UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA

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1 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Herpesvirus

2 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Origine del nome dal greco (Ippocrate) herpein: insinuarsi, strisciare...o'er ladies lips, who straight on kisses dream, which oft the angry Mab with blisters plagues,...o sulle labbra delle donne che sognano baci, e che invece spesso la perfida fata Regina Mab ricopre di bollicine, Romeo and Juliet, W. Shakespeare, c1595

3 Famiglia: Herpsviridae

4 Herpesvirus: caratteri generali - genoma: DNA bicatenario - diametro: nm - simmetria icosaedrica - capside con 162 capsomeri - presenza del mantello - presenza del tegumento - è inattivato da etere e cloroformio. La replica è nucleare (al microscopio visibili inclusioni intranucleari) PM: 100x10 6.

5 Peculiarità degli Herpesvirus Il genoma codifica per molte proteine che regolano la sintesi di DNA e di RNAm e la sintesi proteica Codifica per enzimi come la DNA pol che promuove la replica virale. La replica è nucleare il virus gemma dalla membrana nucleare e viene liberato per esocitosi. Gli HSV causano infezioni litiche, persistenti, latenti e, per l EBV, immortalizzanti. Sono ubiquitari, la CMI è richiesta per la risoluzione

6 Il genoma di tutti gli Herpesvirus è lineare a doppio filamento, ma differisce per dimensioni e orientamento dei geni. Sequenze ripetute, dirette o invertite, delimitano regioni uniche del genoma: regione unica lunga (U L ); regione unica breve (U S ) e permettono la circolarizzazione del genoma e la sua ricombinazione. La ricombinazione tra sequenze ripetute ed invertite di HSV, CMV, e VZV permette a estese regioni del genoma di invertire l orientamento reciproco dei segmenti genomici U L e U S, formando genomi isomerici.

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8 Replicazione degli Herpesvirus attacco delle gp virali (VAP: gb, gc, gd, gh,ge/gi) ai glicosaminoglicani (recettore: eparansolfato) presenti sulla cellula bersaglio. penetrazione per fusione (gp di fusione: gb) del mantello con la membrana citoplasmatica: ingresso nel citoplasma il nucleocapside raggiunge la membrana nucleare, rilascio del genoma nel nucleo trascrizione del genoma e sintesi delle proteine virali.

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11 La trascrizione del genoma e la traduzione delle proteine virali avviene in 3 fasi: Sintesi delle proteine precocissime (α) Sintesi delle proteine precoci (β) Sintesi delle proteine tardive (γ) Proteine α: fattori di regolazione della trascrizione genica Proteine β: ulteriori fattori di trascrizione ed enzimi (polimerasi- timidina chinasi) Proteine γ: strutturali

12 Il nuovo genoma è trascritto dalla RNApol-DNAdip cellulare (RNA polimerasi II) La replica del genoma virale avviene ad opera della DNApol DNAdip virale (la DNA polimerasi virale è il bersaglio degli antivirali). Enzimi virali di recupero dei nucleotidi forniscono i substrati deossiribonucleotidici alla polimerasi. Questi enzimi favoriscono la replica virale in cellule che non si trovano in fase replicativa, dove mancano i substrati necessari alla sintesi del DNA virale (ad es., i neuroni). Altre proteine regolano la replica, inibiscono la risposta immune dell ospite e inibiscono l apoptosi e stabiliscono la latenza.

13 I procapsidi vuoti si assemblano nel nucleo, poi si inserisce il DNA Il mantello viene acquisito dal foglietto interno della membrana nucleare o dalle vescicole del Golgi Il virus esce per lisi o esocitosi β α γ Il DNA virale si circolarizza e si replica come concatamero

14 Ciclo replicativo di HERPES VIRUS VP16: proteina del tegumento Il DNA virale si circolarizza e si replica come concatamero

15 Struttura dell HSV-1 e HSV-2 Il genoma codifica per 80 proteine Alcune hanno funzione enzimatica come: DNApol-DNAdip DNAsi timidina chinasi proteasi ribonucleotide reduttasi (converte i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi) Molti di questi enzimi sono bersagli degli antivirali.

16 Il genoma dell HSV codifica per 10 glicoproteine che hanno funzioni di attacco (gb, gc, gd, gh, ge/gi) di fusione (gb) di proteine strutturali di evasione della risposta immune (gc, ge, gi) altre funzioni Ad es. la componente C3 del complemento si lega a gc e viene cosi eliminata dal siero. La porzione Fc delle IgG si lega al complesso ge/gi, mascherando cosi il virus e le cellule infettate dal virus. Tali attività riducono l efficacia antivirale degli anticorpi.

17 Replica virale Il virus instaura infezioni litiche in fibroblasti e in cellule epiteliali e infezioni latenti nei neuroni. L HSV-1 si lega all eparansolfato, un proteoglicano localizzato sulla superficie di molti tipi cellulari, ed in seguito interagisce con un recettore proteico adiacente. La fusione e penetrazione nella cellula ospite con la membrana dalla cellula è mediata dalla nectina -1α (HveC o PRR1) o un altro recettore detto HveA. Il virione viene rilasciato nel citoplasma e poi inizia la fase di trascrizione virale, una protein-chinasi codificata dal virus, e proteine citotossiche. Il capside si attacca a un poro nucleare e rilascia il genoma nel nucleo.

18 traduzione delle proteine Proteine precocissime (α): fattori di regolazione della trascrizione genica (stimolano la sintesi del DNA e delle proteine precoci) Proteine precoci (β): ulteriori fattori di trascrizione ed enzimi (DNA pol-dna dip, timidina-chinasi) Proteine tardive (γ): proteine strutturali (prodotte dopo la replicazione del genoma) Proteine α: regolatrici - fattori di trascrizione Proteine β: regolatrici - DNA pol- timidina chinasi Proteine γ: strutturali

19 Le proteine precocissime (α) comprendono proteine leganti il DNA, che stimolano la sintesi di DNA e promuovono la trascrizione dei geni virali precoci. Durante una infezione latente viene trascritta una regione specifica da cui si originano i trascritti associati alla latenza (LAT), ma tali RNA non sono tradotti in proteine. Le proteine precoci (β) includono la DNApol DNA-dip e una timidina chinasi. Altre proteine precoci inibiscono la produzione e iniziano la degradazione del DNA e degli RNAm cellulari(mrna). L espressione dei geni precoci e tardivi conduce alla morte della cellula: infezione litica

20 La replica del genoma inizia non appena viene sintetizzata la polimerasi. Nelle prime fasi il genoma assume forme circolari e concatameriche testa-coda, il DNA si replica mediante un meccanismo di cerchio rotante che genera un filamento di genoma. I concatameri danno origine ai singoli genomi, quando vengono incorporati in un procapside.

21 La replicazione del genoma porta alla trascrizione dei geni tardivi che codificano per le proteine strutturali. Le proteine del capside vengono trasportate nel nucleo dove vengono assemblate in procapsidi vuoti, all interno dei quali viene inserito il DNA. I capsidi contenenti il DNA si associano alle membrane nucleari contenenti proteine virali e gemmano all interno del reticolo endoplasmatico verso il citoplasma. Le gp virali vengono sintetizzate e processate nello stesso modo delle gp cellulari. Le proteine del tegumento si associano con il capside virale nel citoplasma, poi il capside virale gemma nell apparato del Golgi per acquisire il pericapside glicoproteico, il virus viene rilasciato per esocitosi o lisi cellulare.

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23 L infezione dei neuroni da parte di HSV può comportare la replicazione virale oppure lo stabilirsi della latenza, a seconda di quali geni virali il neurone è in grado di trascrivere. La trascrizione solo dei LAT e di nessun altra proteina genera la latenza. Se, invece la cellula è in grado di trascrivere i geni precocissimi del virus, questo potrà replicarsi. Cosi come accade per gli altri alfa-herpesvirus, HSV codifica una TK (enzimi di recupero) per favorire la replica nelle cellule che non si replicano, come i neuroni. L HSV inoltre codifica per una proteina ICP34.5 che facilita la crescita del virus all interno dei neuroni, rimuovendo un blocco cellulare per la sintesi proteica, che viene attivato in risposta a l infezione virale o come risposta all IFN alfa.

24 Alcuni caratteri differenziali tra HSV-1 e HSV-2 Entrambi: struttura simile, diametro di nm Si differenziano in base ad alcune proprietà biologiche HSV-1: forma placche più piccole se coltivata nella linea cellulare chiamata Morris hepatoma (MCA) è meno sensibile alle alte T è più sensibile alla eparina. Herpes simplex virus (HSV) non forma sincizi nei monostrati cellulari renali è poco neurotropico se inoculato negli animali da esperimento.

25 Patogenesi ed Immunità I virus HSV-1 e 2 infettano e si replicano in cellule mucoepiteliali e stabiliscono poi una infezione latente nei neuroni che innervano l area infettata. HSV causa malattia nel sito d infezione. In genere HSV-1 causa infezioni nella parte superiore del corpo HSV-2 causa infezioni nella parte inferiore.

26 Patogenesi ed Immunità HSV causa infezioni litiche in molte cellule persistenti in linfociti, macrofagi infezioni latenti nei neuroni A livello nucleare delle cellule infettate si ha la formazione di corpi inclusi intranucleari acidofili di Cowdry di tipo A. Altri ceppi formano dei sincizi.

27 Patogenesi ed Immunità Penetrazione del virus attraverso lesioni di cute e membrane mucose. Il virus si riproduce alla base della lesione ed infetta i neuroni innervanti raggiungendo per trasporto assonale retrogrado i gangli: gangli del trigemino per l HSV-1 gangli sacrali per HSV-2 Il virus poi ritorna nel sito iniziale di infezione e può rimanere inapparente o causare lesioni vescicolari. La lesione si rimargina senza lasciare la cicatrice.

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29 Patogenesi ed Immunità La risposta immune si basa su: IFN-gamma, cellule NK, DH (ipersensibilità ritardata). I linfociti T citotossici (CTL e T Killer) uccidono le cellule infettate e risolvono la malattia in atto. Anticorpi neutralizzanti (NT) limitano la sua diffusione. In assenza di CMI, l infezione si può disseminare ad organi vitali ed al cervello.

30 La ricorrenza può essere causata da stress, traumi, febbre, esposizione alla luce solare. In questo caso il virus migra a ritroso lungo il nervo, causando lesioni a livello cutaneo o mucoso. La riattivazione può avvenire anche in presenza di anticorpi, tuttavia sono meno gravi più localizzate e di minore durata rispetto agli episodi primari, grazie alla memoria immunitaria.

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34 Epidemiologia degli HSV-1 e -2 l HSV è labile, inattivato da ambiente secco, detergenti, tratto GI. E trasmesso dai liquidi delle vescicole, saliva, secrezioni vaginali ( il mescolarsi e il combinarsi di membrane mucose ). Causano infezioni orali e genitali. HSV-1: contatto orale, baci, bicchieri, spazzole, saliva, dita, cute,il virus penetra attraverso una lesione cutanea. L autoinoculazione può anche causare l infezione degli occhi. HSV-2: contatto sessuale, autoinoculazione, madrefeto. Escrezione del virus dalla cervice durante le perdite vaginali.

35 Soggetti a rischio di contrarre infezioni da HSV - bambini (HSV-1) - persone attive sessualmente (HSV-2) - medici, infermieri, dentisti, ginecologi persone a contatto con secrezioni orali e genitali (patereccio erpetico).

36 infezioni da HSV-1 e HSV-2 HSV-1

37 Le fasi dell herpes labiale 1 e 2 giorno formicolio 2 e 3 giorno prurito e arrossamento 4 giorno-> comparsa di vescicole acquose 5 e 6 giorno -> rottura delle vescicole 8-10 giorno -> processo di guarigione

38 Manifestazioni cliniche delle infezioni da HSV-1 Infezioni primarie: vescicole trasparenti con base eritematosa, che si trasformano in lesioni pustolose, ulcere e croste. Gengivostomatite primaria (bambini tra il 6 mese e il 3 anno di età): lesioni, ulcere, (bocca, palato) faringe, gengive, mucosa buccale, lingua. Latenza nel ganglio del trigemino. Cheratocongiuntivite erpetica limitata ad un solo occhio. Ulcere corneali o vescicole palpebrali. Può dare episodi ricorrenti causando cicatrici permanenti, danno corneale e cecità Faringite erpetica Stomatite Eczema erpetico Patereccio erpetico Herpes gladiatorum

39 Manifestazioni cliniche delle infezioni da HSV-1 Infezioni primarie: vescicole trasparenti con base eritematosa, che si trasformano in lesioni pustolose, ulcere e croste. Herpes labiale Stomatite Gengivostomatite primaria Cheratocongiuntivite erpetica Faringite erpetica Eczema erpetico Patereccio erpetico Herpes gladiatorum Encefalite erpetica Herpes neonatale

40 HSV-1: herpes labiale

41 Lesioni erpetiche primarie (HSV-1) Gengivostomatite primaria (bambini tra il 6 mese e il 3 anno di età): lesioni, ulcere, (bocca, palato) faringe, gengive, mucosa buccale, lingua. Latenza nel ganglio del trigemino. Gengivostomatite erpetica

42 Lesioni erpetiche primarie (HSV-1) Cheratocongiuntivite erpetica limitata ad un solo occhio. Ulcere corneali o vescicole palpebrali. Può dare episodi ricorrenti causando cicatrici permanenti, danno corneale e cecità Cheratite erpetica

43 Lesioni erpetiche primarie (HSV-1) Infezioni cutanee Patereccio erpetico Eczema erpetico Herpes gladiatorum Patereccio erpetico Eczema erpetico Herpes gladiatorum

44 Encefalite erpetica (HSV-1): malattia febbrile acuta. Le lesioni sono limitate ad un solo lobo temporale. Elevato indice di mortalità Meningiti da HSV-2 infezioni da Herpesvirus dopo 10gg dall infezione primaria, febbre elevata, rigidità nucale, mal di testa, fotofobia, nausea. Herpes neonatale (17%: HSV-2) Il neonato si infetta per via transplacentare, perinatale. Disseminazione del virus a fegato, polmoni e SNC, in alcuni casi l infezione è letale.

45 Manifestazioni cliniche delle infezioni da HSV-2 Nei maschi lesioni sul glande o su tutto il pene. Nelle femmine: vulva, vagina, cervice, area perianale Sintomi: le lesioni possono essere accompagnate da febbre, mal di testa, malessere, adeniti inguinali, perdite vaginali, negli omosessuali proctiti. Latenza nei gangli sacrali Riattivazioni ogni 2-3 settimane. Herpes genitale della vulva Herpes genitale del pene

46 Herpesvirus Sieropositività dell HSV-2 (1% nei collegi maschili, 15-20% in persone ad alte condizioni igieniche % in persone a basse condizioni igieniche, 80% prostitute). L HSV-2 è associato da un punto di vista sieroepidemiologico con il cancro della cervice nella donna (come cofattore per gli HPV).

47 Diagnosi di infezione da Herpesvirus Campioni biologici: Raschiamenti dalle vescicole (strisci di Tzanck). Aspirando il liquido delle lesioni con tamponi di cotone alle vescicole, colorando con Wright/Giemsa Esame colturale in cellule diploidi umane (HeLa, HEp2, fibroblasti), cellule renali di coniglio. Presenza di cellule giganti polinucleate (sincizi) con inclusioni (Corpi di Cowdry di tipo A; n.b.: Cowdry tipo B = cellule infettate da poliovirus) IMMUNOFLUORESCENZA Effetto citopatico in ore. Immunoistochimica. PCR: DNA virale in campioni biologici. Ricerca di anticorpi mediante differenti metodiche sierologiche I tests sierologici sono utili per la diagnosi di una infezione primaria e per studi epidemiologici.

48 Terapia e profilassi I farmaci possono essere analoghi nucleosidici o inibitori della DNA polimerasi. I farmaci inibiscono la replica virale agendo sugli enzimi della replica ma non sono in grado di eliminare il virus in latenza nei gangli sensoriali. Aciclovir (vedi ) vidarabina iododeossiuridina (cheratite erpetica) trifluoridina (cheratite erpetica) famciclovir, valaciclovir, penciclovir Evitare il contatto con le lesioni. Uso di guanti, uso di preservativi, parto cesareo. No vaccini.

49 L aciclovir è un analogo nucleosidico, è il farmaco anti-hsv, viene attivato dalla fosforilazione della timidina chinasi virale e poi utilizzato come substrato dalla DNApol virale. In seguito questi farmaci vengono incorporati nel DNA virale prevenendo cosi la sua sintesi. La resistenza a questi farmaci deriva da mutazioni che inattivano la TK, riducendo la conversione del farmaco nella sua forma attiva. Mutazioni della DNApol producono resistenza.

50 HSV-3: virus varicella-zoster (VZV)

51 VZV: caratteri generali Diametro di nm Simmetria icosaedrica 75 proteine Il mantello è sensibile all ambiente secco e ai detergenti. Caratteristiche in comune con l HSV-1 e -2: 1) stabilisce infezioni latenti nei neuroni 2) La CMI è importante nella difesa 3) Le lesioni sono simili. Codifica per una timidina-chinasi ed è sensibile ai farmaci antivirali. Si trasmette attraverso le vie respiratorie.

52 VZV Patogenesi La trasmissione attraverso le vie respiratorie. L infezione primaria inizia con l infezione delle tonsille e della mucosa respiratoria, poi vasi linfatici, viremia, SRE. Dopo gg la seconda viremia, infezione dei linfociti T, cellule epiteliali cutanee. A livello cutaneo causa un rash: macula, papula, vescicola, pustola, crosta. Le manifestazioni sono asincrone. Febbre e sintomi sistemici si accompagnano al rash.

53 Latenza nelle radici dei gangli dorsali e dei nervi cranici. Riattivazione, migrazione dai gangli alla cute zoster. Gli Ab limitano la diffusione della viremia di VZV ma la CMI è importante per limitare, la progressione e la risoluzione della malattia. In assenza di CMI il virus causa disseminazioni (polmoni, fegato, cervello).

54 L infezione primaria acuta è la varicella. La riattivazione causa l herpes zoster (fuoco di S. Antonio) nei dermatomeri innervati. Latenza nelle radici dorsali e gangli dei nervi craniali. La CMI è protettiva.

55 Varicella È una delle 5 malattie esantematiche infantili insieme a morbillo rosolia V a malattia (Parvovirus B19) 6 a malattia o roseola infantum (Herpes tipo 6 e 7) CLINICA può essere sintomatica o asintomatica. Febbre, rash maculo-papulare dopo una incubazione di 14 gg. Rash: macule, papule, vescicole, pustole, croste. Il rash è asincrono; le manifestazioni durano 3-5 giorni. Il rash è generalizzato: tronco, estremità, testa. Negli adulti è più grave e si ha una polmonite interstiziale nel % di pazienti adulti.

56 Herpes zoster Riattivazione di una infezione latente di varicella. Dolore acuto nelle aree innervate precede la comparsa di lesioni. I eritema è limitato ai dermatomeri. Lesione maculo-papulare con base eritematosa, vescicole. Una complicazione è la nevralgia posterpetica che persiste per mesi/anni che si verifica nel 30% dei pazienti con età > 65 anni che hanno sviluppato lo zoster. Un altra complicazione è lo zoster oftalmico.

57 Herpes zoster ( fuoco di S. Antonio )

58 Virus della Varicella-Zoster Infezione e diffusione

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61 Epidemiologia Il virus è molto contagioso, il 90% circa delle persone suscettibili hanno contratto l infezione in casa tra i familiari. La malattia ha la trasmissione per via respiratoria o mediante contatto con vescicole cutanee. I pazienti sono contagiosi prima e durante i sintomi. Il % delle persone infettate dal VZV sviluppa lo zoster, l incidenza è parallela con l età. Lo zoster può essere una sorgente d infezione di varicella in persone non immuni come i bambini.

62 Soggetti a rischio Personale sanitario Maestri, insegnanti, personale di scuole e asili Residenti in case di cura Carcerati, personale di sorveglianza Militari

63 Diagnosi (simile a HSV-1 e 2) Raschiamenti dalle vescicole IF diretta Biopsie, secrezioni respiratorie Strisci di cellule di Tzanck Esame colturale su fibroblasti diploidi umani CPE (dopo 3-6gg), corpi inclusi di Cowdry tipo A. Inclusi nucleari, sincizi. Biopsie per ricercare gli Ag (Immunofluorescenza per ricercare gli antigeni di membrana). RT-PCR. Test sierologici (ELISA) VZV

64 Trattamento, Prevenzione e Controllo delle infezioni da VZV - bambini con varicella: non si effettua terapia. - adulti o a pazienti ID con VZV: terapia con aciclovir, famciclovir, valaciclovir. Uso di VZIG (immunoglobuline vs. varicellazoster). Analgesici,anestetici locali danno sollievo dalla nevralgia posterpetica che segue lo zoster. Uso di Vaccino Oka (a virus vivo ed attenuato).

65 Virus di Epstein-Barr (EBV) EBV causa: Mononucleosi infettiva Linfoma di Burkitt Linfoma di Hodgkin Carcinoma nasofaringeo Leucoplachia orale capelluta

66 Appartiene ai gammaherpesvirus - diametro nm. EBV - codifica per 70 proteine, espresse o meno a seconda dei differenti tipi di infezioni. 2 classi di EBV: EBV-A presente solo nelle cellule B di persone immunocompetenti, EBV-B è isolato in persone immunocompromesse

67 replica di EBV Tropismo limitato dal recettore per il C3d del complemento (detto anche CR2 o CD21) e da un corecettore costituito dalle molecole di classe II del sistema HLA espresso su: linfociti B cellule epiteliali dell orofaringe e nasofaringe L infezione da EBV ha 3 possibili evoluzioni: a) il virus si può replicare in linfociti B e in cellule epiteliali permissive per la replicazione di EBV (infezione di tipo replicativo); b) il virus può causare infezioni latenti in linfociti B (semipermissive) in presenza di linfociti T (infezione latente); c) il virus può stimolare e immortalizzare le cellule B.

68 Infezione permissiva sulle cellule epiteliali e linfociti B Le cellule permissive permettono la trascrizione e la traduzione della proteina attivatrice ZEBRA, che attiva i geni precocissimi del virus (BZLF1 e BRLF1) ed il ciclo litico. Segue la sintesi della DNApol e la replica del DNA Sono poi sintetizzate le proteine strutturali del capside virale. Le gp comprendono la gp 350/220 che è la proteina virale di attacco e la gp 85. Le proteine virali prodotte durante una infezione produttiva sono: antigene precoce (EA) antigene del capside virale (VCA) gp dell antigene di membrana (MA)

69 EBV Durante l infezione latente e immortalizzante vengono espressi differenti trascritti virali. Vengono espressi geni precocissimi come 1) 5 antigeni nucleari di Epstein - Barr (EBNA) 2) proteine latenti (LP) 3) proteine latenti di membrana 1,2 (LMP) 4) EBER-1, EBER-2 (2 piccoli RNA)

70 Le EBNA (EBNA 1, 2, 3a, 3b, 3c) e le LP sono proteine che si legano al DNA sono essenziali per lo stabilirsi dell infezione (EBNA-1) e per l immortalizzazione (EBNA-2). Le LMP sono proteine di membrana ad attività oncogeno-simile. Queste proteine stimolano la crescita ed immortalizzano cellule B.

71 Patogenesi e Immunità La malattia da EBV risulta o da una risposta immunitaria iperattiva (mononucleosi infettiva) o dalla mancanza di una risposta immunitaria efficace (linfoma, leucoplachia orale capelluta) L infezione produttiva delle cellule B e delle cellule epiteliali dell orofaringe, come le tonsille, promuove la liberazione del virus nella saliva per trasmettere il virus ad altri ospiti e stabilisce una viremia per diffondere il virus ad altre cellule B nel tessuto linfatico e sangue.

72 EBV è un mitogeno per le cellule B. Le proteine del virus attivano la replicazione delle B cells e prevengono anche l apoptosi. Le T-cells controllano la proliferazione delle B-cells: in assenza delle T-cells, EBV può immortalizzare i linfociti B. In vivo la proliferazione delle cellule B porta alla produzione di IgM spurie dette anticorpi eterofili. Se i linfociti T non riescono a limitarla, la proliferazione continuata delle cellule B (assieme agli effetti di altri cofattori) può causare lo sviluppo di linfomi.

73 Nel corso dell infezione produttiva gli anticorpi sono prima prodotti contro i componenti del virione, VCA ed MA e poi contro EA. Dopo la guarigione dell infezione viene prodotto un anticorpo contro Ag nucleari (EBNA). Le cellule T sono essenziali per limitare la proliferazione delle cellule B infettate da EBV e per il controllo della malattia. La mononucleosi infettiva è il risultato di una guerra civile tra le cellule infettate da EBV e le cellule T ad azione protettiva.

74 La linfocitosi e l epatosplenomegalia che si osserva nella mononucleosi deriva dall attivazione e proliferazione delle cellule T. Si tratta di linfociti T atipici (o cellule di Downey o virociti ), che aumentano numericamente nel sangue periferico durante la seconda settimana di infezione raggiungendo il 10-80% del n totale dei leucociti. L EBV può essere riattivato quando la cellula B della memoria viene attivata e può diffondersi nella saliva.

75 Patogenesi dell EBV a) EBV nella saliva cellule epiteliali dell orofaringe, escrezione del virus dalla saliva faringiti. b) EBV nella saliva cellule epiteliali dell orofaringe proliferazione delle cellule B anticorpi eterofili. c) EBV nella saliva cellule epiteliali dell orofaringe proliferazione delle cellule B attivazione delle cellule T (fegato, linfonodi, milza) risoluzione linfociti T atipici (Cellule di Downey) ingrossamento.

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77 Mononucleosi infettiva

78 Marker dell infezione di EBV 1) EBNA: Ag nucleare, marker precoce, si lega al DNA, gli Ab indotti si sviluppano tardivamente. 2) Ag precoce: EA-R (citoplasmatico), marker del ciclo litico, gli Ab Anti-EA-R sono presenti nel Linfoma di Burkitt. 3) Ag EA-D (citoplasmatico e nucleare). Gli Ab sono presenti in soggetti con mononucleosi infettiva. 4) Ag capsidico virale (VCA), citoplasmatico. Ag tardivo, presente nelle cellule produttive; Ab anti-vca IgM sono transitori, Ab Anti-VCA IgG sono persistenti.

79 Marker dell infezione di EBV 5) Ag di membrana LYDMA, è presente nelle cellule produttive e nelle infezioni in vitro; Non è rivelabile da anticorpi. 6) Ag di membrana MA, presente sulla superficie cellulare, presente sul mantello. Gli Ab anti-ma transitori e persistenti. 7) Anticorpi eterofili. La proliferazione delle cellule B indotte da EBV promuove la produzione di Ab eterofili. Si rivelano con la prova di Paul Bunnell- Davidsohn (PBD) su emazie di pecora, cavallo o bovino.

80 Epidemiologia dell EBV Mononucleosi infettiva: trasmissione attraverso la saliva, contatti stretti (malattia del bacio) o tramite spazzolini, bicchieri contaminati. Linfoma di Burkitt: cofattori malaria, predisposizione genetica. Carcinoma nasofaringeo: predisposizione genetica e alimentazione (Cina). Leucoplachia orale capelluta: trapiantati e malati di AIDS sono ad alto rischio.

81 Clinica Mononucleosi infettiva Periodo d incubazione 30-40gg, Bambini, adolescenti, adulti. Sintomi: febbre alta, malessere, faringite essudativa, linfoadenopatia, epatosplenomegalia, affaticamento, disordini neurologici, ostruzione laringea, rottura della milza. Complicazioni neurologiche: - meningoencefalite asettica - sindrome di Guillain-Barré

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83 EBV: altre patologie correlate Sintomatologia simile alla sindrome da fatica cronica caratterizzata da febbricola, mal di testa, gola infiammata, debolezza muscolare, spossatezza. Disordini linfoproliferativi indotti da EBV: - Linfomi in pazienti senza cellule T; - Malattia linfoproliferativa legata al cromosoma X; - Disordini linfoproliferativi post-trapianto: PTLD: post-transplant lymphoproliferative disease possibile complicazione nel primo anno dopo il trapianto.

84 Linfoma di Burkitt (linfoma endemico): tumore dei ragazzi africani in aree malariche. Le cellule tumorali presentano sequenze di DNA ed esprimono Ag virali come l EBNA1. Concause sono: Traslocazione cromosomiale (8:14; 8:22, 8:2) soprattutto i cromosomi 8 e 14, determinano l attivazione dell oncogene cmyc sito sul cromosoma 8. Zone malariche. Carcinoma rinofaringeo in Cina Leucoplakia orale capelluta: lesioni della bocca, infezione opportunistica in pazienti con AIDS.

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86 cromosoma 8 cromosoma 14 traslocazione reciproca 8; 14 c-myc Ig Ig c-myc Traslocazione cromosomica 8;14 L oncogene c-myc presente sul comosoma 8 viene trasferito al cromosoma 14 in prossimità dei geni che codoficano per le catene pesanti delle immunoglobuline

87 Patofisiologia della Mononucleosi infettiva

88 EBV: Diagnosi Diagnosi clinica: febbre, linfoadenopatia, faringite per 1-4 settimane Linfocitosi del 60-70% 30% (comunque >10%) di linfociti atipici No esame colturale Esami sierologici: - test Paul Bunnel-Davidsohn: Ab eterofili (IgM) in grado di agglutinare emazie di pecora o equine (monospot test, rapido di screening) - test ELISA Probes di DNA IFI

89 Diagnosi di laboratorio La diagnosi di M.I. da EBV si basa sul quadro sintomatologico e sulla comparsa della linfocitosi nel sangue periferico. La linfocitosi è del 60-70%, con forte presenza di linfociti atipici e sui metodi sierologici (ricerca anticorpi eterofili e anticorpi contro antigeni virali. La presenza di linfociti atipici nel sangue periferico è il segnale più precoce dell infezione da EBV e si osserva già durante l insorgenza dei primi sintomi. La linfocitosi scompare durante il periodo di guarigione.

90 Diagnosi di laboratorio La ricerca degli anticorpi eterofili che si esegue mediante il test ELISA e monospot, si basa sull osservazione che l attivazione policlonale dei linfociti B provoca la produzione di IgM eterofile in grado di riconoscere l antigene di Paul Bunnel su globuli rossi, di pecora, bovino, cavallo, ma non su cellule di rene di cavia. La comparsa di questi anticorpi eterofili si osserva nella prima settimana dell infezione e persiste per alcuni mesi dopo la guarigione.

91 Diagnosi di laboratorio I test sierologici contro antigeni virali si eseguono mediante IFI su linfociti del sangue periferico del paziente o tramite ELISA. L infezione in atto da EBV è identificabile in base all aumento del titolo anticorpale contro i vari antigeni virali. La presenza di IgM contro VCA è indice di infezione in atto, mentre la presenza di IgG contro VCA è indice di una infezione in via di risoluzione o pregressa con stato di protezione verso il virus EBV. Poi si osserva la comparsa di anticorpi contro l antigene precoce EA, che persiste per molti mesi e può essere indice di cronicizzazione. Gli anticorpi anti-ebna e antigene di membrana compaiono molte settimane dopo la fase acuta dell infezione e persistono tutta la vita.

92 Diagnosi sierologica Suscettibilità Non sono presenti anticorpi verso VCA Infezione primaria IgM vs. VCA (infezione acuta in atto) IgG vs. VCA Assenti anticorpi vs. EBNA L 80% dei pazienti ha anche anticorpi vs. EA Infezione pregressa Anticorpi vs VCA Anticorpi vs. EBNA Riattivazione Anticorpi vs. EBNA Aumento di anticorpi vs. EA: suggestiva quello che si fa veramente! N.B.: La produzione di anticorpi anti EBNA richiede la lisi della cellula infetta ed indica il controllo da parte delle cellule T della malattia attiva.

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95 Prevenzione e Controllo nessun trattamento (la mononucleosi è benigna soprattutto nei bambini) nessun vaccino è disponibile. Immunità duratura dopo l infezione.

96 Cytomegalovirus (CMV) E un virus ubiquitario il 60-90% della popolazione è sieropositivo per CMV infetta l 0,5-2,5% dei neonati Il CMV è la causa più frequente di difetti congeniti. Patogeno opportunista nei pazienti immunocompromessi.

97 Betaherpesvirinae, virus linfotropico, si replica solo in cellule umane. Ha un diametro di 250nm, ha il genoma più grande (240kbp) fra gli herpesvirus. Presenta le gp B e H che svolgono un ruolo nell adesione e nella penetrazione del virus nella cellula ospite. Recettore: molecole simili a recettori per le chemochine

98 Patogenesi ed immunità del Cytomegalovirus Il virus stabilisce infezioni latenti e persistenti in macrofagi, linfociti T, cellule stromali del midollo spinale ed in altri tipi cellulari ed in organi quali il rene ed il cuore. Il virus è riattivato dall immunosoppressione e forse dalla risposta a cellule trapiantate o trasfuse.

99 La CMI è essenziale per il controllo e la risoluzione dell infezione da CMV. In molti casi il virus si replica ed è eliminato senza sintomi clinici. La replica di CMV nelle cellule epiteliali dei dotti promuove l escrezione del virus dei liquidi corporei. Il CMV è associato alle cellule infette, compresi linfociti e leucociti.

100 Epidemiologia E trasmesso per via congenita, orale, sessuale, in seguito a trasfusione e/o trapianti d organo. Il CMV può essere isolato da urine, sangue, gargarizzato, saliva, lacrime, feci, liquido seminale, liquido amniotico, secrezioni vaginali e cervicali, tessuti utilizzati per trapianti. CMV

101 La malattia da CMV è un disordine di tipo opportunistico, che causa raramente sintomi in ospiti immunocompetenti, ma è causa di grave malattia in persone immunodeficienti, quali pazienti affetti da AIDS o neonati.

102 Fonte di infezione da CMV Neonati: trasmissione transplacentare, infezioni intrauterina, secrezioni cervicali. Bambini: secrezioni corporee, latte materno, saliva, lacrime, urine. Adulti: trasmissione sessuale (sperma), trasfusioni di sangue, trapianto d organi.

103 Clinica del CMV A) Infezioni congenite B) Infezioni perinatali C) Infezione negli adulti D) Trasmissione mediante trasfusioni e trapianto E) Infezione in pazienti immunodepressi

104 A) Infezioni congenite Clinica Il CMV è la causa più frequente di malattia virale congenita. Lo 0,5-2,5% di tutti i neonati sono infettati alla nascita da CMV, altri si infettano entro il primo mese di vita. Circa il 10% mostra segni clinici di malattia come: porpora trombocitopenica, microcefalia, calcificazione intracerebrale, ittero, epatosplenomegalia, rash, sordità, ritardo mentale (malattia da inclusione di CMV). L infezione congenita da CMV è dimostrata dall isolamento del virus dalle urine del neonato durante la prima settimana di vita.

105 B) Infezioni perinatali In USA il 20% delle donne gravide ha il CMV nella cervice al termine della gravidanza e può avere riattivazione dell infezione e durante la gravidanza. La metà dei neonati nati per via naturale in presenza di cervice infetta acquisisce l infezione ed elimina il virus nella 3 a -4 a settimana di vita. Modalità d infezione anche attraverso il latte materno, trasfusioni di sangue.

106 C) Infezione negli adulti: Il CMV è una malattia a trasmissione sessuale. Il CMV nello sperma ha il titolo più alto di quello di qualsiasi altra secrezione corporea. In genere sono infezioni asintomatiche o paucisintomatiche Sindrome mononucleosica anticorpi eterofilinegativa : aumento dei linfociti T (linfocitosi atipica), però senza anticorpi eterofili (test PBD negativo).

107 D) Trasmissione mediante trasfusioni e trapianto La trasmissione di CMV attraverso trasfusioni spesso non causa una sintomatologia clinica evidente. Se sintomatica, sono similmononucleosici. Febbre, splenomegalia, e linfocitosi atipica, iniziano 3-5 settimane dopo la trasfusione. Possono essere presenti anche polmonite e una lieve epatite. Il CMV può essere trasmesso anche con il trapianto di organi (rene, midollo osseo) e l infezione da CMV si riattiva spesso nei pazienti trapiantati durante i periodi di intensa immunosoppressione.

108 D) Infezione in pazienti immunodepressi: E un patogeno opportunista. Causa malattia primaria sintomatica o ricorrente, in pazienti immunocompromesse. L infezione da CMV può causare polmonite interstiziale, retinite, encefalite, colite, esofagite, cistite emorragica CMV: retinite Il CMV è può essere responsabile del fallimento di molti trapianti di rene per replicazione virale nel trapianto dopo riattivazione o per infezione dall ospite.

109 Diagnosi di laboratorio delle infezioni da CMV Il virus può essere isolato dalla saliva,dal liquido di lavaggio broncoalveolare, dall urina e dai leucociti coltivati insieme ai fibroblasti Esame istologico: tipica è la cellula citomegalica (cellula ingrandita) che contiene una inclusione intranucleare, densa, basofila a occhio di civetta. Queste cellule sono presenti nelle urine e nei tessuti. Le cellule sono rivelabili con ematossilina/eosina e Papanicolau. Esame colturale su fibroblasti diploidi (cellule MRC-5) Effetto citopatico rilevabile dopo 4-6 settimane. L'identificazione dei corpi inclusi citomegalici in campioni di tessuto è ancora considerato il gold standard per la diagnosi di CMVD.

110 Determinazione della antigenemia: rilevazione di CMV in leucociti con anticorpi monoclonali verso l antigene p65 Coltura rapida in shell-vials di MRC-5 e immunofluorescenza diretta con anticorpi monoclonali marcati con FITC verso antigeni immediate-early (p72/p86) di CMV.

111 Uso di sonde di DNA e real time-pcr per identificare direttamente nei tessuti e nei fluidi gli antigeni virali Test sierologici (ad es. test ELISA): Titolazione degli anticorpi (le IgM sono presenti nell infezione primaria). Sieroconversione.

112 Trattamento Prevenzione e Controllo Farmaci antivirali: ganciclovir (blocca la DNA pol), valganciclovir cidofovir foscarnet Prevenzione: screening dei donatori di organi e di sangue. screening di madri sieropositive. Nessun vaccino è attualmente disponibile, ma sono allo studio preparazioni a virus vivo attenuato e a DNA.

113 HHV6 o Herpesvirus umano 6 Ha un diametro di kbp. Presenta un nucleocapside con 162 capsomeri. Simmetria icosaedrica nm d diametro Presenta il mantello Ha un ciclo replicativo lento

114 HHV-6 patogenesi ed immunità L infezione viene acquisita nel 50% dei casi in età infantile (entro il 3 anno di età), ma in età adulta l 80% della popolazione presenta anticorpi anti-hhv6. L infezione viene trasmessa attraverso la saliva e si replica facilmente nelle ghiandole salivari. I linfociti T e i monociti sono le cellule in cui il virus va in latenza e da cui può essere riattivato in seguito a stimolazione mitogenica. La risposta immune protettiva è la CMI.

115 HHV-6 Clinica L infezione primaria da HHV-6 è l exanthema subitum (o roseola infantum o sesta malattia). Presenta un rapido rialzo febbrile che dura qualche giorno, seguito da un esantema cutaneo generalizzato che inizia dalla nuca. Il virus stabilisce infezioni latenti nei linfociti T. Riattivato può provocare una sindrome mononucleosica con linfoadenopatia. Encefaliti e polmoniti in immunodepressi (trapiantati)

116 HHV-6 Diagnosi La diagnosi di laboratorio si basa sulla ricerca degli anticorpi specifici in IFI, seguita da un test in Western blotting. La ricerca genoma virale può essere eseguita mediante PCR

117 HHV-7 E stato isolato per la prima volta negli anni novanta in linfociti T provenienti da pazienti con AIDS. Virus ubiquitario, dotato di tropismo per i linfociti T, la maggior parte delle infezioni si verifica durante l infanzia.

118 HHV-8 Causa il sarcoma di Kaposi associato agli herpesvirus. Il genoma virale contiene molti geni correlati con geni umani che promuovono la crescita e prevengono l apoptosi cellulare, tra cui cicline, interleuchine, recettori per chemochine e il gene Bclr8 anti-apoptosi).

119 HHV-8 E un virus non ubiquitario. Il virus si trasmette con le stesse modalità dell HIV. Correlazione del 95-98% dei tumori analizzati positivi per il DNA di HHV-8, il 90% dei pazienti portatori di Kaposi presenta la sieroconversione nei confronti di HHV anni prima della comparsa del tumore. Uso della PCR ai fini diagnostici