Necrosi Apoptosi Morte autofagica Necroptosi Piroptosi Anoikis Catastrofe mitotica Etc. etc

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1 Danno cellulare e morte cellulare Il danno cellulare si manifesta quando sia la risposta di stress che di adattamento non sono in grado di mantenere e/o ripristinare la corretta omeostasi cellulare. Il danno può progredire da uno stato di reversibilità ad uno stato di irreversibilità che culmina con la morte cellulare. Esistono differenti tipi di morte cellulare che differiscono per morfologia, meccanismi di attivazione, ruolo fisiologico e/o patologico Necrosi Apoptosi Morte autofagica Necroptosi Piroptosi Anoikis Catastrofe mitotica Etc. etc

2 Alterazioni morfologiche del danno cellulare Tutte le noxae patogene agiscono prima a livello molecolare e biochimico. C è un intervallo di tempo più o meno variabile tra evento biochimico/molecolare e comparsa di cambiamenti morfologici.

3 Il danno cellulare deriva dall azione di differenti meccanismi biochimici che agiscono su differenti componenti cellulari Irreversibilità del danno: - Incapacità di revertire la disfunzione mitocondriale - Profonda alterazione della funzionalità di membrana

4 Fosforilazione ossidativa Glicolisi ph Attivazione ATPasi 1. Deplezione di ATP

5 2. Formazione di radicali liberi derivati dall ossigeno

6 3. Accumulo di Ca2+ intracellulare e perdita dell omeostasi del Ca2+

7 Attivazione delle proteasi intracellulari

8 Alterazioni del citoscheletro

9 4. Difetti nella permeabilità di membrana

10 5. Danno mitocondriale

11 Eventi biochimici sequenziali che portano alla necrosi da ipossia/ischemia Danno reversibile Fosforilazione ossidativa mitocondriale ATP Pompa Na+ Entrata Ca2+, Na+, H2O Uscita K+ Glicolisi ph glicogeno Distacco ribosomi Sintesi proteica Deposizione lipidi

12 Danno irreversibile ph + Entrata di H2O Danno mitocondriale Danno di membrana Perdita fosfolipidi Alterazioni citoscheletro Radicali liberi ossigeno Rilascio intracellulare Attivazione degli enzimi lisosomiali Degradazione lipidica Fuoriuscita di enzimi Entrata di Ca2+ Modificazioni nucleari Digestione proteica Ca2+ nei mitocondri

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14 QUAL É IL PUNTO DI NON RITORNO? DISFUNZIONE MITOCONDRIALE ALTERATA PERMEABILITÁ DA DANNO ALLE MEMBRANE CELLULARI

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16 Apoptosi Necroptosi, piroptosi M Morte autofagica Necrosi Entosi, Anoikis

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18 NECROSI CELLULARE Gamma di modificazioni morfologiche in un tessuto che seguono la morte cellulare non sostenuta da un programma genetico e che sono in gran parte il risultato della denaturazione e/o della degradazione enzimatica delle cellule danneggiate irreversibilmente

19 Le modificazioni morfologiche seguite alla morte cellulare non programmata sono conseguenza di un DANNO: INCAPACITA da parte della cellula che ha subito l insulto di mantenere il proprio equilibrio omeostatico all interno di limiti tollerabili

20 Modificazioni morfologiche caratteristiche della morte cellulare non programmata a. Modificazioni delle dimensioni della cellula b. Modificazioni delle superficie cellulare c. Alterazioni organuli citoplasmatici d. Alterazioni nucleari

21 a. Modificazioni delle dimensioni della cellula Rigonfiamento cellulare Citoplasma Reticolo endoplasmatico Apparato di Golgi Mitocondri Eccessivo accumulo di liquidi Al microscopio i gradi progressivi del rigonfiamento cellulare vengono descritti come: Rigonfiamento mitocondriale o rigonfiamento torbido Degenerazione idropica Degenerazione vacuolare

22 Degenerazione idropica e rigonfiamento torbido Aspetti lievemente differenti sul piano morfologico caratterizzati da: alterazioni della membrana cellulare aumento del volume cellulare citoplasma ingrandito e poco colorabile nucleo in posizione centrale granulosità diffusa mitocondri rigonfi con cristae disorganizzate disorganizzazione del RER con ribosomi dispersi lisosomi alterati

23 Degenerazione vacuolare Variante o evoluzione sul piano morfologico del rigonfiamento idropico La granulosità diffusa del rigonfiamento idropico assume aspetto vacuolare (materiale debolmente eosinofilo) Vacuoli di varie dimensioni, tondeggianti o ovali Rapporto con il sistema fagolisosomiale

24 Rigonfiamento idropico epatico Rubin, Patologia 2206 Casa editrice Ambrosiana

25 Degenerazione vacuolare epatica

26 Rubin, Patologia 2206 Casa editrice Ambrosiana Rigonfiamento torbido epatico

27 b. Modificazioni delle superficie cellulare Perdita o alterazione delle strutture specializzate di membrana (ciglia, microvilli e giunzioni intercellulari). Dilatazione, vescicolazione, lipoperossidazione Frammentazione Rotture multiple Lisi

28 blebs scomparsa microvilli degenerazione idropica CELLULA EPITELIALE NORMALE TUBULO PROSSIMALE RENALE rottura membrana rigonfiamento e rottura membrana mitocondriale

29 c. Alterazioni organuli citoplasmatici Mitocondri: Fase precoce condensazione della matrice mitocondriale. Fase tardiva rigonfiamento torbido con alterazioni delle cristae e diminuzione dei depositi densi contenenti Ca2+ nella matrice mitocondriale Reticolo endoplasmatico rugoso: Dilatazione, vescicolazione e distacco dei ribosomi Apparato di Golgi: Dilatazione delle cisterne o in alcuni casi atrofia Perossisomi: Alterazione del numero (aumento ROS) Lisosomi: Vacuolizzazione e disintegrazione dei lisosomi che riversano il loro contenuto nel citoplasma e nel microambiente.

30 Picnosi: d. Alterazioni nucleari Riduzione progressiva del nucleo per perdita di materiale nucleare più intensamente colorabile Carioressi: Frammentazione del nucleo in zolle di varia grandezza. Cariolisi: Il nucleo si disgrega in zolle di piccole dimensione e si scioglie nel citoplasma. Vacuolizzazione nucleare: Disintegrazione circoscritta a certe zone del nucleo Attivazione enzimi idrolitici intranucleari o distruzione diretta degli acidi nucleici.

31 Picnosi, Carioressi e Cariolisi cariolisi

32 ASPETTI MORFOLOGICI DELLA NECROSI Denaturazione delle proteine Digestione enzimatica delle proteine Necrosi coagulativa prevale la denaturazione delle proteine Necrosi colliquativa prevale la digestione enzimatica delle proteine

33 Necrosi : varie tipologie istologiche N. COAGULATIVA N. COLLIQUATIVA N. CASEOSA

34 Necrosi coagulativa Conservazione dell architettura generale del tessuto (causa: ipossia in tutti i tessuti, eccetto il cervello) con aspetto torbido e colore bianco grigiastro. Necrosi caseosa, caratteristica delle lesioni tubercolari.

35 NECROSI COAGULATIVA INFARTO DEL MIOCARDIO INFARTO RENALE

36 Necrosi caseosa Fegato Polmone

37 Necrosi colliquativa Caratteristica delle infezioni focali batteriche per attivazione dell infiammazione. Cellule colpite ricche di enzimi lisosomiali funzionanti Quantità d acqua sufficiente. La morte da ipossia del tessuto nervoso innesca necrosi colliquativa cisti apoplettiche

38 NECROSI COLLIQUATIVA POLMONE CERVELLO

39 Cancrena La necrosi interessa un estensione cospicua o un organo intero con mancata irrorarazione Secca prevale l evaporazione sui processi litici Umida prevalgono i processi colliquativi. Gassosa in rapporto con l azione di germi anaerobi

40 Cancrena secca Cancrena umida

41 ASPETTI EVOLUTIVI DELLA NECROSI Deposizione di calcio All inizio i depositi non sono ancora visibili al microscopio, ma presto compaiono sotto forma di granulazioni basofile, generalmente più piccole del nucleo. Liberazione dalle membrane di colesterolo Il colesterolo si libera dalle membrane e poiché è insolubile in acqua, cristallizza in sottili lamelle romboidali. Figure mieliniche Doppi strati lipidici sovrapposti che assumono la forma di sfere, di cilindri e di spirali. Sono cristalli liquidi e riflettono la naturale tendenza dei fosfolipidi a formare dei doppi strati. I fosfolipidi con carica negativa, come la fosfatidil-serina, sono quelli che idratandosi si rigonfiano maggiormente.

42 Apoptosi Necroptosi, piroptosi M Morte autofagica Necrosi Entosi, Anoikis

43 APOPTOSI: morte cellulare programmata o suicidio cellulare È una modalità di morte cellulare attiva, tipica di cellule di organismi pluricellulari È una forma di suicidio altruista : spesso la cellula si sacrifica per il bene dell intero organismo Le modalità della morte sono finalizzate a evitare l instaurarsi di fenomeni di INFIAMMAZIONE e di AUTOIMMUNITÀ Il fatto che non dia luogo a fenomeni di infiammazione fa sì che la morte cellulare non sia avvertita dall organismo (morte indolore)

44 La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi A LIVELLO CITOLOGICO L APOPTOSI SI MANIFESTA CON: Condensazione del nucleo e del citoplasma Frammentazione della cellula in vescicole (corpi apoptotici) Fagocitosi da parte dei macrofagi

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46 PERCHÉ SI PARLA DI PROGRAMMA APOPTOTICO VIENE PORTATO AVANTI ATTIVAMENTE, CIOÈ CON DISPENDIO DI ENERGIA È INNESCATO DA INDUTTORI SPECIFICI RICHIEDE L'AZIONE DEI PRODOTTI SPECIFICI DI ALCUNI GENI

47 CIRCOSTANZE IN CUI SI OSSERVA APOPTOSI Sviluppo embrionale/fetale e metamorfosi Normale turn-over tissutale Ontogenesi e omeostasi del sistema immunitario Atrofia ormono-dipendente Deprivazione di fattori di crescita Perdita di contatto cellula-cellula e cellulasubstrato (Anoikis) Tossine, farmaci Radiazioni Infezioni virali Citotossicità cellulo-mediata

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49 FASI DELL APOPTOSI FASE DI INNESCO durante la quale la cellula riceve i segnali che scatenano l apoptosi. CONTROLLO E INTEGRAZIONE i segnali di morte applicati nella fase precedente vengono connessi da una serie di proteine specifiche (con ruolo sia positivo che negativo) al programma esecutivo comune FASE COMUNE DI ESECUZIONE consiste nell attivazione di una cascata di proteasi specifiche, le caspasi, a loro volta distinte in iniziatrici ed esecutrici in base all ordine con il quale vengono attivate. RIMOZIONE DELLE CELLULE MORTE: le cellule apoptotiche e i loro frammenti esprimono dei marcatori di membrana che facilitano il loro precoce riconoscimento da parte di cellule adiacenti o di fagociti. Le cellule morte vengono così completamente distrutte senza indurre una reazione infiammatoria.

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51 Meccanismi di innesco dell Apoptosi

52 Via Estrinseca: i recettori di morte Ne sono noti almeno cinque, tra cui il recettore per il TNF e il Fas/Apo1/CD95 Rispondono a segnali di tipo omeostatico, generati da altre cellule dello stesso organismo Quando il ligando (TNF o FasL) si è associato alla porzione extracellulare del recettore, questo trimerizza e la porzione intracellulare* dirige la formazione di un complesso proteico con proteine adattatrici I segnali generano una cascata di attivazione di enzimi proteolitici specifici, detti caspasi *La porzione intracellulare è caratterizzata da un dominio DD (Death Domain)

53 TNFR-1 : recettore con due significati

54 c-flip Proteina antiapoptotica Tre isoforme Cancer Letters Volume 332, Issue 2, 28 May 2013, Pages In assenza di cflip procaspase 8 viene reclutata dal recettore di morte dimerizza e viene attivata con innesco di apoptosi In presenza di cflips reclutato al recettore vi è inibizione della dimerazzazione e del clivaggio di procaspase 8 che rimane inattiva. Quando viene reclutato cflip L procaspasi-8 forma eterodimeri con c-flip L limitando il clivaggio di procaspasi 8. L eterodimero procaspase 8/ c-flip L può clivare altre proteine tra cui RIP portando ad attivazione di NF-kB e altre vie di segnalazione inclusa quella delle MAPK come ERK inibendo l apoptosi.

55 Via intrinseca mitocondriale La perdita dei segnali di sopravvivenza, il danno al DNA, o altri insulti portano all attivazione di proteine pro-apoptotiche che determinano la formazione di canali nella membrana mitocondriale con fuoriuscita del citocromo c e attivazione della caspasi 9

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57 Famiglia Bcl-2 Proteine che localizzandosi sulla membrana esterna del mitocondrio, favoriscono (se proapoptotici) o rendono meno facile (se antiapoptotici) la formazione di megacanali e la conseguente fuoriuscita di molecole proapoptotiche Sono strutturalmente simili tra loro (domini BH1-4 + dominio transmembrana) Anti-apoptotici: Bcl-2, Bcl XL, ced-9 Pro-apototici: Bad, Bax, Bak, egl-1 Stimoli endogeni ed esogeni alterano la loro quantità, localizzazione e stato di attività

58 Meccanismo di regolazione dell apoptosi da parte di proteine della famiglia Bcl-2 Danno innescato da stimoli interni (radiazioniuv, stress ossidativo etc) induce il rilascio del citocromo c dai mitocondri. citocromo C si lega ad Apaf a alla procaspasi 9 (apoptosoma) inducendo la proteolisi e l attivazione di quest ultima. Rilascio citocromo C regolato dalla famiglia di proteine Bcl-2 ad attività pro o anti apoptotica. Bax : canali ad alta conducibilità Caspasi effettrici APOPTOSI

59 La suscettibilità alla morte per apoptosi è contollata dall equilibrio tra dimeri della famiglia Bcl2

60 CASPASI: effettori dell apoptosi C = cisteina nel centro reattivo; ASP = riconoscono un residuo di acido aspartico nell ambito di una sequenza di 4 amminoacidi; ASI = sono enzimi proteolitici Caspasi iniziatrici (2, 8, 9, 10) attivate dagli adattatori Caspasi effettrici (3, 6, 7) Attivate dalle caspasi iniziatrici. L attivazione consiste nel taglio proteolitico, con formazione di due frammenti; i 2 frammenti brevi e i 2 frammenti lunghi di due caspasi uguali formano un tetramero

61 DD= death domain DED= death effector domain CARD= caspase recruitment domain

62 Attivazione delle caspasi

63 Bersagli delle caspasi

64 ENDONUCLEASI: effettori dell apoptosi CAD. Legato all inibitore I-CAD, viene attivato quando l inibitore viene tagliato dalle caspasi. Tipicamente responsabile dei tagli inter-nucleosomici. È localizzato nel nucleo. AIF. Liberato dai mitocondri quando si forma il megacanale, determina la formazione di frammenti ad alto peso molecolare. Endo-G. Liberato dai mitocondri quando si forma il megacanale, determina tagli a singolo filamento

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67 La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

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69 Morfologia dell Apoptosi DIMINUZIONE DELLE DIMENSIONI CELLULARI la cellula diventa più piccola con citoplasma addensato e organelli addensati. CONDENSAZIONE DELLA CROMATINA aspetto più caratteristico dell apoptosi: la cromatina si aggrega ala periferia al di sotto della membrana nucleare. Frammentazione nucleare FORMAZIONI DI ESTROFLESSIONI CITOPLASMATICHE E CORPI APOPTOTICI formazione dei blebs e frammentazione del citoplasma nei corpi apoptotici rivestiti di membrana plasmatica composti da citoplasma e organelli FAGOCITOSI DELLE CELLULE O DEI CORPI APOPTOTICI DA PARTE DELLE CELLULE SANE ADIACENTI.

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75 Morte cellulare autofagica La morte cellulare è spesso accompagnata da elevato numero di autofagosomi e aumentati livelli di autofagia La morte autofagica si manifesta quando le cellule non sono in grado di indurre apoptosi, che rimane la via preferenziale di morte programmata.

76 Problematica controversa Spesso la morte cellulare si accompagna ad un aumento di autofagosomi ma ad un blocco del flusso autofagico. Il termine di morte autofagica dovrebbe essere riservato a tutti quei casi in cui la morte cellulare viene inibita da inibitori specifici dell autofagia ed è mediata da un aumentato flusso completo autofagico.

77 Morte cellulare con autofagia o morte cellulare autofagica pro-survival o pro-death?

78 Necroptosi La necroptosis è un tipo di morte cellulare programmata regolata dalle proteine Receptor-Interacting Protein 1 (RIP1), RIP3 e Mixed Lineage Kinase Domain- Like (MLKL) proteina. La necroptosi si manifesta in risposta a stimoli severi quando l apoptosi è bloccata o può essere indotta durante i processi infiammatori da citochine proinfiammatorie o da agenti chemioterapici. Innesca una risposta immunitaria importante e può servire come un meccanismo di difesa eliminando per esempio cellule mutate o infettate da virus oncogeni. Rottura e permeabilizzazione della plasmamembrana Rigonfiamento e vacuolizzazione del citoplasma Rigonfiamento dei mitocondri Lisi nucleare Biochimica et Biophysica Acta 1865 (2016)

79 La necroptosi è spesso innescata dagli stessi segnali che mediano l attivazione della via estrinseca dell apoptosi (recettori etc. ). In condizioni normali RIP1 è ubiquitinato da ciap innescando l attivazione di segnali pro-survival mediate da NFkB e MAPKs. L ubiquitinazione di IAP promuove la deubiquitinazione di RIP1 che si dissocia dalla membrane plasmatica e innesca attivazione di caspase 8 attraverso il legame di FADD, inducendo apoptosi. Caspasi-8 attivata inibisce la necroptosi perchè degrada RIP1 e RIP3, ma se caspasi 8 non funziona RIP1 e RIP3 dimerizzano e fosforilano MLKL. MKL ha un elevate affinità per i fosfolipidi e la cardiolipina provocando danno di membrana

80 La necroptosi funzione come meccanismo di salvezza per uccidere le cellule che per qualche motive (blocco caspasi nelle cellule tumorali) non muoiono per apoptosi (possibile impiego terapeutico??????) Biochimica et Biophysica Acta 1865 (2016)

81 Apoptosi vs Necrosi

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