FibroMAX: Investigator s Brochure

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1 1 FibroMAX: FibroTest, SteatoTest, NashTest, ActiTest e AshTest Investigator s Brochure Contenuti Indice abbreviazioni e definizioni 1. Introduzione Limitazioni della biopsia epatica per la diagnosi della steatosi, fibrosi e NASH Razionale scientifico del Test FibroMax Dati amministrativi su FibroMax, Brevetto e Marketing Le più recenti raccomandazioni dell Autorità Sanitaria Francese per l utilizzo di Fibrotest Raccomandazioni pre-analitiche per FibroMax FibroMax pacchetto di biomarcatori: FibroTest, ActiTest, SteatoTest, NashTest e AshTest FibroTest-ActiTest-FibroSURE panoramica Standardizzazione dell AUROC osservato in accordo alla prevalenza di step individuali di fibrosi FibroTest-FibroSURE Metanalisi: validazione totale nelle quattro malattie epatiche più comuni ActiTest valore diagnostico nell epatite cronica virale SteatoTest marcatore sierologico universale della steatosi (fegato grasso) Introduzione Scoperta, validazione interna, confronto con l ecografia, GGT e ALT... 24

2 SteatoTest validazione esterna nei pazienti con NAFLD nel gruppo di studio CYTOL Miglioramento della Steatosi con SteatoTest dopo trattamento HCV NashTest marcatore sierologico della steatoepatite non-alcolica (NASH) Introduzione Scoperta e validaizone esterna (Gruppo di Studio CYTOL Pazienti con NAFLD) AshTest marcatore della gravità della steatoepatite alcolica (ASH) Introduzione Scoperta e validazione Strategie di screening con biomarcatori non-invasivi: FibroMAX (FibroTest, SteatoTest, NashTest) Efficacia dello screening dei dislipidemici con biomarcatori non-invasivi Efficacia dello screening dei diabetici con biomarcatori non-invasivi Conclusione FibroMAX pacchetto: come e quando usare i biomarcatori non-invasivi, algoritmi raccomandati Miglior gestione dei pazienti con fattori di rischio metabolici (sovrappeso, dislipidemia, diabete) FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest and NashTest Miglior gestione dei pazienti con eccessivo abuso di alcol FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest and AshTest Miglior gestione dei pazienti con epatite cronica virale FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest and ActiTest Bibliografia... 49

3 3 Indice delle abbreviazioni e definizioni A0, A1, A2, A3: METAVIR scoring system per misurare il grado di attività: A0=no attività del fegato, A1=attività minima A2=attività moderata, A3= attività severa A2M: alfa2-macroglobulina AdAUROC: adjusted Area Under the ROC curve [AdAUROC= x (DANA)] AFEF: Association Française pour l Etude du Foie (associazione francesce per lo studio de fegato) ALD: alcoholic liver disease (malattia epatica alcolica) ALT, ALAT: alanina aminotransferasi AP-HP: Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Assistenza Pubblica Ospedali di Parigi APO A1: Apolipoproteina A1 APRI: AST to platelet ratio index ASH: alcoholic steatohepatitis (steatoepatite alcolica) AST, ASAT: aspartate aminotransferasi AT: ActiTest AUROC: Area Under the ROC curve BD: blood donors (donatori di sangue) BIL or BILI: bilirubina totale BMI: body mass index [peso (kg)/altezza²(cm)] CHC: chronic hepatitis C (epatite cronica C) CNRS: Centre National de la Recherche Scientifique CT : colesterolo totale difference between the mean fibrosis stages in the advanced fibrosis and non DANA: advanced fibrosis groups (differenza tra il grado di fibrosi medio tra un gruppo con fibrosi avanzata e un gruppo con fibrosi non avanzata) EALT: Elevated ALT (Alt elevate) ESSEC: Ecole Supérieure des Sciences Economiques et Commerciales F0, F1, F2, F3, F4: METAVIR scoring system: F0=no liver fibrosis, F1=portal fibrosis, F2=portal fibrosis with few septas, F3=portal fibrosis with many septas, F4=cirrhosis FibroSURE LabCorp e BioPredictive Inc hanno siglato un accordo di esclusiva per offrire FibroSURE che unisce FibroTest (FT) e ActiTest (AT) in un unico test. La letteratura pubblica fa riferimento a FibroTest-ActiTest. FibroSURE è un marchio trademark di LabCorp. FT: FibroTest GGT: gamma-glutamil-transpeptidasi Gilbert s syndrome: congenital partial enzymatic deficiency of glucuronyl-transferase with increased fluctuating non-conjugated bilirubin level with occasional asymptomatic jaundice. HAPTO: haptoglobin (aptoglobina) HBV: hepatitis B virus, (Virus epatite B)

4 4 HCV: hepatitis C virus (Virus epatite C) HCV-RNA: hepatitis C viral load (carica virale epatite C) HDL, HDL-C: high density lipoprotein, HDL-cholesterol (lipoproteina ad alta densità, colesterolo HDL) HIV: human immunodeficiency virus (virus umano immunodeficiente) HOMA-IR: homeostasis model assessment of insulin resistance / modello omeostatico per l insulino-resistenza HR, HRFP, HRFN: IGF: IGFBP-1: INSERM : Knodell score: Maddrey-DF: METAVIR: NAFLD: NAS: high risk false positive, high risk false negative / alto rischio di falsi positivi-falsi negativi Insulin-like Growth Factor Insulin-like Growth Factor Binding Protein-1 Institut National de la Recherche et de la Santé Médicale histological scoring system, (ranging from 0 to 22), assessing the piecemeal necrosis (0-10), intralobular necrosis (0-4), portal inflammation (0-4) and fibrosis (0-4) / sistema di misurazione istologico Maddrey discriminant function /funzione discriminante histological scoring system assessing the activity (necro-inflammatory lesions) in 4 grades (A0 to A3) and liver fibrosis in 5 stages (F0 to F4) / sistema di misurazione istologico che misura l attività (lesioni necro-infiammatorie) in 4 stadi (da A0 a A3) e la fibrosi epatica in 5 stadi (da F0 a F4) Non-Alcoholic Fatty Liver Disease new histological score for the diagnostic of non-alcoholic steatohepatitis (Kleiner&al.2005) non-alcoholic steatohepatitis negative predictive value observed Area Under the ROC curve NASH: NPV: ObAUROC: OR: Odds Ratio P: probability level, significant difference is considered as p<0.05 (livello di probabilità, differenza signfificativa a partire da p<0.05) PEG-IFN (alpha2b): pegylated alpha2b-interferon PMN: polymorphonuclear neutrophils PNALT: persistently normal ALT (alanine amino transferases) PPV: positive predictive value R: correlation coefficient ROC: receiver operating characteristic curve SAA: serum amyloid A SAA HDL: complexe between serum amyloid A and HDL S0, S1, S2, S3-S4: S0=No steatosis, S1=mild steatosis (1-5%), S2=moderate steatosis (6-32%), S3S4=marked to severe steatosis (>33%)

5 5 Se: SE: Sp: ST: SVR: TB: TG: USPTO: sensitivity se standard error specificity SteatoTest sustained viral responder total bilirubin serum triglycerides United States Patent and Trademark Office

6 6 1. Introduzione FibroMax è una combinazione di cinque test epatici non-invasivi : FibroTest, ActiTest, SteatoTest, NashTest e AshTest. Questi marcatori usano un campione di sangue e perciò possono essere utilizzati in prima istanza per poi prendere una decisione di trattamento; la biopsia epatica può essere utilizzata come metodo alternativo secondario solo se necessario. FibroTest e ActiTest sono alternative non-invasive alla biopsia epatica prima in pazienti con virus da epatite C (HCV) e poi in pazienti con infezione cronica da virus epatite B (HBV) e steatosi alcolica (ALD) e non alcolica (NAFLD). Il FibroTest stabilisce il grado di fibrosi (scarring) nei pazienti con HCV, HBV, ALD e NAFLD. 1-6 L ActiTest, il grado di attività (necrosi e infiammazione) nei pazienti con HCV e HBV. 1 Entrambi i test sono dettagliati in una brochure separata la cui ultima versione è disponibile sul sito internet : Recentemente Biopredictive ha sviluppato tre nuovi test non invasivi: uno (SteatoTest) 7 per la diagnosi della steatosi epatica nei pazienti con HCV, HBV, ALD e NAFLD, uno per la steatoepatite in ALD (AshTest) 8 e uno per la NAFLD (NashTest) 9. Nuovi gruppi, SteatoTest, NashTest e AshTest sono stati sviluppati combinando gli stessi 6 componenti del FibroTest- ActiTest (alfa2-macroglobulina, aptoglobina, apolipoproteina A1, GGT, bilirubina totale e ALT) aggiustati in funzione dell età, del sesso e del BMI, oltre a glicemia a digiuno, trigliceridi, colesterolo e AST. Dati che riguardano l istologia epatica sono considerati essenziali per prendere le decisioni terapeutiche e per seguire i pazienti che soffrono delle più comuni malattie croniche epatiche : HCV, HBV, ALD e NAFLD. Prima dello sviluppo del FibroTest-ActiTest, solo l istologia epatica poteva essere validata correttamente dalla biopsia epatica, di solito eseguita per via intercostale. Comunque sia, le numerose limitazioni della biopsia epatica non la rende una procedura utilizzabile su vasta scala. Inoltre, l alta variabilità del campionamento nelle malattie epatiche croniche fa della biopsia un marcatore indiretto della realtà poiché il vero gold-standard è il fegato nella sua interezza. Il lancio di questi prodotti sul mercato permette di semplificare la gestione medica e la supervisione dei pazienti in tutto il mondo.

7 7 2. Limitazioni della biopsia epatica per la diagnosi della steatosi, fibrosi e NASH Vari studi sulla biopsia epatica nell epatite C cronica hanno dimostrato che questa procedura non è completamente adatta alla gestione dell epatite C cronica 10,11. La biopsia epatica è costosa, 12 può essere vista dai pazienti come una procedura aggressiva, è propensa alle complicazioni (30%) inclusa la morte (0.3%), 13 ha una variabilità considerevole nel graduare la fibrosi e l attività, principalmente a causa dell errore di campionamento I vantaggi e svantaggi dei biomarcatori rispetto alla biopsia epatica sono discussi in dettaglio nella Brochure del Fibrotest disponibile sui sito internet La stessa cosa è vera in altre malattie epatiche croniche che sono ancora più frequenti dell epatite C cronica : l epatite B cronica, 350 milioni, la steatosi alcolica e non alcolica con più di 1 miliardo di persone colpite in tutto il mondo. La variabilità del campionamento nella diagnosi della steatosi, fibrosi e steatoepatite nei pazienti con NAFLD Uno studio recente 18 in un gruppo di NAFLD con due campioni epatici prelevati da Ratziu et al. hanno mostrato l errore di campionamento della biopsia epatica e il loro impatto sulla diagnosi, sul grado di NASH e sulle sue caratteristiche istologiche individuali (steatosi, ballooning e corpi acidofili). Ratziu et al. hanno riportato una discrepanza di uno o più gradi di fibrosi nel 41%. 6/17 (35%) dei pazienti con fibrosi bridging in un campione aveva solo una debole o nessuna fibrosi nell altro campione e poteva essere sottostimata utilizzando un solo campione bioptico. Lo stesso studio ha dimostrato una significativa differenza (più del 20%) nell importanza della steatosi notata nel 18% dei pazienti. Un livello discordante è stato notato nel 33% dei casi nella stima semi-quantitativa del ballooning epatocitario. Un alto livello di discrepanza è stato notato per i corpi acidofili (27%). Nelle biopsie in cui è stata scoperta una fibrosi perisinusoidale, il grado era diverso tra i due campioni nel 49%. L epatite interfaccia e i Corpi di Mallory erano assenti nella maggioranza dei casi e le discrepanze erano del 4% e del 16% rispettivamente. Per una diagnosi completa della NASH compreso il ballooning e la fibrosi perisinusoidale, la diagnosi sarebbe stata mancata nel 36% dei casi. Questo studio suggerisce che non solo la diagnosi ma anche il grado sono stati significativamente alterati da

8 8 una variabilità di campionamento della biopsia epatica nei pazienti con NAFLD/NASH. La biopsia epatica non è uno strumento di screening adeguato nei pazienti con NAFLD Il numero dei pazienti a rischio per la NAFLD è talmente elevato che la biopsia epatica non rappresenta uno strumento pratico ed efficiente per identificare i soggetti a rischio di fibrosi avanzata. Infatti, si stima che il 15-20% della popolazione dell Europa Occidentale abbia una steatosi 19 e che più della metà degli Americani sia soprappeso o obeso. L incapacità della biopsia epatica nel risolvere le numerose sfide nello screening di massa hanno permesso lo sviluppo di sistemi non-invasivi, utilizzabili nell immediato e facili da utilizzare come i marcatori sierologici che hanno permesso un evoluzione nella gestione più efficace dei pazienti con patologie epatiche croniche frequenti. 3. Razionale scientifico dei test FibroMax Il razionale scientifico del FibroTest-ActiTest è dettagliato nella Brochure del FibroTestdisponibile sul sito internet SteatoTest, NashTest e AshTest utilizzano la combinazione degli stessi sei componenti del FibroTest-ActiTest (alfa2-macroglobulina, aptoglobina, apolipoproteina A1, GGT, bilirubina totale e ALT) aggiustata in funzione dell età, del sesso e del BMI, più glicemia a digiuno, trigliceridi, colesterolo e AST. I marcatori scelti possono essere facilmente automatizzati e fornire una quantificazione semplice e solida. Uno studio prospettico in fase I è stato realizzato permettendo l identificazione e la combinazione ottimale dei marcatori. Una seconda fase è stata realizzata per una prima validazione. Come per FibroTest-ActiTest, oltre alle procedure di controllo qualità, sono stati sviluppati degli algoritmi aggiuntivi per testare il rischio di errore (99% percentili). Ogni componente fornisce un razionale, con un valore aggiunto, per la stima delle caratteristiche istologiche fornite da ogni test. L Alfa2-macroglobulina (A2M) è una proteina sintetizzata nel fegato (epatociti, cellule stellate, granulomi). L Aptoglobina è una proteina sintetizzata dal fegato. L Apolipoproteina A1 (ApoA1) è una proteina sintetizzata dal fegato che trasporta

9 9 colesterolo. La Bilirubina è un pigmento risultante dalla degradazione degli eritrociti (emoglobina), che è normalmente captata nel sangue dal fegato e viene escreta dalla bile. La Gamma glutamil transpeptidasi (GGT), le transaminasi ALT e AST sono enzimi sintetizzati dagli epatociti. Il Glucosio (un carboidrato), il colesterolo totale e i trigliceridi (lipidi) sono dei componenti sierologici in cui il livello del siero sono dipendenti dall alimentazione e dal metabolismo. Razionale dello SteatoTest GGT, ALT, trigliceridi, colesterolo, glucosio e BMI sono stati associati in passato a steatosi di varia eziologia 20,21,22. ApoA1 è altamente associata al colesterolo HDL 21 e un associazione negativa è stata inoltre legata a una steatosi in caso di una fibrosi o infiammazione. Il vantaggio di combinare i biomarcatori della steatosi con quelli più specifici della fibrosi quali l A2M, l aptoglobina e la bilirubina è quello di aggiustare i valori predittivi in accordo con il grado associato di fibrosi. Razionale del NashTest I componenti più significativi per il NashTest sono i fattori metabolici (principalmente il peso,i trigliceridi e il glucosio), come osservato in precedenza 23-27, ma anche l A2M e l apoa1. E stato provato che queste proteine sono associate alla fibrosi 28 ma anche alla steatosi 7, alla steatoepatite 6,29 e all insulino-resistenza 6. L A2M è un inibitore di proteasi ma ha anche delle funzioni multiple come veicolo, collante e proteina obiettivo 30. Altri studi hanno osservato un aumento di A2M nei pazienti diabetici 31. L insulina è doppiamente legata all A2M 32 nel plasma e l A2M è una proteina che si lega all Insulin-like Growth Factor Binding Protein-1 (IGFBP-1) che modifica l interazione IGFBP-1/IGF 33. Quindi l A2M può essere direttamente coinvolto sia nei meccanismi epatici dell insulino-resistenza sia nella fibrogenesi. Confronti con biomarcatori nella steatoepatite alcolica (ASH) 8 sono importanti perchè ASH e NASH condividono molti meccanismi fisio-patologici e caratteristiche istologiche. Le stesse associazioni sono state osservate per le proteine in un analisi univariata con un decremento dell ApoA1, dell aptoglobina e un aumento dell A2M nelle NASH. Comunque il decremento dell apolipoproteina A1 nelle NASH era molto più basso che nei pazienti con

10 10 ASH. Razionale dell AshTest AST, GGT e bilirubina, incrementano nella ASH e sono spesso associate alla ASH stessa 7, L osservazione che più colpisce è la drastica riduzione dell APOA1 con presenza di infiltrati di PMN L associazione di APOA1 con ASH è indipendente dalla fibrosi, questo quanto indirettamente suggerito 5,40. Durante la risposta in fase acuta, l HDL circolante è carico di siero amieloide A (SAA) e povero di APOA1 41,42. Quando l APOA1 viene liberato dall HDL, interagisce con le cellule infiammatorie come le PMN e diminuisce la degranulazione neutrofila e la produzione di superossido 43. L APOA1 facilita la risposta di adesione dei PMN ai lipopolisaccaridi 44. Altri possibili meccanismi e cascate includono la down regulation del PMN dall APOA1 45. In assenza di APOA1, SAAHDL non si forma e libera le SAA che aumentano 46 e che possono anche attivare le PMN 47. Una volta attivate, le PMN sono una fonte di mieloperossidasi e perossido d idrogeno, che possono distruggere l integrità dell APOA Dati amministrativi su FibroMax, Brevetto e Marketing Il Professore Thierry Poynard e il suo staff hanno lavorato per più di 15 anni sui marcatori biochimici nella fibrosi epatica [Assistenza Pubblica Ospedali di Parigi (AP-HP), Università di Parigi 6, CNRS UMR 8149 e Università di Parigi 5]. Un brevetto internazionale, (USPTO 6,631,330) è stato registrato da AP-HP, e protegge la scoperta di questi marcatori biochimici nella fibrosi (FibroTest), nell attività (ActiTest), nella steatosi (SteatoTest) e nella steatoepatite (NashTest e AshTest). Nel 2002, e in accordo con l Innovation and Research Act (1999) che appartiene alla ricerca pubblica, è stato affidato il compito di utilizzare questo brevetto a Biopredictive, un azienda start-up nel biotech. Questo accordo è stato fatto dopo un esame eseguito dal comitato scientifico di Paris-Biotech [che include dall Università di Parigi 5, alla Città di Parigi, all INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), all Ecole Centrale ed ESSEC (Ecole Supérieure des Sciences Economiques et Commerciales)]. La

11 11 licenza operativa è stata quindi trasferita dalla Pubblica Assistenza AP-HP all azienda a responsabilità limitata, Biopredictive. Nel 2002, il progetto ha vinto il premio ANVAR (Agence Nationale de Valorisation de la Recherche) del Fourth National Competition of Aid for the Creation of Innovative Technological Enterprises nella Categoria Creation and Development. Questa gara, organizzata dal Ministero Francese della Ricerca, ha proclamato i vincitori del premio dopo una delibera della giuria sull aspetto finanziario e commerciale del progetto. Nel Settembre 2002, il primo prodotto sanitario, FibroTest-ActiTest, è stato lanciato sul mercato francese e nell Aprile del 2006 sono stati lanciati i recentemente sviluppati SteatoTest, NashTest e AshTest. Quest azienda fornisce un servizio sia al laboratorio pubblico che privato. Utilizzando dieci test biologici registrati, un sistema algoritmico efficace prende in considerazione l età, il sesso e il BMI del paziente, e genera delle misure quantitative del grado di fibrosi (FibroTest), dell attività necro-infiammatoria (ActiTest), della steatosi (SteatoTest) e della steatoepatite alcolica (AshTest) e delle misure semi-quantitative della steatoepatite non alcolica (NashTest). Questo viene fatto tramite una connessione internet sicura ed anonima. Algoritmi di sicurezza forniscono i risultati prevenendo anche quelli dovuti a falsi positive/falsi negativi dovuti a uno dei dieci parametri particolarmente basso o particolarmente alto. Vi è stata un ottima diffusione all estero del FibroTest e ActiTest grazie a presentazioni fatte durante convegni scientifici. Questo tests sono attualmente distribuiti in Francia, Marocco (eseguiti da 30 laboratori), Messico, Portogallo, Svizzera, Belgio, Germania, Italia, Gran Bretagna, Brasile, Egitto, Turchia, Canada e USA, Argentina, Austria, Australia, Emirati Arabi, Spagna, Georgia, Libano, Romania, Ucraina. In Francia, più di 500 laboratori privati utilizzano attualmente questi test e 37 ospedali pubblici hanno firmato un contratto con Biopredictive per il loro utilizzo. FibroMax viene eseguito negli stessi laboratori del FibroTest- ActiTest. Negli USA, LabCorp e BioPredictive Inc hanno firmato un accordo in esclusiva per offrire FibroSURE, NASH-FibroSURE e ASH-FibroSURE. Letteratura pubblicata che include dati su FibroSURE si riferiscono ai dati su FibroTest e ActiTest, NASH-FibroSURE fa riferimento ai dati su FibroTest, SteatoTest e NashTest e ASH-FibroSURE fa riferimento a FibroTest, SteatoTest e AshTest. FibroSURE, NASH-FibroSURE e ASH-FibroSURE

12 12 sono nomi di trademark di LabCorp che uniscono il FibroTest con ActiTest, SteatoTest, NashTest e AshTest in funzione della patologia, come un unica opzione di test singolo. In Europa, FibroMax fa riferimento ai risultati ottenuti dai tutti e cinque i test raggruppati nello stesso foglio di calcolo. FI-BROCHURE è il documento ufficiale investigator di FibroTest-ActiTest, lanciato a Marzo 2004 con la versione più recente disponibile sul sito internet Le più recenti raccomandazioni dell Autorità Sanitaria Francese per l utilizzo di FibroTest L Autorità Sanitaria Francese (La Haute Autorité de Santé) ha raccomandato l uso del marcatore sierologico non-invasivo della fibrosi FibroTest per stimare in prima istanza il danno epatico e per ridurre la necessità di biopsie epatiche nella gestione dell epatite cronica C. Queste raccomandazioni ufficiali derivate da studi pluriennali sono state comunicate oralmente in occasione del French Liver Meeting (AFEF) nell Ottobre del 2006 e verranno a breve pubblicate Raccomandazioni pre-analitiche per FibroMax Digiuno vs. non - digiuno Per FibroTest-ActiTest la variazione intra-individuale dei marcatori biochimici è molto bassa, ed è stato dimostrato che la misurazione del FibroTest, ActiTest e i loro componenti non sono significativamente modificati dall introduzione alimentare. Comunque sia, gli altri test del FibroMax in particulare SteatoTest e NashTest includono componenti che devono essere misurati a digiuno (glucosio, trigliceridi e colesterolo) a causa dell alta variazione del livello ematico con il pasto. 53 Condizioni di trasporto, pre-trattamento, temperatura di conservazione del siero La misurazione dei sei paramentri del FibroTest-ActiTest sono preferibilmente eseguiti con sangue fresco (o plasma) o che sia stato conservato a una temperature tra +2 C e +8 C per un massimo di quattro giorni in un area non illuminata (per la protezione della bilirubina). La centrifugazione della fiala per la misurazione della glicemia a digiuno dovrebbe essere eseguita rapidamente dopo il prelievo in uno speciale contenitore vacutainer fluorato per

13 13 impedire l inquinamento del metabolismo del glucosio con gli enzimi delle cellule rosse. Per misurazioni ritardate il siero dovrebbe essere rapidamente congelato a -80 C. Dopo scongelamento, dovrebbe essere centrifugato per 10 minuti a 15,000g. Uno studio raccomanda per evitare il rischio di risultati falsi negativi e falsi positivi per i marcatori epatici non-invasivi, di fare studi di validazione necessari sul siero fresco e verificare in caso di analisi retrospettive necessarie, che la temperatura di stoccaggio del siero sia raccomandato a -80 C FibroMax pacchetto di biomarcatori: FibroTest, ActiTest, SteatoTest, NashTest e AshTest 6.1. FibroTest-ActiTest-FibroSURE panoramica Standardizzazione dell AUROC osservato in accordo alla prevalenza di gradi di fibrosi individuali Prevalenza dei gradi di fibrosi è uno dei fattori di maggiore variabilità quando si stabilisce l area sotto le curve (AUROC) nella valutazione diagnostica dei marcatori di fibrosi. 55 Poynard, T, Halfon P, Castera L, Munteanu M, Imbert Bismut F, Ratziu V, Bourliere M, de Ledinghen V, FibroPaca study group. Gastroenterol Clin Biol. 2006; 30: 1039 (Abstract) L area sotto alla curva ROC (AUROC) è ampiamente utilizzata per stimare il valore diagnostico dei marcatori epatici della fibrosi. AUROC unisce la sensibilità (Se) e la specificità (Sp) di un marcatore quantitativo. Se è di solito utilizzato in pazienti con una fibrosi avanzata (METAVIR gradi F2, F3, F4) e Sp in quelli con una fibrosi non avanzata (METAVIR gradi F0, F1). La variabilità dell AUROC dovuta al cambiamento nella prevalenza di ogni grado di fibrosi in un gruppo di fibrosi avanzata o non-avanzata è sconosciuta. L obiettivo è di accertare la relazione tra la prevalenza di ogni grado di fibrosi e l AUROC e costruire un indice per standardizzare i confronti delle AUROC tra i vari studi. Un database integrato di pazienti con HCV con contemporaneamente FibroTest e biopsia è stato messo in piedi. Il FibroTest AUROC per la diagnosi della fibrosi avanzata è stato calcolato in 19 popolazioni con diversi gradi di prevalenza. Un indice (DANA) è stato costruito = differenza tra la media del grado di fibrosi avanzata e la media del grado di fibrosi non avanzata, range: da 0 a 4 unità per la fibrosi METAVIR. Un database generale di 19 studi pubblicati su Fibrotest è stato costruito per validare l associazione tra DANA e AUROC.

14 14 In accordo alla prevalenza del grado, FibroTest AUROC varia (P<0.001) da 0.67 a 0.98 e da 0.65 a 0.89, DANA da 1.00 a 4.00 e 1.47 a 3.05, nel database integrato e nel database generale, rispettivamente. C è una correlazione vicina tra FibroTest AUROC e DANA: R=0.89, sia nel database integrato (R=0.95 P<0.0001) che in quello generale (R=0.69 P=0.001) (Figura 1). Nessun altro fattore inclusa la misura della biopsia, i frammenti, l autore o il consumo di alcol hanno un associazione significativa con FibroTest AUROC. La formula per standardizzare FibroTest AUROCs stimata per una prevalenza di grado diversa è AUROC= x (DANA) con FibroTest AUROC=0.85 per uno standard DANA di 2.5 (ogni grado di prevalenza =0.20). La prevalenza di ogni grado di fibrosi deve essere presa in considerazione quando i marcatori di fibrosi epatica sono valutati usando l AUROC per la diagnosi di una fibrosi avanzata. La formula per standardizzare gli AUROCs stimata per una prevalenza di grado diversa è AUROC= x (DANA) con FibroTest AUROC=0.85 per uno standard DANA di 2.5 (ogni grado di prevalenza =0.20). Figura 1. L Associazione tra DANA e AUROC in 19 studi incluso il database integrato. I punti gialli rappresentano le 20 combinazioni possibili tra due diversi stadi di fibrosi e i punti rossi il DANA la rappresentazione di ogni studio pubblicato. Per uno studio che include una popolazione con gradi molto diversi di fibrosi (solo F0 e F4) il DANA=4 e l AUROC osservato è stato artificialmente aumentato (0.98); al contrario in uno studio che includeva una popolazione con gradi di fibrosi vicini (solo F1 e F2) l AUROC osservato è inferiore (0.67). Con un DANA standardizzato = 2.5 si rappresenta una popolazione con una stessa prevalenza di fibrosi (20% di ogni grado F0, F1, F2, F3, e F4) l AUROC standardizzato ottenuto è solo di 0.85.

15 FibroTest-FibroSURE Metanalisi: validazione totale nelle quattro malattie epatiche più frequenti Informazioni complete su Fibrotest-Actitest interne e validazioni esterne, standardizzazione e confronto con altri marcatori sono pubblicate su Fibrotest FIBROCHURE, la cui ultima versione è disponibile sul sito internet Meta-analasi di FibroTest (FT) per la diagnosi della fibrosi nelle quattro più frequenti malattie epatiche. Poynard T, Halfon P, Castera L, Ratziu V, Imbert-Bismut F, Naveau S, Thabut D, Lebrec D, Zoulim F, Munteanu M, Bourlière M, de Ledinghen V. 2 Gastroenterol Clin Biol. 2006; 30: 1057 (Abstract) Valore diagnostico di FibroTest -ActiTest tra i lavori pubblicati (metanalisi 2 e database integrato) Per 24 gruppi di pazienti dettagliati in 19 pubblicazioni, 3-6,28,56-69 è stato possible affermare la prevalenza di una fibrosi significativa (F2 F3 F4), e i valori dell AUROC cosi come l Se e l Sp per diversi cut-offs del FibroTest (Tavola 1) (eccetto 4 studi in cui AUROC, Se o Sp non erano riportati). Un nuovo database integrato è stato costruito con gli studi in cui erano disponibili dati individuali per un totale di pazienti (2431 HCV, 322 HBV, 267 NAFLD e 262 ALD) per un 74% della letteratura. Confronto del valore diagnostico di FibroTest tra le varie patologie epatiche Una metanalisi è stata eseguita due volte, una in accordo al valore assoluto dell AUROC osservato (ObAUROC) e una in accordo all AUROC adattato allo spettro dei gradi della fibrosi (AdAUROC). 55 (Figura 2, Panel A e B). Due pubblicazioni sono state escluse poiché una di esse aveva pazienti già inclusi in un altro studio [Thabut et al.] e l altro non aveva l AUROC [Colletta et al.] ; la media osservata dell AUROC per la diagnosi di una fibrosi avanzata (F2 F3 F4) era di 0.79 (95% CI, ) e la media adattata dell AUROC di 0.84 (95% CI, ); tutti gli AUROC osservati andavano da 0.71 (per 0.39 prevalenza de F2 F3 F4) a 0.87 (per 0.45 prevalenza di F2 F3 F4). L eterogeneità dell AUROC osservato tra i vari studi sparisce dopo l aggiustamento dell AUROC (Cochran Q=26 p=0.19). Figura 2. Metanalisi del FibroTest ObAUROCs (Panel A) e AdAUROCs (Panel B) in studi pubblicati. Ob e AdAUROCs erano più elevate del FibroTest per il valore random 0.50 (P<0.001). Non c è differenza significativa tra le varie patologie epatiche tra Ob e AdAUROCs. La linea rossa è il miglior AUROC che si possa ottenere (0.90) con 20mm di biopsia vs il fegato intero [Bedossa 2003].

16 16 Tavola 1. Riassunto di ObAUROC (se) del FibroTest per il grado di fibrosi epatica nei pazienti con malattie epatiche croniche (epatite C, B, ALD e NAFLD) dagli studi pubblicati. First author No Methodology Stage Observed DANA 1 Cut-off Sensitivity Specificity Pts Prevalence AUROC (SE) HCV Imbert-1, 2001 Imbert-2, 2001 Poynard-1, 2001 Poynard-2, 2003 Poynard-3, Prospective Single center Training cohort 134 Prospective Single center Validation cohort F2F3F F2F3F Retrospective Randomized trial F3F4 Knodell Multicenter Retrospective Randomized trial F2F3F Multicenter Before treatment Retrospective Randomized trial F2F3F Multicenter After treatment

17 17 Rossi, 2003 Myers-1, Prospective Multicenter F2F3F Non-validated analyzers Retrospective Single center HCV- HIV F2F3F Co-infection Castéra, 183 Prospective Single F2F3F NA NA 2005 center Calès-2, 120 Prospective Single F2F3F NA NA 2005 center Colletta, 40 Prospective, F2F3F4 NA 1.47 NA NA NA 2005 Multicenter, PNALT 0.35 Varaut-1, 50 Retrospective, F2F3F NA NA NA 2005 Single center Dialysis patients Varaut-2, 60 Retrospective, F2F3F Single center Kidney recipients Halfon, 504 Prospective, F2F3F Multicenter Sebastiani- 1, Prospective, PNALT, Training set F2F3F Sebastiani- 2, Prospective, Elevated ALT Training Set F2F3F Wilson, 115 Retrospective F2F3F NA NA NA 2006 Multicenter 30%HIV Sene, Prospective Single center Cryoglobulinemia vasculitis F2F3F

18 18 HBV Myers-2, 209 Prospective (42) F2F3F and Retrospective (167) Poynard-4, 214 Prospective F2F3F NA NA NA ALD Naveau, 221 Prospective F2F3F NAFLD Ratziu-1, Prospective F2F3F Ratziu-2, 97 Prospective F2F3F Mixed Callewaert, 106 Prospective F NA NA NA 2004 HCVand alcohol Calès-1, Retrospective F2F3F NA NA NA Single center Mixed causes Training cohort *Dettagli per gradi dati su 119 e non 115: ** metà di Knodell F3 è stato contato come METAVIR F2 Nelle quattro patologie epatiche più comuni c è stata una differenza molto significativa tra il valore diagnostico (AUROC) del FibroTest verso la diagnosi random (0.50) in ogni studio usando sia la metanalisi che i dati riuniti nel database integrato; L unica differenza significativa dell AUROC tra le varie eziologie era una più alta ObAUROC prima dell aggiustamento nell ALD che nell HCV (p=0.001); questa differenza non era più significativa dopo l aggiustamento dell AUROCs alla prevalenza di ogni grado di fibrosi (Tavola 2).

19 19 Tavola 2. Caratteristiche del nuovo database integrato e del valore diagnostico del FibroTest nelle quattro più comuni malattie epatiche Disease No Age Biopsy F0 F1 F2 F3 F4 ObAUROC AdAUROC yrs Length (%) (%) (%) (%) (%) 95% CI DANA 95% CI mm HCV 2, (8.4) (46.2) (21.8) (12.3) (11.3) HBV (26.7) (29.2) (18.9) (11.8) (11.4) ALD (6.9) (25.6) (19.1) (8.8) (39.7) * NAFL D (38.2) (35.2) (13.1) (8.6) (4.9) All 3, *P=0.001 tra HCV e ALD per ObAUROC, Non Significativa per AdAUROC (12.5) (42.0) (20.6) (11.6) (13.3) Analisi di sensibilità Studi prospettici, studi degli inventori e studi sulle biopsie frammentate sono stati associati con un più elevato ObAUROC osservato, ma non un più alto AdAUROC aggiustato (Tavola 3, Panel A). Nessuna differenza tra FibroTest Ob AUROCs o AdAUROCs in accordo con una baseline ALT elevata o non elevata (Tavola 3 Panel A e B). Tavolo 3. Analisi di sensibilità del valore diagnostico di FibroTest in accordo con gli studi pubblicati (Panel A) o le caratteristiche del paziente (Panel B). Panel A. Caratteristiche Observed AUROC Adjusted AUROCs (numero di studi) All (23) Design Prospective (15) * Retrospective (7) Authors Independent (12) Mixed (5) Inventor (6) ** Guidelines/Fresh No (8)

20 20 Yes (15) Length biopsy <18 (8) >=18 (10) Interval serumbiopsy >30 days (7) <30 (14) Co-morbidity No (18) Yes (5) Normal baseline ALT Yes (1) No (22) Panel B. P=0.01 **P=0.04 Caratteristiche Observed AUROC DANA Adjusted AUROC (numero di pazienti) Lunghezza biopsia <25mm (2,446) >=25mm (492) Più di 2 frammenti Si (575) * No (606) Normal baseline ALT No (1,833) Si (493) *P=0.002 non significativo per adjusted AUROCs Valore diagnostico del FibroTest per gradi intermediari e vicini nei carrier dell HCV nel primo database integrato 1 Gli AUROCs tra le varie combinazioni dei gradi sono menzionati nella Tabella 4. Tra due gradi vicini (differenza di un grado), gli AUROCs non sono significativamente lontani e vanno da 0.63 a In pazienti con 2 gradi di differenza, gli AUROCs non sono significativamente lontani e vanno da 0.75 a Pazienti con 3 gradi di differenza, gli AUROCs non sono significativamente lontani e

21 21 vanno da 0.87 a Pazienti con 4 o 5 gradi di differenza (donatori di sangue verso F3 o F4, e F0 verso F4), gli AUROCs non sono significativamente lontani e vanno da 0.95 a Tabella 4. Riassunto del valore diagnostico di FibroTest per la diagnosi di tutte le combinazioni dei gradi nella fibrosi epatica (AUROC) nei carriers HCV (primo database integrato pubblicato). Tra due gradi vicini (un grado di differenza), gli AUROCs sono evidenziati in grassetto. Pazienti con 2 gradi di differenza, gli AUROCs sono evidenziati in italico. Pazienti con 3 gradi di differenza, gli AUROCs sono in grassetto e italico. Pazienti con 4 o 5 gradi di differenza (donatori di sangue versus F3 o F4, e F0 versus F4), gli AUROCs sono sottolineati. Differenze significative sono state osservate tra gli AUROCs dove c era una differenza di due o più gradi. Blood Donor BD n=300 F0 n=95 - F1 n= F2 n= F0 F1 F2 F3 F4 BD F0 F0F1 F1F2 F2F3F4 F3F F3 n= F4 n= BD F F0F F1F F2F F3F F2F3F BD F0F Confronto tra il valore diagnostico del FibroTest tra gradi vicini nelle quattro malattie epatiche croniche L AUROC complessivo per la diagnosi dei gradi intermediari F2 vs. F1 (0.66, n=2,055) non è diversa dai gradi estremi: F3 vs. F4 (0.69, n=817) o F1 vs. F0 (0.62, n=1788). Nessuna differenza nell AUROC è stata osservata tra gradi vicini nelle quattro malattie epatiche croniche. (Tabella 5)

22 22 Tabella 5. I valori diagnostici di FibroTest tra gradi vicini nelle quattro malattie epatiche croniche. AUROCs (95%CI) Numero di pazienti Eziologia F1 vs F0 F2 vs F1 F3 vs F2 F4 vs F3 ALL N=1, N=1, N=817 N=2,055 HCV N= 1, N= N=573 N=1,654 HBV N= N= N= N=81* ALD N= N= N= N=127* NAFLD N= N= N= N=36 * P=0.001 tra HBV e ALD Valore diagnostico dell ActiTest nell epatite cronica virale Il valore diagnostico dell ActiTest per gradi intermediari e vicini nei carriers dell HCV primo databse integrato L AUROC tra le varie combinazioni dei gradi nel primo database integrato (solo carrier dell HCV) sono dati nella Tabella 6. Tra due gradi vicini (un grado di differenza) gli AUROCs non sono significativamente diversi e variano da 0.60 a Pazienti con due gradi di differenza gli AUROCs non sono significativamente diversi e variano da 0.75 a In pazienti con 3 gradi di differenza, gli AUROCs non sono significativamente diversi e variano da 0.87 a In pazienti con 4 gradi di differenza (donatori di sangue versus F3 e F0 versus F4) gli AUROCs non sono significativamente diversi e variano da 0.95 a Tabella 6. Riassunto del valore diagnostico dell ActiTest per la diagnosi differenziale di ogni grado dell attività istologica (AUROC) nei carriers HCV (primo database integrato pubblicato).tra due gradi vicini (un grado di differenza) gli AUROCs sono evidenziati in grassetto. Tra pazienti con due gradi di differenza, gliaurocs sono evidenziati in italico. Tra pazienti con 3 gradi di differenza, gli AUROCs sono in grassetto e italico. In pazienti con 3 o 4 gradi di differenza (donatori di sangue versus A2 o A3, e A0 versus A3) gli AUROCs sono sottolineati. Differenze significative sono state osservate negli AUROCs quando presente una differenza di due o più gradi. A0 A1 A2 A3 BD A0 A0A1 A1A2 A2A3 Blood Donor BD n= A0 n=185 - A1 n= A2 n= A3 n= A0A A1A

23 23 A2A A0A1A BD A0A Valore diagnostico dell ActiTest Per quattro gruppi di pazienti dettagliati in due pubblicazioni 28,60 è stato possibile dimostrare la prevalenza di un attività significativa, e i valori dell ActiTest AUROC cosi come la sensibilità e la specificità per 4 diversi cut-off nell ActiTest (Tabella 7). Per la diagnosi dell attività istologica significativa tramite il sistema di misurazione METAVIR, gli AUROCs andavano da 0.75 a Si è notata una differenza molto significativa verso una diagnosi casuale,in ogni studio, utilizzando sia una metanalisi (Differenza Media in AUROC=0.29, Modello effetto casuale Chi square=556 P<0.001) sia i dati riuniti tramite il database integrato. Per il cut-off di 0.36, il valore predittivo negativo dell ActiTest per escludere l attività significativa (prevalenza 0.41) è di 85%. Tabella 7. Riassunto del valore diagnostico dell ActiTest per la diagnosi dell attività epatica necroinfiammatoria (AUROC) Primo Autore Numeri Metodologia Marcatore Grado di prevalenza AUROC SE Cut off Sensibilità Specificità Imbert 189 Prospective ActiTest A2A Bismut, Single center Imbert 134 Prospective ActiTest A2A Bismut, Single center Validation cohort Poynard, Retrospective ActiTest A2A Poynard, 2003 Randomized trial Multicenter Before treatment Retrospective ActiTest A2A Randomized trial Multicenter After treatment

24 SteatoTest marcatore sierologico universale della steatosi (fegato grasso) Introduzione La steatosi o fegato grasso è definito come l accumulo eccessivo di trigliceridi negli epatociti. 70 La prevalenza della steatosi è molto elevata ed è associata a vari fattori come alcol, diabete, sovrappeso, iperlipidemia, insulino-resistanza, epatite C genotipo 3, abetalipoproteinemia e somministrazione di alcuni farmaci. 20,70-72 La malattia del fegato grasso non coinvolge solo una semplice steatosi, ma anche altre lesioni istologiche e spesso fibrosi con possibile progressione verso la cirrosi, l epatocarcinoma e la morte. In pazienti con malattia epatica alcolica-alcoholic liver disease (ALD), epatite cronica C, e possibilmente nei pazienti con epatite B, la presenza di steatosi è anche associata alla progressione verso la fibrosi. 70,72-74 Quindi la diagnosi di steatosi epatica è obbligatoria per gestire meglio i pazienti a rischio Scoperta, validazione interna edesterna, confronto con l ecografia, GGT e ALT Il valore diagnostico dei biomarcatori per la valutazione di steatosi epatica. 7 Poynard T, Ratziu V, Naveau S, Thabut D, Charlotte F, Messous D, Capron D, Abella A, Massard J, Ngo Y, Munteanu M, Mercadier A, Manns M, Albrecht J. Comp Hepatol ; 4: 10. Per la diagnosi della steatosi non esistono raccomandazioni standard. La raccomandazione usuale è quella di misurare le GGT e ALT e, inoltre, effettuare una biopsia epatica per definire il grado e lo stage.e impossibile effettuare una biopsia epatica in un cosi grande numero di pazienti. 20,70,72,75 L obiettivo dello studio corrrente era di creare un nuovo sistema di biomarcatori conosciuti come SteatoTest con valori sufficientemente predittivi per la diagnosi della steatosi dovuta all alcol, alla NAFLD e all epatite cronica C e B. L obiettivo secondario era di confrontare il valore diagnostico dello SteatoTest con l ecografia e i sieri GGT ed ALT considerati come marcatori biochimici standard. Indipendentemente, il valore diagnostico dello SteatoTest è stato validato da un gruppo indipendente. Sono stati analizzati soggetti, di cui 884 coinvolti nello studio di validazione del biomarcatore con la seguente distribuzione: 310 pazienti nel gruppo di training (varie eziologie: NAFLD, ALD, HCV, HBV); 171 nel gruppo di validazione 1 (HCV identificata subito); 201 nel gruppo di validazione 2 (HCV non identificata dopo 24 ore di follow-up); 62 nel gruppo di validazione 3 (ALD); e 140 nel gruppo di controllo (donatori di sangue, volontari glicemia a digiuno e non a digiuno). Il vantaggio del gruppo di validazione 2 è l inclusione di un gruppo di pazienti che avevano una

25 25 biopsia epatica biologicamente simile a una popolazione normale poichè questi pazienti sono SVR (sustained virologic responders) e avevano test epatici funzionali quasi normali. Caratteristiche dei pazienti I pazienti non-inclusi non erano significativamente diversi dai 884 pazienti integrati nel gruppo di validazione. I pazienti inseriti nei quattro gruppi erano simili nell età con una predominanza di soggetti maschi.la prevalenza di steatosi oltre il 5% (gradi da 2 a 4) variavano da un 11% nei pazienti curati dal virus dell epatite C (HCV) al 94% nei pazienti con ALD. Risultati del gruppo Training: construzione del test Nel gruppo di training (n=310) i componenti più significativamente associati alla presenza dei gradi di steatosi 2 4 in un analisi univariata erano il body mass index (BMI), l età, ALT, AST, GGT, glucosio, e trigliceridi. La regressione logistica definita dallo SteatoTest include 12 componenti ALT, α2-macroglobulin (A2M), apolipoproteina A-I (ApoA1), aptoglobina (HAPTO), bilirubina totale (TB), GGT, colesterolo (CT), trigliceridi (TG), glucosio, età, sesso e BMI e i componenti più significativi sono il BMI (P = ), le GGT (P = 0.002), ApoA1 (P = 0.01), A2M (P = 0.02), ALT (P = 0.03) e i TG (P = 0.04). Nei gruppi di valiidazione, sono state osservate simili differenze, in particolare per BMI, GGT, ALT e trigliceridi. Conversione tra i risultati dello SteatoTest e i gradi istologici corrispondenti nella steatosi SteatoTest è una validazione lineare continua del grado di steatosi. SteatoTest fornisce una stima quantitativa numerica della steatosi epatica da un grado di 0.00 a 1.00, corrispondente al grado di scoring della steatosi da S0 a S4. Tra i 140 controlli, il valore medio dello SteatoTest (± SE) era di 0.08 ± (95 percentile, 0.23). Tra i 744 pazienti con la biopsia epatica, la conversione dello SteatoTest era lineare. (Tabella 8 e Tabella 9). Tabella 8. Valori medi dello SteatoTest in accordo con il grado di steatosi nella biopsia epatica nei pazienti e in accordo con la categoria di controllo (digiuno, non-digiuno, donatori di sangue) Subjects Soggetti Group/Category Gruppo/Categoria Median SteatoTest Fasting 0.13 Controls Non-fasting 0.18 Patients (biopsy) Blood donors 0.14 No steatosis 0.26 Grade 1 steatosis 0.43 Grade 2 steatosis 0.62 Grade 3 steatosis 0.70 Grade 4 steatosis 0.75

26 26 Tabella 9. Conversione tra i risultati SteatoTest e la steatosi corrispondente SteatoTest Predicted histological grade Quantitative estimation S0 No steatosis S0-S1 Mild steatosis (1-5%) S S1-S2 Moderate steatosis (6-32%) S S2-S3 Marked steatosis (33-66%) S3-S4 Severe steatosis (>66%) Valore diagnostico dello SteatoTest in confronto alle GGT e ALT nel gruppo di training SteatoTest aveva alti AUROCs (SE) sia nel gruppo di training che nei gruppi di validazione 1, 2 e 3: 0.79 (0.03); 0.80 (0.04); 0.86 (0.03); e 0.72 (0.05), rispettivamente. Gli AUROCs dello SteatoTest erano sempre significativamente più alti di quelli delle GGT e ALT (per il gruppo di trainining e il gruppo di validazione 1). Per la diagnosi dei gradi di steatosi 2 4, la sensibilità dello SteatoTest al cut-off di 0.30 era di 0.91, 0.98, 1.00 e 0.85 e la specificità al cut-off di 0.70 era di 0.89, 0.83, 0.92, e 1.00, per il gruppo di training e per i gruppi di validazione, rispettivamente. Risultati del database integrato (tutti i gruppi messi insieme),confronto con ALT e GGT Il database integrato (n=884) combinato al gruppo di training, i tre gruppi di validazione e il gruppo di controllo. Si evidenzia un alta e significativa correlazione generale tra lo SteatoTest e i gradi di steatosi dai controlli a S3. Per SteatoTest, c era una significativa differenza per tutte le differenze pairwise tra le medie (P < 0.05). Al contrario, sia per GGT che per ALT, non c erano differenze significative tra S0 e S1. Inoltre per ALT, non c erano differenze significative tra S0 e S2, S1 e S2, e neanche per S2 e S3. Per SteatoTest, con un cut-off di 0.30 la sensibilità è del 90% e con un cut-off di 0.70 la specificità è dell 88% che permette di ottenere valori utili predittivi per i gradi di steatosi 2 4, 93% valore negativo predittivo (NPV) e 63% valore positivo predittivo (PPV) per una prevalenza di steatosi del 30%. Il 90% di specificità è stato ottenuto con un cut-off di 0.72 con un corrispondente 63% PPV. La percentuale complessiva di pazienti classificati con almeno il 90% di sensibilità o il 90% di specificità era del 59% ( /884).

27 27 SteatoTest verso Ecografia per la diagnosi della steatosi L ecografia è stata effettuata insieme allo SteatoTest e alla biopsia in 304 pazienti. La corrispondenza tra una steatosi diagnosticata con ecografia e biopsia era più bassa (coefficiente kappa = 0.32 ± 0.05) della corrispondenza con Steatotest (ad un cut-off di 0.50 = 0.44 ± 0.06; P = 0.02), cosi come ad un AUROC più basso 0.65 ± 0.03 per l ecografia verso 0.78 ± 0.03 per ST (P = 0.001). SteatoTest verso i classici marcatori sierologici GGT e ALT per la diagnosi della steatosi Tra i 744 patients con biopsia, per la diagnosi della steatosi S3-S4, lo SteatoTest AUROC era di 0.79 (0.02), significativamente piò alto della GGT 0.74 (0.02) (P = 0.03), e dell ALT 0.71 (0.02) (P = 0.007). Il 90% di sensibilità è stato ottenuto con un cut-off di 0.32; il 90% di specificità con un cut-off di (Tabella 10) SteatoTest poteva distinguere meglio delle GGT e ALT tra i vari gradi di fibrosi. (Figura 3, Panel A, B e C, rispettivamente) Tabella 10. AUROCs dello SteatoTest, GGT e ALT per la diagnosi della steatosi più alto del 5%. Panel Diagnostico Gruppo di Training N=310 Gruppo validazione 1 (HCV before treatment) N=171 Gruppo validazione 2 (HCV sustained responders) N=201 Gruppo validazione 3 (Alcoholic liver disease) N=171 Tutti i gruppi SteatoTest 0.79 (0.03)* 0.80 (0.04) 0.86 (0.03)$ 0.72 (0.05)** 0.80 (0.02) GGT 0.66 (0.03) 0.67 (0.05) 0.74 (0.05) 0.50 (0.09) 0.66 (0.02) ALT 0.58 (0.03) 0.62 (0.05) 0.79 (0.04) 0.66 (0.07) 0.61 (0.02) * Più alto di GGT (P < ) e ALT (P < ); Più alto di GGT (P = 0.007) e ALT (P < ); $ Più alto di GGT (P = 0.02); ** Più alto di GGT (P = 0.002); Più alto di GGT (P < ) e ALT (P < ). Analisi di Sensibilità:valore diagnostico migliore con una buona qualità bioptica Un totale di 670 (78%) pazienti avevano un campione bioptico la cui lunghezza era inferiore ai 20 mm. L AUROC dello SteatoTest era leggermente più piccolo in quei pazienti (0.76, 95% CI ) rispetto ai 161 (15%) pazienti con un campione bioptico più grande (0.82, 95% CI ; P = 0.10). Non è stata trovata differenza significativa tra l AUROCs dello SteatoTest in funzione dell etnicità. Questi risultati evidenziano l utilità di un nuovo panel di marcatori biochimici (SteatoTest) per la previsione della steatosi di varie origini (epatite virale cronica C e B, e malattia fegato grasso alcolica e non alcolica). La previsione di steatosi con SteatoTest è risultata migliore di quella fornita dai marcatori soliti quali GGT, ALT ed ecografia, come dimostrato dall aumento significativo degli AUROCs.

28 28 Figura 3. Relazione tra SteatoTest (Panel A), GGT (Panel B) e ALT (Panel C) e i gradi di steatosi epatica nel gruppo di training. Un sistema di scoring a quattri gradi è stato utilizzato per validare la steatosi istologica: S0 no steatosi; S1-da 1 a 5%, media; S2-da 6 a 32% moderata; S3-S4 da 33 a 100%, marcata o severa.

29 SteatoTest validazione esterna nel Gruppo di Studio CYTOL Study Group nei pazienti NAFLD SteatoTest è stato validato in un quarto gruppo indipendente di pazienti con NAFLD dallo studio multicentrico prospettico CYTOL. In questo gruppo di pazienti indipendente, il valore diagnostico tramite AUROC (SE) per la steatosi a più del 5% era di 0.78 (SE=0.04). (Figura 4) Figura 4. Valore diagnostico dello SteatoTest per 126 pazienti con NAFLD nel gruppo di studio prospettico CYTOL Miglioramento della Steatosi tramite SteatoTest dopo trattamento HCV 7 La presenza di steatosi in una biopsia epatica è spesso associata all infezione cronica associata all HCV ed è stato osservato che la steatosi diminuisce nei SVR (sustained viral responders). Lo studio di validazione dello SteatoTest includeva 171 pazienti con HCV prima del trattamento. Tra loro, 75 pazienti con HCV sono stati rivisti 2 volte (una prima volta e poi due anni dopo il trattamento) permettendo di validare lo SteatoTest nei pazienti HCV prima e nei SVR da HCV dopo 2 anni di follow-up. (Figura 5). I risultati di questa analisi non sono stati pubblicati nello studio di validazione. Lo SteatoTest medio è migliorato significativamente in confronto al baseline da 0.60 a 0.41 (p=0.001) dopo 2 anni di follow-up nei pazienti SVR.

30 30 Figura 5 SteatoTest:miglioramento in 75 pazienti trattati in Biopsie paired (p=0.001) 6.3. NashTest marcatore sierologico nella steatoepatite non-alcolica (NASH) Introduzione La Steatoepatite non alcolica o Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) è un evoluzione istologica della malattia non-alcolica del fegato grasso o non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) che si manifesta con un accumulo eccessivo di grasso epatico in assenza di consumo di alcol. La NAFLD è una causa in crescita di morbidità e mortalità collegata al fegato Anche se la maggior parte dei pazienti non sviluppa complicazioni, il 28% potrebbe sviluppare una sequela epatica grave, incluso l epaticarcinoma. Quelli a più alto rischio sono i pazienti con una necro-infiammazione epatica significativa e fibrosi La biopsia epatica, quindi, è stata raccomandata per confermare questa diagnosi e fornire un informazione prognostica. 82 La diagnosi della fibrosi avanzata o NASH potrebbe essere molto importante per motivare i pazienti nel seguire una dieta o modificare il proprio stile di vita, per un trattamento intensivo delle complicazioni della sindrome metabolica o per ridurre il peso in vista di una chirurgia anti-obesità. FibroTest 6 e SteatoTest 7 hanno dimostrato valori diagnostici molto elevati per la fibrosi avanzata e la steatosi, rispettivamente, nei pazienti con NAFLD. Quindi, una scoperta precoce della NASH con fibrosi avanzata è il primo step per ridurre una futura morte dovuta a cirrosi.

31 Scoperta e validazione esterna (Gruppo di Studio CYTOL in pazienti con NAFLD) Valore diagnostico dei marcatori biochimici (NashTest) per la predizione dell epatite non alcolica nei pazienti con non-alcoholic fatty liver disease. 9 Poynard T, Ratziu V, Charlotte F, Messous D, Munteanu M, Imbert-Bismut F, Massard J, Bonyhay L, Tahiri M, Thabut D, Cadranel JF, Le Bail B, de Ledinghen V, LIDO Study Group, CYTOL Study Group. BMC Gastroenterol. 2006; 6: 34. Si stima che dal 15 al 20% della popolazione Europea abbia una steatosi, 19 quando più della metà della popolazione americana è in soprappeso o obesa. Poiché la biopsia epatica è impossibile che venga fatta in cosi larghi gruppi, gli autori hanno cercato di identificare dei marcatori semplici non-invasivi per pazienti con problemi epatici nella NAFLD. L obiettivo di questo studio era di sviluppare e validare l utilità diagnostica di un nuovo sistema di biomarcatori della NASH, il NashTest in pazienti con non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Popolazione dello studio La popolazione dello studio includeva un gruppo di training, un gruppo di validazione indipendente e un gruppo di controllo di 383 che prospetticamente includevano donatori di sangue e volontari sani. I criteri di inclusione erano: sospetta NAFLD con steatosi alla biopsia epatica. I criteri di esclusione: nessuna steatosi istologica, consumo giornaliero di alcol >50 g/d per gli uomini e >30 g/d per le donne nell anno precedente, concomitante alla malattia epatica, anticorpi HIV, immunosoppressione, e un intervallo >3 mesi tra il prelievo sanguigno e la biopsia epatica. Gruppo di Training : 238 pazienti sono stati ospedalizzati per sospetta NAFLD; 160 pazienti erano inclusi e 78 pazienti esclusi. Gruppo di validazione: tra Febbraio 2002 e Agosto 2004, 166 pazienti con ALT o GGT croniche anormali e una steatosi alla biopsia erano considerati come inclusi, tutti provenienti da uno studio multicentrico prospettico (studio CYTOL) con gli stessi criteri di inclusione/esclusione del gruppo di training. 97 pazienti sono stati inclusi e 69 esclusi. Questi pazienti erano più rappresentativi di centri meno specializzati. Scoring dei marcatori sierologici istologici Tutti i componenti biochimici sono stati confermati prospetticamente su siero fresco. La Fibrosi è stata graduata come segue : stage 0 = no fibrosi; stage 1 = fibrosi perisinusoidale o periportale; stage 2 = fibrosi perisinusoidale e portale/periportale; stage 3 = fibrosi bridging ; stage 4 = cirrosi. La Steatosi è stata classificata da S0 a S3: S0=no steatosi o <5%, S1=5%-33%, S2= 33%- 66%, S3 >66%.

32 32 Due definizioni sono state utilizzate per la diagnosi istologica della NASH. 1) Un sistema di scoring istologico per la NASH è stato recentemente pubblicato da Kleiner et al ed è stato usato per la costruzione del NashTest: la steatoepatite è stata definita con un NASH score (NAS) da 5 a 8, definita come la somma degli score pr la steatosi (0-3), l infiammazione lobulare (0-3), e il ballooning (0-2); NAS di 0-2 è stato considerato non diagnostico della NASH; scores di 5-8 NASH.; scorse di 3-4 NASH borderline (probabile). 2) Un secondo sistema diagnostico della NASH è stata fatta dal patologo indipendentemente dallo score NAS. Construzione del NashTest Il nuovo panel, NashTest, è stato construito nel gruppo di training combinando l età, il sesso, i 6 componenti del FibroTest-ActiTest-HCV-FibroSURE (Biopredictive, Parigi, Francia, algoritmo di intelligenza artificiale brevettato USPTO 6,631,330) più peso, altezza, AST, glucosio, trigliceridi, colesterolo e SteatoTest. Quando confrontato a pazienti con nessuna o una NASH borderline, quelli con una NASH erano più anziani, avevano una più alta A2M, più alte ALT e AST, più alto glucosio, più alti trigliceridi, un più alto score di FibroTest e SteatoTest. In un analisi multivariata i parametri più discriminanti erano il sesso femminile e il glucosio. Caratteristiche dei pazienti I pazienti inclusi nel gruppo di training erano più anziani, più diabetici e con ipertensione arteriale, un peso maggiore e meno NASH di quelli del gruppo di validazione e la misura della biopsia era più lunga con più numerosi e più lunghi tratti portali. Valore diagnostico del NashTest In accordo a Kleiner et al. nella diagnosi di NAS non c era una differenza significativa negli AUROCs nel gruppo di training e in quello di validazione, rispettivamente, per No NASH [AUROC = 0.77 (95%CI ) versus 0.83 (95%CI ; P=0.34)]; per NASH Borderline [AUROC = 0.69 (95%CI ) versus 0.69 (95%CI ; P=0.98)]; o per NASH [AUROC = 0.79 (95%CI ) versus 0.79 (95%CI ; P=0.87)]. (Figura 6) Tabella 11. Sensibilità, specificità e valori predittivi del NashTest per la diagnosi di NASH. NashTest Histological Diagnosis diagnosis Training Group n=160 Validation Group n=97 All patients n=257 Se Sp PPV NPV Se Sp PPV NPV Se Sp PPV NPV NASH 11/28 122/132 11/21 122/139 10/35 61/62 10/11 61/86 21/63 183/194 21/32 183/225 39% 92% 52% 88% 29% 98% 91% 71% 33% 94% 66% 81% Prevalence=0.18 Prevalence=0.36 Prevalence=0.25 Borderline 96/103 20/57 96/133 20/27 44/56 29/41 44/56 29/41 140/159 49/58 140/189 49/68 or NASH 93% 35% 72% 74% 79% 71% 79% 71% 88% 50% 74% 72% Prevalence=0.64 Prevalence=0.58 Prevalence=0.62

33 33 Valore diagnostico del NashTest per la diagnosi della NASH determinata dal patologo indipendentemente dalla NAS L AUROC per la diagnosi della NASH determinata dal patologo indipendentemente dal NAS nella popolazione generale era di 0.78 (95% CI ) senza differenze significative tra il gruppo di training e il gruppo di validazione. Concordanza tra NashTes te diagnosi istologica Concordanze tra NashTest e risultati bioptici per definire le NASH borderline e le NASH nel gruppo di training (n=160), nel gruppo di validazione (n=97) e in tutti i gruppi messi insieme (n=257) erano kappa (se) 0.28±0.05, 0.36±0.06 e 0.33±0.04, rispettivamente. Tra 64/383 (17%) controlli senza biopsia e con più del 30% di steatosi, nessuno aveva una NASH. Analisi di sensibilità Le analisi di sensibilità del NashTest per la diagnosi della Nash vs No NASH o NASH borderline non ha mostrato differenze significative negli AUROCs, in funzione del gruppo, dei valori ALT, del consumo di alcol, escludendo i rischi di alto fallimento dei biomarcatori, e la qualità della biopsia. Gli AUROCs del NashTest per la diagnosi della NASH vs. una borderline o nessuna NASH è risultata invariata con valori ALT più bassi di 50 IU/L verso 50UI/L che rappresenta il 50% dei pazienti (0.78 vs 0.73, p NS); quindi NashTest può essere utilizzato per diagnosticare la NASH anche in pazienti che non possono eseguire una biopsia epatica. Analisi della discordanza Un totale di 11 (4%) discordanze clinicamente significative (due stage o più) sono state osservate, nove attribuibili a un fallimento del NashTest (otto falsi negativi e un falso positivo) e due alla biopsia (falsi negativi). Nel training group, c è stata una discordanza clinica significativa (di due o più gradi) in tre pazienti, tutti con un NashTest che confermava una NASH mentre la biopsia no. Uno di questi casi aveva una buona qualità bioptica (30 mm non frammentata) ma con una necrosi piecemeal e nessuna causa di falso negativo nel NashTest; due casi avevano una qualità bioptica povera (15mm e cinque frammenti, 22 mm e due frammenti) con necrosi piece-meal alla biopsia e nessuna causa di falso positivo nel NashTest. Nel gruppo di validazione ci sono stati casi (due stages) di discordanza in otto pazienti (8%): tutti senza NASH secondo il NashTest e invece con NASH alla biopsia. Nessuno di questi otto pazienti avevano una buona qualità bioptica. C era un livello molto basso di trigliceridi (0.1 e 0.3 mmol/l) in due pazienti suggerendo due falsi negativi da NashTest.

34 34 Un nuovo panel di marcatori biochimici (NashTest) è stato validato con una stima semiquantitativa in 3 classi: No NASH, Borderline NASH, NASH. In questo studio il 4% dei pazienti aveva discrepanze, 3,5% attribuibili al NashTest e lo 0.5% alla biopsia. Questi risultati evidenziano l utilità del NashTest per i pazienti con sospetta NAFLD che permette, insieme ai precedentemente validati FibroTest e SteatoTest, di ridurre l utilizzo della biopsia epatica, identificare i soggetti a rischio e riassicurare coloro che non hanno una fibrosi o NASH. Figura 6. Curve ROC del NashTest per la diagnosi di NASH (Panel A) e No Nash (Panel B) nei Gruppi di Training e di Validazione AshTest marcatore della gravità della steatoepatite alcolica (ASH) Introduzione La malattia epatica cronica alcolica o alcoholic liver disease (ALD) colpisce milioni di persone nel mondo è una delle cause principali di trapianto di fegato e morte % dei pazienti con ALD possono sviluppare malattie epatiche gravi, emorragie digestive ed epatocarcinoma. Quelli ad alto 72, rischio includono pazienti con cirrosi e steatoepatite alcolica o alcoholic steato-hepatitis (ASH). ASH è una lesione infiammatoria necrotizzante che nella sua forma più severa -Maddrey discriminant function (DF) >32 è associata a una alta mortalità 88 nonostante il trattamento con corticosteroidi L accessibilità a una biopsia epatica transgiugolare che permette la diagnosi dell ASH è bassa in molti centri, riducendo drasticamente la proporzione di pazienti trattati con corticosteroidi. 91

35 Scoperta e validazione Il valore diagnostico dei biomarcatori (AshTest) per la diagnosi della steato-epatite alcolica nei pazienti con malattia epatica alcolica cronica 8 Thabut D, Naveau S, Charlotte F, Massard J, Ratziu V, Imbert-Bismut F, Cazals-Hatem D, Abella A, Messous D, Beuzen F, Munteanu M, Taieb J, Moreau R, Lebrec D, Poynard T. J Hepatol. 2006; 44: Gli obiettivi del presente studio erano di valutare l utilità diagnostica di un nuovo panel (AshTest) per la diagnosi della steato-epatite alcolica (ASH) in pazienti con malattia epatica alcolica cronica (ALD). Criteri d inclusione erano il consumo giornaliero riferito dai pazienti- di alcol > 50 g di puro etanolo durante l anno precedente. Criteri di non-inclusione erano : se concomitanti a una malattia epatica, anticorpi HIV e immunosoppressione, siero non disponibile o biopsia eseguita a più di 1 mese di distanza dal prelievo sanguigno. Un totale di 720 soggetti sono stati analizzati e inclusi: 70 pazienti nel gruppo di training, 62 in quello di validazione 1 chiamato dei pazienti severi -, 93 nel gruppo di validazione 2-pazienti non severi-, e 299 apparentemente donatori di sangue sani nel gruppo di controllo. L obiettivo istologico principale era la presenza di ASH, definita dalla presenza sia di infiltrati polimorfonucleati neutrofili o polymorphonuclear neutrophil infiltrate (PMN) sia da necrosi epatocellulare. L obiettivo secondario erano le caratteristiche dell ASH : necrosi, PMN, corpi di Mallory e ballooning, e un sistema di scoring dell ASH in combinazione alle caratteristiche alcoliche dettagliate. Ogni caratteristica aveva uno score da 0 a 2 in uno score totale da 0 a 8 con quattro gradi: 0, no ASH; 1 2, media; 3 4, moderata; 5 8, ASH severa. Lo staging della fibrosi è stato adattato al METAVIR: F0, no fibrosi; F1, fibrosi senza sepsi; F2, poca sepsi; F3, sepsi numerose, F4 cirrosi. La prevalenza di diagnosi istologica di ASH era diversa nei tre gruppi, qualsiasi fosse la sua definizione: l associazione di PMN e necrosi era più frequente (60%) nel gruppo di training che nei gruppi di validazione (19% vs 24%); e c era un assenza di qualsiasi caratteristica di ASH nel 13%, 48% e 30% dei gruppi, rispettivamente. La prevalenza di cirrosi era simile nel gruppo di training (81%) e nel gruppo di validazione 1 (90%) ma più basso nel gruppo di validazione 2 (25%). Costruzione del test Un nuovo panel (AshTest), è stato costruito combinando in maniera diversa i sei componenti di FibroTest ActiTest (algoritmo di intelligenza artificiale brevettato USPTO 6,631,330), con l attività del siero AST e i nuovi algoritmi aggiustati secondo l età e il sesso. La combinazione dei componenti era completamente diversa da quella del FibroTest ActiTest. AshTest fornisce una stima quantitativa numerica dell ASH che va da 0.00 a 1.00,

36 36 corrispondente a un sistema di scoring per l ASH con gradi da ASH0 ASH1 a ASH3. (Tabella 12) Tabella 12. Panel A. Conversione tra risultati AshTest e grado istologico corrispondente. Panel B. Valori medi AshTest in donatori di sangue e pazienti rispetto al grado ASH rilevato alla biopsia epatica. Panel A. AshTest Predicted histological grade ASH0 ASH ASH1 ASH ASH ASH3 Panel B. Category Median AshTest Value Blood donors No ASH 0.05 ASH grade ASH grade ASH grade Diagnosi di steatoepatite alcolica o alcoholic steatohepatitis (ASH) I componenti più significativi associati alla presenza di ASH sono stati BILI, GGT, e APOA1. In un analisi di regressione logistica, il componente più significativo era l APOA1, con un odds ratio=8.9, P= C è stato un incremento drastico nel siero di apoa1 in funzione dell infiltrato PMN: 1.29 (0.04) g/l in 133 pazienti senza PMN, 0.68 (0.09) in 57 pazienti con medio e 0.51 (0.07) in pazienti con severo PMN (P< tra nessun infiltrato PMN vs medio o severo). Valore diagnostico dell AshTest Per il primo obiettivo, l ASH diagnosticata come presenza sia di necrosi che di infiltrati di PMN, l AshTest aveva un più alto AUROC nel gruppo di training e nei gruppi di validazione 1 e 2, rispettivamente: [0.90, 0.88, 0.89] rispetto a Maddrey-DF [0.75, 0.64, 0.83] e vs.il rapporto AST/ALT [0.80, 0.79, 0.76] (tutti i P<0.05 eccetto tra AshTest e AST/ALT nel gruppo di validazione 2-pazienti non severi). L AUROC (se) dell AshTest [0.89 (0.05)] nel database integrato (n=225) era più alto negli

37 37 AUROCs di ogni componente e di Maddrey-DF e dei valori AST/ALT di ogni gruppo (Tabella 13 e Figura 8) Uno score AshTest di 0.50 aveva valori diagnostici eccellenti simili sia nel gruppo di training che nei gruppi di validazione: 88%, 92% e 59% sensibilità; e 79%, 72% e 94% specificità, rispettivamente, più alto di Maddrey-DF e del rapporto AST/ALT. C era una correlazione generale importante tra AshTest e i gradi di ASH in tutti i pazienti dai controlli all ASH severa. Per AshTest c è stata una differenza significativa tra tutti i gradi eccetto tra il grado ASH 0 e 1 e tra il grado ASH 2 e 3. (Figura 7, Panel A, B and C, rispettivamente) Tabella 13. AUROCs dell AshTest, rapporto AST -ALT e Maddrey DF per la diagnosi di ASH (definita come presenza di necrosi e infiltrati PMN) e i suoi diversi componenti. Diagnostic panel Alcoholic hepatitis Hepatocellular necrosis Polymorphonuclear infiltrate Mallory bodies Ballooning Training group AshTest AST/ALT Maddrey Validation group 1 AshTest AST/ALT Maddrey Validation group 2 AshTest AST/ALT All groups Maddrey AshTest AST/ALT Maddrey Analisi di sensibilità in funzione della lunghezza della biopsia Quando l AUROCs dell AshTest, Maddrey-DF e il rapporto AST/ALT sono stati confrontati in funzione della lunghezza della biopsia, era leggermente migliore nei pazienti con biopsie di 15 mm o più mentre NS, per biopsie più grandi o meno di 15 mm di lunghezza, rispettivamente gli AUROCs per AshTest erano sempre significativamente più alti vs Maddrey-DF (P=0.005 and p=0.0004) e vs il rapporto AST/ALT (P=0.01 and p=0.001).

38 38 Anlisi di discordanza Nel gruppo di training e nei due gruppi di validazione c erano 39/225 (17%) casi di discordanza tra la diagnosi di ASH eseguita con l AshTest e quella eseguita con la biopsia epatica. Il fallimento attribuibile alla biopsia (falsi negativi) era sospetta in 15 casi (7%). Nove casi (3%) erano indeterminati con piccole e frammentate biopsie ma nessun segno di ASH. I 16 casi rimanenti (7%) sono stati classificati come falsi negativi dell AshTest. Questo studio suggerisce che il valore diagnostico dell AshTest tramite AUROC è significativamente migliore rispetto a Maddrey-DF con un cut-off di 32,che dovrebbe essere utilizzato per prendere le decisioni terapeutiche. Inoltre, AshTest ha una migliore sensibilità e specificità in confronto al rapporto AST/ALT per la diagnosi della steatoepatite alcolica severa. AshTest è focalizzato sulla diagnosi dell ASH avanzata (con ASH definita come necrosi e PMN) in modo da sostituire la biopsia epatica intravenosa con biomarcatori in pazienti severi che potrebbero beneficiare del trattamento precoce con corticosteroidi. Figura 7. Box plots of AshTest (Panel A), Maddrey (Panel B) e rapporto AST/ALT (Panel B) in accordo alla severità dell epatite alcolica (n=225). Figura 8. Curve AUROC di AshTest (linea nera scura), Maddrey (linea grigia) e rapporto AST/ALT (linea tratteggiata) per la diagnosi dell epatite alcolica (n=225).

39 39 7. Strategie di screening con biomarcatori non-invasivi: FibroMAX (FibroTest, SteatoTest, NashTest) 7.1. Efficacia dello screening negli iperlipidemici con biomarcatori non-invasivi Screening per la malattia epatica utilizzando biomarcatori non-invasivi (FibroTest- SteatoTest-NashTest FIBROSURE ) in pazienti con iperlipidemia. 92 Ratziu V, Giral P, Munteanu M, Messous D, Mercadier A, Bernard M, Morra R, Imbert-Bismut F, Bruckert E, Poynard T. Aliment Pharmacol Ther. 2007; 25: La mortalità collegata alle complicanze della cirrosi è in aumento in pazienti con fattori di insulino-resistenza. 78 Pazienti iperlipidemici possono avere livelli sierologici aumentati nei livelli di GGT o ALT e frequentemente hanno multipli fattori di rischio di insulino-resistenza. 93 La biopsia epatica non può essere eseguita in un gran numero di pazienti e ha l inconveniente di un errore di campionamento, che è stato ben dimostrato per l epatite C e anche recentemente per la NAFLD. 18 Due studi hanno dimostrato che i biomarcatori presentano meno errori di campionamento per gli obiettivi clinici delle biopsie epatiche frammentate e piccole. 94,95 Metodi di screening non-invasivi dovrebbero essere sviluppati per iperlipidemici per identificare pazienti con una fibrosi epatica avanzata (F2F3F4) o con steatoepatite (NASH). L analisi di sensibilità fatta con studi di validazione dei biomarcatori (NashTest e SteatoTest) con la biopsia epatica, ha trovato identici valori diagnostici di NashTest e SteatoTest in accordo alla presenza o assenza di diabete e ipertrigliceridemia. 7,9 L obiettivo principale era di usare FibroTest marcatore surrogato non-invasivo, pienamente validato in varie patologie e i nuovi marcatori recentemente sviluppati, SteatoTest e NashTest, precedentemente validati nella NAFLD, per confermare la prevalenza di una malattia epatica avanzata in un ampia popolazione di pazienti iperlipidemici liberi da altre patologie. Una coorte consecutiva di iperlipidemici (HCV, HBV negativi, iperlipidemia secondaria per malattia renale o ipertiroidismo escluso) era prospetticamente seguito in un centro di lipidi e il siero (conservato a 80 C) retrospetticamente analizzato; un gruppo di controllo di donatori di sangue (BD) è stato prospetticamente incluso (donatori di sangue diabetici sono stati esclusi). Una fibrosi avanzata, evidenziata con un FibroTest più grande di 0.48, è stata definita come alcune sepsi, numerose sepsi,o cirrosi. Una steatosi avanzata (più del 5%) è stata evidenziata con SteatoTest più grande di La diagnosi di NASH è stata diagnosticata in tre categorie in accordo a Kleiner et al: NASH (NAS 5-8), Borderline NASH (NAS 3-4), No NASH (NAS 0-2).

40 40 Un totale di soggetti erano pre-inclusi ; 54 iperlipidemici e 34 BD sono stati poi esclusi per profilo ad alto rischio, 30 iperlipidemici e 78 BD per dati mancanti, per un totale di soggetti inclusi (51% donne, età media 49 anni, iperlipidemici e 925 BD). Tra gli iperlipidemici inclusi, l 83% avevano colesterolo >200mg/dl, 59% HDL-C <1.03mmol/L negli uomini e <1.29mmol/L nelle donne, 40% TG >=1.70mmol/L, 36% BMI >27, obesità centrale ( vita>102cm negli uomini e >88cm donne), 54% ipertensione arteriale o trattamento, e 15% aveva la glicemia a digiuno >6.1mmol o trattamento per diabete. Le GGT o ALT erano più elevate di 50 IU/L in solo il 24% degli iperlipidemici. Prevalenza di fibrosi epatica diagnosticata con FibroTest, fattori di fibrosi avanzata Una fibrosi avanzata presunta (F2F3F4) è stata diagnosticata dal FibroTest in 53/1909 (2.8%) iperlipidemici, inclusi 31 F2, 14 F3, 3 F3F4 e 5 F4 verso nessuna (0%) nei 925 BD (P<0.0001). Tra gli iperlipidemici diabetici, la prevalenza di F2F3F4 era più alta (6.1%), con il massimo in pazienti con HOMA superiore a 3.0 (9.5%). Caratteristiche cliniche significativamente associate a una presunta fibrosi con FibroTest in un analisi univariata erano l età, il sesso maschile, la circonferenza vita (p<0.001). Il consumo di farmaci e alcol non sono associati a fibrosi. In una regressione logistica multivariata che ha preso in considerazione i fattori metabolici non inclusi nell algoritmo FibroTest, l aumento di trigliceridi e il decremento dell HDL-C erano fattori di rischio della fibrosi. La prevalenza di una fibrosi avanzata presunta è aumentata in linea con il numero di fattori della sindrome metabolica (P<0.0001), raggiungendo il 9.4% dei pazienti iperlipidemici con 5 fattori. Prevalenza di steatosi diagnosticata da SteatoTest, fattori di rischio della steatosi severa Steatosi avanzata in 569/1893 pazienti iperlipidemici (30%) verso 8/164 (5%) nei BD (P<0.0001); La prevalenza di una steatosi avanzata era più alta per iperlipidemici con diabete di tipo 2 (66%). La prevalenza di presunta steatosi è aumentata in linea con il numero di fattori di sindrome metabolica, raggiungendo il 96% negli iperlipidemici con 5 fattori, p< Prevalenza di steato-epatite diagnosticata con NashTest, fattori di rischio della NASH La più alta prevalenza di presunta NASH è stata osservata nei pazienti diabetici di tipo 2 (23.6%), nei pazienti con ipertrigliceridemia e sotto trattamento di fibrati (16%) e in pazienti con obesità centrale (15%). La prevalenza di NASH prevalence era più elevata negli iperlipidemici con sindrome metabolica verso iperlipidemici senza (18.4% vs 1.8%, p<0.0001) e la prevalenza è cresciuta linearmente (p<0.0001) con il numero di fattori di sindrome metabolica (da 0% senza fattori fino a 50.9% negli iperlipidemici con 5 fattori). Prevalenza di danno epatico in accordo al numero di fattori metabolici La prevalenza di una presunta fibrosi avanzata è aumentata linearmente in funzione del numero di fattori di sindrome metabolica (P<0.0001), raggiungendo il 9.4% nei pazienti ipelipidemici con 5 fattori.

41 41 La prevalenza di una presunta avanzata steatosi in funzione del numero di fattori di sindrome meatbolica, ha raggiunto il 96% degli iperlipidemici con 5 fattori, p< La prevalenza di NASH è stata più elevata negli iperlipidemici con sindrome metabolica verso iperlipidemici senza (18.4% vs 1.8%, p<0.0001) e la prevalenza è aumentata linearmente (p<0.0001) con il numero di fattori metabolici (da 0% senza fattori al 50.9% negli iperlipidemici con 5 fattori). (Figura 9) Analisi di sensibilità 50% dei pazienti sono stati trattati con agenti ipolipidemizzanti (50% statine) e questo non ha avuto effetto su una presunta steatosi o NASH. L uso dei biomarcatori permette la stima della prevalenza di una fibrosi avanzata, steatosi e steatoepatite e i loro fattori di rischio in un largo campione di pazienti iperlipidemici. La prevalenza stimata di danno epatico era del 30% per la steatosi avanzata e del 7% per la NASH; gli iperlipidemici avevano il 3% di fibrosi avanzata rispetto allo 0% in 925 donatori di sangue. C era un chiaro aumento del rischio se due o più fattori di sindrome metabolica erano presenti. La più alta prevalenza è stata osservata per i pazienti diabetici iperlipidemici : steatosi avanzata nel 66%, NASH 24% e fibrosi avanzata nel 6%. L uso di questi biomarcatori dovrebbero aiutare il clinico a rassicurare i pazienti con sola steatosi e gestire meglio i pazienti con danni severi quali una fibrosi avanzata e una NASH. Figura 9. Prevalenza (%) di danno epatico (steatosi, NASH e fibrosi) in funzione del numero di fattori di rischio metabolici.

42 Efficacia dello screening in diabetici con biomarcatori non-invasivi Efficacia dello screening per fibrosi avanzata (AF) in pazienti diabetici (DB) utilizzando biomarcatori non-invasivi: FibroTest -FibroMAX e Fibroscan. 96 Jacqueminet S, Morra R, Munteanu M, Devers L, Messous D, Bernard M, Jeanne S, Sachon C, Heurtier A, Bonnefont-Rousselot D, Mercadier A, Imbert Bismut F, Ratziu V, Grimaldi A, Poynard T. J Hepatol. 2006; 44 : S260 (Abstract) I diabetici sono a rischio di non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) che può portare alla cirrosi e al cancro del fegato. A causa dell alta prevalenza di diabete, la biopsia epatica non può essere eseguita per identificare una fibrosi avanzata. L obiettivo primario era di identificare una fibrosi avanzata (alcune sepsi F2, molte sepsi F3 e cirrosi F4) utilizzando biomarcatori non-invasivi FibroTest-FibroSURE nei diabetici di tipo 2 e in concomitanza stimare la prevalenza di steatosi severa (più del 30%) e steatoeatite non-alcolica (NASH) utilizzando biomarcatori non-invasivi precedentemente validati, SteatoTest e NashTest rispettivamente. L obiettivo secondario era di confermare l interesse clinico dello screening con FibroTest tramite una seconda analisi di sospetta fibrosi avanzata con FibroScan (FSc). Sono stati inclusi prospetticamente i diabetici di un unità di diabete cosi come un gruppo di controllo di donatori di sangue (BD). Algoritmi di sicurezza hanno permesso di escludere i profili ad alto rischio (HR) per I biomarcatori sierici. FibroMax è stato realizzato secondo tutte le caratteristiche. Una fibrosi avanzata diagnosticata con FibroTest era maggiore di 0.48, è stato definito con alcune sepsi, numerosi sepsi, o cirrosi. Una steatosi avanzata (più del 5%) è stato diagnosticato quando ST era più grande di La diagnosi della NASH è stata diagnosticata in tre categorie in accordo con Kleiner et al: NASH (NAS 5-8), Borderline NASH (NAS 3-4), No NASH (NAS 0-2). I diabetici in cui si era evidenziata una fibrosi avanzata (AF) con il FibroTest sono stati riesaminati da un epatologo con FSc, APRI, e se necessario con ecografia, endoscopia o biopsia. I diabetici con sospetta fibrosi avanzata (paf) sono stati analizzati solo per la validazione del FibroTest e i diabetici senza paf come una vera popolazione naïve (np). Dai soggetti preinclusi, 252 sono stati esclusi (75 HR e 177 riesaminati), sono stati inclusi: diabetici e 988 BD. Il 54% dei diabetici erano maschi, età media 54anni, il 68% diabetici di tipo 2; l 81% aveva la glicemia a digiuno 6.1 mmol/l,il 68% aveva glicoemoglobina 7.5%, il 39% colesterolo 2.00 g/l, 27% trigliceridi 1.5g/L, 53% BMI 27, 50% ipertensione arteriale, 47% nessun consumo di alcol, 40% <50g/d, e 13% >50 g/d. I donatori di sangue erano più giovani (36 anni), avevano un BMI più basso (p<0.0001) e meno donatori di sangue non assumevano alcol.

43 43 Prevalenza di lesioni epatiche diagnosticate dai biomarcatori In diabetici, FibroTest ha diagnosticato 94 casi (8.1%) con fibrosi avanzata: 28 F4, 26 F3 e 40 F2, verso 0 in BD (P<0.0001); 25 diabetici dei 94 avevano una sospetta fibrosi avanzata (paf) e 69 erano una vera popolazione diabetica naïve (np). FibroTest ha diagnosticato 69 fibrosi avanzate tra 1136 diabetici np (6.1%). Tra i 94 F2F3F4, 49 diabetici (12 paf e 37 np) da 94 AF sono stati riesaminati al tempo di questo scritto: -tra 25 diabetici definiti come paf, 12 sono stati riesaminati e sono tutti stati confermati come AF da Fibroscan (Fibroscan range kPa) ossia il 100% PPV nel protocollo per e 48% (12/25) nell analisi intention to detect. -tra 69 np, 37 sono stati riesaminati e AF è stato confermato in 25 (range FS kpa, 8 biopsie e 2 endoscopie), portando a un PPV del FibroTest = 67.6% (25/37) nel protocollo per e 36.2% (25/69) nell analisi intention to detect Per i 25 diabetici np riesaminati e con i risultati confermati da FibroTest, la ripartizione della fibrosi è risultata come segue: 10 F2, 8 F3 e 7 cirrosi (2 con confermati e uno con sospetto epatocarcinoma, 1 con varici moderate). La causa della fibrosi avanzata era NAFLD da sola in 15/25 (NASH in 7 e NASH borderline in 6) e NAFLD + HCV in 3, NAFLD + alcol in 4 e NAFLD + metastasi, PBC e HBV, uno in ogni caso rispettivamente. In un analisi multivariata due fattori erano fortemente associati (p<0.0001) con AF: diabete di tipo 2 (88%) e età superiore a 45 anni (97%). In questo gruppo ad alto rischio per la fibrosi avanzata, la prevalenza di AF diagnosticata = 9.1% (62/679) vs 1.5% (7/457) nel gruppo a non alto rischio (p<0.0001) e 0% nei donatori di sangue. I valori diagnostici positivi del FibroTest per una AF confermata nel gruppo ad alto rischio = 25/35 (71.4%) nel protocollo per e 25/62 (40.3%) nell analisi intention to detect. Steatosi e NASH diagnosticate da SteatoTest e NashTest 388/912 (42.5%) diabetici avevano una steatosi diagnosticata da SteatoTest verso 11/222 (5%) nei BD (p<0.0001). Nei diabetici di tipo 2 con fibrosi avanzata verso nessuna o una minima fibrosi, la steatosi è stata diagnosticata da SteatoTest nel 74% verso il 59%, rispettivamente (p=0.03). 63/778 (8%) diabetici avevano una NASH diagnosticata da NashTest verso nessun BD (p<0.0001). Nei diabetici di tipo 2 con una fibrosi avanzata verso nessuna o una minima fibrosi, la NASH è stata diagnosticata da NashTest nel 22% verso il 9%, rispettivamente (p=0.005).

44 44 Una strategia di screening utilizzando FibroTest ha diagnosticato la fibrosi avanzata (F2F3F4) nel 6.1% dei diabetici seguiti da un centro specifico e non sospettati prima di malattia epatica. Il 36% di questi era già stato confermato inclusi 7 casi di cirrosi asintomatiche. La prevalenza di NASH diagnosticata in diabetici stimata da NashTest è dell 8% vs 0 dei donatori di sangue (p<0.0001). Questo studio suggerisce fortemente che i biomarcatori non-invasivi potrebbero essere molto utili per lo screening della fibrosi avanzata e NASH nei diabetici di tipo 2 oltre ai 45 anni d età per prevenire la mortalità epatica. (Figura 10) 8. Conclusione Più di di persone nel mondo sono cronicamente colpite dal virus con epatite C (HCV), più di dal virus con epatite B (HBV) e più di un miliardo sono a rischio di steatosi alcolica o non alcolica. Queste quattro malattie sono responsabili di più di casi all anno di cancro al fegato e simili numeri per emorragie digestive ed episodi di ascite. Grandi scoperte sono state fatte recentemente per la diagnosi specifica e il trattamento di queste patologie. Sfortunatamente, anche in paesi sviluppati, la mortalità dovuta a malattie croniche epatiche sta crescendo a causa di una mancanza di diagnosi e trattamento. I test FibroMax (FibroTest, SteatoTest, ActiTest, NashTest e AshTest) sono semplici e rappresentano un alternativa alla biopsia epatica. La biopsia epatica, anche se considerata il gold standard, non ha i vantaggi richiesti per una procedura iniziale per confermare la severità delle patologie croniche epatiche o di epatite acuta in bevitori eccessivi. L inconveniente principale della biopsia epatica sono gli errori di campionamento, il costo e gli eventi avversi severi. FibroMax sarà utile per diminuire i costi umani, sociali ed economici nella gestione delle patologie croniche epatiche. L utilizzo iniziale di questi biomarcatori permetterà un accesso più semplice e facile al sistema sanitario per i pazienti prima dello sviluppo di patologie epatiche gravi.

45 45 9. FibroMAX pacchetto: come e quando usare i biomarcatori non-invasivi, algoritmi raccomandati 9.1. Migliore gestione dei pazienti con fattori di rischio metabolici (sovrappeso, dislipidemia, diabete). FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest e NashTest Il bisogno di uno screening di massa per danni epatici importanti per fornire informazioni diagnostiche in pazienti con NAFLD è in crescita a causa dell epidemia di obesità e diabete. 19 Due recenti studi 92,96 (vedere Capitolo 7) hanno provato l efficacia dello screening con una nuova generazione di test FibroMax (in combinazione FibroTest, SteatoTest e NashTest) per pazienti con fattori di rischio metabolici in particolare iperlipidemici e diabetici. 6-7,9 Questi test permetteranno una migliore identificazione e stima della severità di questi pazienti a rischio (fibrosi e NASH) e una riassicurazione per i pazienti senza fibrosi o NASH in quelli con steatosi. Figura 10. Strategia di screening proposta per la fibrosi avanzata,steatosi e NASH nei pazienti con NAFLD.

46 Miglior gestione dei pazienti con eccessivo consumo di alcol. FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest e AshTest La malattia epatica alcolica cronica o chronic alcoholic liver disease (ALD) colpisce milioni di persone nel mondo ed è una delle cause principali di trapianto di fegato e morte. Questi pazienti con ALD ad altissimo rischi di sviluppo di complicanze e malattie epatiche finali includono pazienti con cirrosi e steatoepatite alcolica 72, ASH è una lesione infiammatoria necrotizzante che nella sua forma più severa (Maddrey- DF >32) è associata ad alta mortalità 88 nonostante il trattamento con corticosteroidi L uso di biomarcatori non-invasivi validati per la diagnosi della fibrosi 5 e ASH 8 presuppone un aumento nella proporzione di pazienti con ASH severa trattata con corticosteroidi senza biopsia epatica. (Figura 11). Figura 11. Strategia di Screening proposta per steatoepatite alcolica severa (ASH) in bevitori. Panel A. ASH Strategia di screening e trattamento.

47 47 Panel B. Strategia di screening della fibrosi nel paziente con ALD.

48 Miglior gestione dei pazienti con epatite virale cronica 1,72 FibroMAX pacchetto: FibroTest, SteatoTest and ActiTest Figura 12. Algoritmo raccomandato per FibroTest-ActiTest-FIBROSURE o prescrizione alternativa.

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