50 NM, con core chiaro)

21 ALTERAZIONI DELLA MEMBRANA BASALE GLOMERULARE Sindrome Alport Normale Glomerulopatia da membrane sottili

22 ALTERAZIONI CARATTERISTICHE DI ALCUNE CELLULE Inclusi tubulo-reticolari nelle cellule endoteliali (Lupus) Fusione dei pedicelli dei podociti (glomerulonefrite da lesioni minime)

23 CASO 1 Clinica: 29 anni. Macroematuria I.F.D. Si osservano 4 glomeruli. Positività segmentaria e focale di IgM (1+), IgA (1+), C3 (2+) e fibrinogeno (2+) mesangiale. Non si osservano depositi di C1q e IgG. M.O. Frustolo renale della lunghezza di mm 6 con conservazione sub-ottimale. Sono presenti complessivamente 6 glomeruli con minima tendenza alla lobulazione con focale riduzione del calibro delle anse. Lievi segni sofferenziali a carico degli epiteli tubulari. Non salienti alterazioni a carico dei vasi e dell'interstizio.

25 C3 IgA IgG

27 ESAME ULTRASTRUTTURALE. L esame ultrastrutturale di due glomeruli mostra un diffuso assottigliamento delle membrane basali (spessore medio 220 nm), che appaiono di tessitura regolare, seppur con alcuni aspetti di lieve sclerosi, specialmente nelle regioni paramesangiali. Non si osservano depositi elettrondensi nella membrana basale né nel mesangio. Il quadro morfologico ed ultrastrutturale complessivamente suggeriscono di considerare tra le altre possibilità anche una glomerulopatia da membrane sottili. CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA PERMESSO DI EVIDENZIARE LESIONI NON EVIDENZIABILI CON LA MICROSCOPIA OTTICA

28 CASO 2 Clinica: 51 anni. Sindrome nefrosica, proteinuria, grave ipoalbuminemia.

30 COLORAZIONE ARGENTICA (JONES)

33 M.E: CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA MODIFICATO LA STADIAZIONE DELLA GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA (DA STADIO II A STADIO III)

34 CASO 3 Clinica: 43 anni. Diabete mellito da 6 anni, proteinuria nefrosica ed insufficienza renale. I.F.D.: Sono presenti 5 glomeruli. Positività focale e segmentaria (2+) per IgM e IgA lungo le anse periferiche e il mesangio; C3 (1+) mesangiale. Negatività per IgG, C1q e Fibrinogeno. M.O.: 19 glomeruli 4 dei quali mostrano marcata scleroialinosi. I restanti glomeruli mostrano glomerulosclerosi diffusa moderata e focalmente severa con espansione mesangiale e diffuso aumento della matrice; in 9 glomeruli presenza di noduli mesangiali multipli prevalentemente ipocellulati; ispessimento della parete delle anse capillari, rari microaneurismi e singola "goccia capsulare".sclerosi capsulare e pericapsulare. Tubuli con alterazioni regressive epiteliali; marcato ispessimento delle membrane basali. Sclerosi interstiziale. Arteriolosclerosi di grado discreto. Quadro compatibile con glomeruloscleosi diabetica diffusa e nodulare di grado moderato.

36 PAS

37 C3 IgA IgM

38 M M

40 M.E: L'esame ultrastrutturale di due glomeruli evidenzia varie alterazioni riferibili a glomerulosclerosi diabetica: - diffuso ispessimento della membrana basale glomerulare, con zonale fusione dei pedicelli - aumento del mesangio, in particolare della componente amorfa - presenza di materiale elettrodenso tra la membrana basale glomerulare e le cellule endoteliali (ialinosi). In alcuni tratti della membrana basale glomerulare si osservano inoltre depositi elettrondensi sottoepiteliali e intramembranosi. CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA EVIDENZIATO, OLTRE AL QUADRO DI GLOMERULOPATIA DIABETICA, ASPETTI DI GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA

41 CASO 4 Clinica: 87 anni. Sindrome nefrosica, proteinuria.

43 COLORAZIONE ARGENTICA (JONES)

46 M.E: CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA CONFERMATO LA SOVRAPPOSIZIONE DI GLOMERULOSCLEROSI FOCALE SEGMENTALE A UN QUADRO DI GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA

47 CONCLUSIONI La microscopia elettronica è fondamentale per diagnosticare alcune glomerulonefriti In altri casi la microscopia elettronica può completare o correggere la diagnosi fatta al microscopio ottico

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