Purificazione e de novo sequencing di Pol1 e Pol2 due nuovi peptidi antibatterici isolati dalla saliva di larve di Polistes dominulus

Transcript

1 Purificazione e de novo sequencing di Pol1 e Pol2 due nuovi peptidi antibatterici isolati dalla saliva di larve di Polistes dominulus

2 Interazione ospite-patogeno Gli insetti non hanno un sistema di difesa antigeneanticorpo, caratteristico del sistema immunitario dei vertebrati Gli insetti riconoscono dei pattern molecolari associati ai patogeni (Pathogen associated molecular pattern PAMPs) utilizzando delle molecole chiamate recettori di riconoscimento per Pattern patogeni (pattern recognition receptors PRRs) Drosophila melanogaster è stato scelto come modello per lo studio della risposta umorale innata verso batteri e funghi

3 ANTIMICROBIAL PEPTIDES (AMPs) Antifungini (Candida, Cryptococcus, Aspergillus) Antiparassitari (Malaria, Leishmania, Trypanosoma) Antibatterici Gram positivi Gram negativi Antivirali

4 ANTIMICROBIAL PEPTIDES Piccole proteine cariche positivamente Prodotti da fat body e epitelio dotto gastrico Divisi in tre classi principali negli insetti: 1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina, con struttura ad α-elica 2) Peptidi stabilizzati da Cisteina 3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina

5 1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina, con struttura ad α-elica residui Random coil in soluzione, α- Cecropina A di Hyalophora (farfalla) elica a contatto con membrana Gram-

6 2) Peptidi stabilizzati da Cisteina residui 2-6 Kda Loop N-terminale, α-elica e due Defensina di Phormia (mosca) fogliettiβ antiparalleli, stabilizzati da 3 ponti di-solfuro Gram+, Gram-, Fungi

7 3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina Proline rich: es.apidecina Random coil Gram+, Gram- Glycine rich: es. Diptericina e Gloverina Gram- Organism of origin Name Primary structure Drosophila melanogaster Drosocin GKPRPYSPRPTSHPRPIRV Metchnikowin HRHQGPIFDTRPSPFNPNQPRPGPIY Apis mellifera Apidaecin IA GNNRPVYIPQPRPPHPRI Bombus pascuorum Abaecin FVPYNPPRPGQSKPFPSFPGHGPFNPKIQWPYPLPNPGH Myrmecia gulosa Formaecin 1 GRPNPVNNKPTPHPRL Bombyx mori Lebocin 3 DLRFLYPRGKLPVPTLPPFNPKPIYIDMGNRY Trichoplusia ni Lebocin SLPSLRLPGRNFPIPPTTPPFVPKPRRFPIYV Pyrrhocoris apterus Pyrrhocoricin VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN Palomena prasina Metalnikowin I VDKPDYRPRPRPPNM AA, 25% Pro

8 Attività antibatterica di saliva di P.dominulus Microorganism Antimicrobial Antimicrobial Volume of saliva No. tests No. positive standard 1 volume (µl) (µl) performed tests of saliva 2 B. subtilis Penicillin G [1.15] [5.09 ± 0.93] E. coli Tetracycline [0.6] ] C. parapsilosis Nystatin [1.35] 25 (in disk) C. albicans Nystatin [1.15] 25 (in disk) [7.88 ±

9 Purificazione componenti antibatteriche della saliva di Polistes dominulus Precipitazione frazionata (etanolo 40%) Purificazione mediante RP-HPLC Saggi di attività antimicrobica (su B. subtilis) A B Analisi MALDI-TOF Proteine totali (µg) Attività antibatterica (ng di penicillina) Peptide A 94,5 7,2 Peptide B ,5

10 Analisi MALDI-TOF Peptide A Peptide B

11 Sequenza peptide A Degradazione di Edman Spettrometria MALDI-TOF Spettrometria ESI-Trap ESI-Trap sul frammento interno R G N I P I I P V V P N V P R L V D P K S Proline-rich peptide

12 Caratterizzazione peptide A Produzione per sintesi chimica del peptide A Saggi di attività antibatterica negativi (attivi solo ad alte concentrazioni) Spettro in dicroismo circolare (CD) Non altamente strutturato (picco negativo a 200 nm) Predizione struttura secondaria

13 Riattivazione peptide A sintetico - Trattamento con Peptidil Prolil Isomerasi (PPI) - Riattivazione su piastra (isomerizzazione a contatto con il bersaglio) - Riattivazione su resina con ancorato PPI - Riattivazione su colonna a scambio cationico

14 Riattivazione su colonna a scambio cationico Attività su B.subtilis

15 Conclusioni I PEPTIDE A Appartiene alla sottofamiglia dei peptidi ricchi in Prolina UniProt Knowlwdgebase Accession number Pol2 P86457 Prodotto sinteticamente non si è dimostrato attivo e neanche riattivabile in buona resa a seguito di vari trattamenti Isolamento gene ed espressione eterologa

16 Caratterizzazione peptide B Degradazione di Edman Analisi di AA AA Picco B Asx 0,23 (1,4) Thr 0,27 (1,6) Ser 0,43 (2,5) Glx 0,47 (2,8) Gly 0,6 (3,5) Ala 0,18 (1,0) Val 0,25 (1,5) Met 0 Ile 0,19 (1,1) Leu 0,17 (1,0) Tyr 0 Phe 0 Lys 0,16 (1,0) His 0 Arg 0,42 (2,5) X Cys? Carbamidometilazione Da / 57 = 6 Cys

17 Caratterizzazione peptide B L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R Polistes dominulus Culicoides sonorensis Trattamento con Arginina-C-proteasi

18 Analisi MALDI-TOF Peptide 5 Arg-C ? relative abundance m/z Peptide 7 Arg-C? relative abundance m/z Peptide 10 Arg-C relative abundance Regione N-terminale m/z

19 Peptide 10 L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R.. Intensity [a.u.] HO-R G Q Y A C CAM S S Intensity [a.u.] S C CAM G I/L I/L G G I/L Q C CAM S I/L m/z m/z Confermata la sequenza L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R

20 Peptide 5 Degradazione di Edman Culicoides sonorensis L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R S G C Y C N R Polistes dominulus Peptide 5 Purtroppo i risultati degli esperimenti MS/MS non hanno fornito utili informazioni

21 Peptide 7 Culicoides sonorensis L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R D G V C I.. S G C Y C N R Polistes dominulus Peptide 7 L Peptide 5 relative abundance ???? LIFT Picco 7 m/z serie y I/L CAM-C relative abundance CAM-C V G D LIFT Picco 7 m/z serie y m/z m/z

22 Conclusioni II PEPTIDE B La presenza di 6 Cys e l allineamento con altre proteine simili portano a concludere che sia appartenente alla famiglia delle DEFENSINE Sono stati ottenuti dati parziali sulla sequenza (UniProt Knowlwdgebase Accession number Pol2 P86458) Come per il PEPTIDE A isolamento del gene

23 Dipartimento di Scienze Biochimiche Luigia Pazzagli Eleonora Pagni Gianni Cappugi Centro Interdipartimentale Spettrometria di Massa Guido Mastrobuoni Gloriano Moneti Stefano Turillazzi