OGM : organismi geneticamente modificati

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1 OGM : organismi geneticamente modificati Organismi ottenuti tramite manipolazione genica. Caratterizzati dalla presenza di modifiche nel genoma introdotte in maniera artificiale. Le tecniche di manipolazione genica consentono di trasformare singole cellule. Per ottenere organismi geneticamente modificati è necessario ricorrere a tecniche che consentono la riproduzione di un intero organismo a partire da una singola cellula. Tecniche diverse per ottenere OGM animali e vegetali

2 Diversi sistemi di espressione Batteri Lievito Baculovirus Cellule di mammifero Piante Animali transeginici

3 Caracteristica E. coli Lievito Cell. Insetto Cell. Mammifero Crescita 30 min 90 min h 24 h Terreno Semplice Semplice Complesso Complesso Costo coltura Basso Basso Alto Alto Expr. level Alto Basso-Alto Basso-Alto Basso-Medio Expr. extracell Periplasma Terreno Terreno Terreno Modifiche Postraduzionali Folding Corretto Non sempre Non sempre Si Si N-glicosilazione NO High lev Mannosio Semplice Complessa O-glicosilazione NO SI SI SI Fosforilazione NO SI SI SI Acetilazione NO SI SI SI Acilazione NO SI SI SI γ-carbossilazione NO NO NO NO

4 Piante geneticamente modificate

5 La rigenerazione nelle piante

6 Si sterilizza una foglia e si pela uno strato di epidermide Coltura di protoplasti Si pone lo strato di epidermide su un terreno contenente cellulasi e pectinasi Centrifugazione e recupero dei protoplasti Coltura dei protoplasti su cellule nutrici Coltura di callo Rigenerazione Coltura di cellule in sospensione

7 Coltura di Calli Induzione di radici su terreno ad alto rapporto auxina/citochinina Induzione di germogli su terreno a basso rapporto auxina/citochinina

8 Agrobacterium Tumefaciens 8

9 La tecnologia ricombinante nelle piante Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens è l agente del tumore del colletto o della galla, malattia che si manifesta con la formazione di neoplasie sulla pianta infettata. L instaurarsi della malattia richiede che nel genoma della pianta si inserisca il T-DNA, che corrisponde ad una parte del plasmide batterico (Ti-plasmid) detto induttore di tumore (Tumor inducing).

10 Il plasmide Ti contiene diverse informazioni Geni vir: codificano per proteine Vir, che permettono l inserzione del T-DNA nella cellula ospite Geni per Opine (sintesi e catabolismo): codificano per enzimi in grado di trasformare aminoacidi e zuccheri della cellula in composti che solo il batterio è in grado di metabolizzare grazie a specifici enzimi sempre codificati dal plasmide Ti. Geni induttori del tumore: codificano per enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali che provocano la crescita incontrollata della cellula infettata T-DNA: porzione di DNA delimitata da specifiche sequenze (bordo destro e sinistro) che corrisponde al DNA trasferito alla cellula ospite. Codifica per gli enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali e quella delle opine

11 o Contatto con bersaglio (geni chv) o Adesione superficiale (vitronectina) o Trasferimento T-DNA (geni vir) 11

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13 La conseguenza diretta dell inserzione del plasmide Ti nella cellula è la crescita di un escrescenza tumorale di tipo Crown Gall (tumore del colletto) 13

14 Un processo del tutto analogo si ha con un altra specie di batterio. L Agrobacterium Rhizogenes, infatti, mediante meccanismi molecolari analoghi a quelli utilizzati da A. Tumefaciens, genera dei tumori identificabili come formazioni piliformi in soprannumero, soprattutto a livello radicale. Si parla infatti di formazioni di tipo Hairy Roots. L A. Rhizogenes, si serve per l infezione, come A. Tumefaciens di un plasmide particolare (Ri) contenente geni deputati ai meccanismi di virulenza e di trasporto e integrazione, nel genoma della cellula ospite, della sequenza da trasferire.

15 Metaboliti indotti dal plasmide Ti Auxine e citochinine: ormoni vegetali che regolano la crescita Opine: prodotti di condensazione tra aminoacidi, chetoacidi e zuccheri

16 Il metabolismo delle opine Reazione di biosintesi della octopina Octopina: piruvato + arginina Nopalina: α-chetoglutarato + arginina Mannopine: mannosio + aminoacido

17 Sintesi di Auxina e citochinine

18 I plasmidi Ti possono essere ingegnerizzati in E.coli attraverso l inserzione del gene d interesse all interno della zona T. Questi plasmidi vengono usati per veicolare nuovi geni all interno dell ospite vegetale Agrobacterium tumefaciens DNA contenente il gene prescelto Inserimento del gene nel plasmide mediante l enzima di restrizione e la DNA-ligasi Infezione di cellule vegetali in coltura Cellula vegetale Crescita della pianta Plasmide Ti T-DNA Sito di restrizione Plasmide Ti ricombinante Il T-DNA inserito porta il nuovo gene Pianta con caratteristiche nuove

19 I SISTEMI VETTORI DERIVATI DAL PLASMIDE Ti Sistema vettore binario Sistema vettore cointegrato Gene bersaglio Gene marcatore selezionabile vegetale Confine destro Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens Confine sinistro Vettore binario Confine destro Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens Gene marcatore selezionabile vegetale Gene bersaglio Vettore cointegrato E. coli ori E. coli ori A. tumefaciens ori RICOMBINAZIONE Sequenza DNA omologa Confine sinistro Geni vir Plasmide Ti disarmato A. tumefaciens ori

20 La piastra per l inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Canamicina).

21 excisione di dischi fogliari di circa 2 mm Breve incubazione dei dischi fogliari con una coltura di Agrobatteri (5-10 x 10 6 /ml) contenenti il gene d interesse clonato in un vettore binario Co-coltivazione in terreno a basso rapporto auxina/ citochinina, in presenza di carbellicina o kanamicina Dopo la germinazione i trasformanti si trasferiscono in terreno di radicazione La piastra per l inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Carbellicina o Kanamicina)

22 Questa tecnica è ormai di routine nella trasformazione di un gran numero di dicotiledoni. L utilizzo di questa tecnica nelle monocotiledoni è possibile solo se l Agrobacterium è trattato con un essudato di ferite di piante normalmente suscettibili al batterio (dicotiledoni come i tuberi della patata). La trasformazione tramite agrobatterio tuttavia ha un efficienza molto bassa nelle monocotidedoni. Per queste piante, di grande interesse agronomico, sono stati sviluppati sistemi di trasformazione alternativi. Trattamento di protoplasti con metodiche analoghe a quelle utilizzate per le cellule in coltura - fosfato di calcio (bassa efficienza) - elettroporazione (alta efficienza) Bombardamento con microparticelle

23 BOMBARDAMENTO CON MICROPROIETTILI

24 Metodi alternativi di trasferimento genico vegetale: cannoncino balistico Promotore per cellule vegetali gene d interesse Microparticelle (1µm) di tungsteno Ap ori Precipitazione del DNA sulle microparticelle Percussore microproiettile Caricamento del cannoncino balistico Tessuto vegetale bersaglio Piastra di trattenimento Carica a salve microparticelle rivestite di DNA

25 Le particelle di tungsteno (oro, plastica) su cui è adsorbito il DNA estraneo, non interferiscono con la crescita della pianta. 25

26 Il rivestimento delle particelle sferiche (0,4-1,2 m) con DNA si ottiene mediante precipitazione con CaCl 2, spermidina o PEG (polietileneglicol). Le particelle rivestite vengono accelerate ad alta velocità (da 300 a 600 m/s) con il cannone da particelle, che impiega la polvere da sparo, l aria compressa o l elio per fornire la forza propulsiva. Le cellule situate nella traiettoria diretta del tiro vengono uccise, ma c è una zona in cui il proiettile penetra le cellule senza ucciderle. Il proiettile è in grado di penetrare almeno uno strato di tessuto (ad es: fogliare) e può quindi raggiungere il mesofilo.

27 Parametri importanti per il processo biolistico sembrano essere: o Dimensioni dei microproiettili: in funzione della parete della cell target o Massa dei microproiettili: deve poter raggiungere una energia cinetica adeguata all attraversamento delle pareti cellulari. Oro e tungsteno sembrano i più adatti anche perché chimicamente inerti e quindi non reagiscono con le componenti cellulari. o Energia cinetica dei microproiettili: in funzione dello spessore della parete e dello strato di cellule che costituisce il bersaglio. Viene regolata calibrando l accelerazione dei microproiettili. o Numero di bombardamenti: variabili in base al bersaglio. Maggiore è il numero di bombardamenti maggiori sono i danni al tessuto. 27

28 Questo metodo di trasformazione, come tutti, presenta: Vantaggi o Metodo genotipo indipendente o Può essere applicato a tutti i tessuti modificando i parametri di sparo Svantaggi o Frammentazione del DNA o Profilo di integrazione del DNA complesso o Integrazione di un gran numero di copie del transgene

29 Elettroporazione L elettroporazione a partire da protoplasti risulta essere il metodo più efficace qualora non sia possibile utilizzare la trasformazione mediata da A. Tumefaciens. Efficienza di trasformazione tra lo 0,1 e l 1% in protoplasti di riso e mais.

30 Un alta concentrazione di DNA plasmidico contenente il gene di interesse viene mescolata a una sospensione di protoplasti e sottoposti per pochi secondi ad un intenso campo elettrico dell ordine di V/cm.

31 Il trattamento provoca la formazione di pori transienti sulla membrana delle cellule e quindi la possibilità di entrata del DNA. In realtà l intensità del campo elettrico varia in base al tipo cellulare, alla specie di provenienza, alla fase del ciclo cellulare in cui si trova e quindi a tutta una serie di parametri che rendono indispensabile una valutazione del voltaggio caso per caso. Inoltre è necessaria anche una valutazione circa i sali impiegati. Molto spesso, infatti, erronee valutazioni dei parametri di reazione portano alla morte di un gran numero di cellule. L elettroporazione è per lo più impiegata in processi di trasformazione su larga scala, come la creazione di libraries genomiche. Per trasformazioni di un singolo plasmide vengono impiegate altre tecniche, come lo shock termico, a efficienza minore, ma più semplice e meno costoso.

32 Trasformazione mediata da Liposomi Il DNA viene incapsulato in un liposoma artificiale. La membrana dei liposomi si fonde con quella dei protoplasti ed il DNA può entrare nel nucleo.

33 Permeabilizzazione mediata da PEG Il polietileneglicole permette di permeabilizzare la membrana cellulare ed è quindi utilizzabile per la trasformazione diretta di protoplasti mediante semplice uptake di DNA estraneo. Microiniezione Viene utilizzato per il trasferimento genico in situ. Il DNA viene introdotto negli organi riproduttivi. Presenta come svantaggi la necessità di apparecchiature complesse e implica la trasformazione di una cellula alla volta. Laser microbeam Anche in questo caso si ha necessità di apparecchiature complesse e si può trasformare una cellula alla volta.

34 APPLICAZIONI

35 PIANTE TOLLERANTI A STRESS E SENESCENZA La maturazione dei frutti Alcuni dei geni indotti nel corso della maturazione dei frutti codificano gli enzimi cellulasi e poligalatturonasi. Si è quindi supposto di poter ritardare la maturazione interferendo con l espressione di uno o più di questi geni, creando piante transgeniche produttrici di RNA antisenso per i suddetti geni.

36 Pomodori Flavr Savr Pomodori GM attraverso l inserimento del gene codificante per Rna antisenso in grado di silenziare il gene della Poligalatturonidasi enzima responsabile della maturazione del pomodoro wild type Risultato: il processo di degradazione del frutto viene notevolmente rallentato.

37 Il regolatore della crescita della pianta è l ETILENE che inducel espressione di una serie di geni che partecipano alla maturazione e alla senescenza dei frutti. Gene esogeno ACC deaminasi NH α- Chetobutirrato

38 PIANTE TOLLERANTI STRESS E SENESCENZA Stress ossidativo Piante di tabacco trasformate con un gene della superossido dismutasi (SOD) controllato dal promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore hanno espresso l enzima acquistando la tolleranza al danno da radicali ossigenati.

39 PIANTE RESISTENTI A PARASSITI E VIRUS

40 LE PIANTE RESISTENTI AGLI INSETTI Per conferire resistenza agli insetti predatori sono state poste in opera parecchie strategie, e una di esse si basa sul gene di una protossina insetticida prodotta da un a tra le parecchie sottospecie del batterio Bacillus thuringiensis: pnos Gene marcatore sel. Vegetale (neomicina fosfo-transferasi NPT) VETTORE DI CLONAZIONE COINTEGRATO Spc r tnos gene della tossina B.t. p35s tnos Plasmide Ti Sequenza di DNA omologa Confine destro Ori di E.Coli IL GENE DELLA PROTOSSINA E STATO INTRODOTTO IN MOLTE SPECIE DI PIANTE PATATA RISO MAIS MELO MELANZANA RAVIZZONE NOCE PIOPPO ABETE MIRTILLO COTONE

41 Bacillus thuringiensis La tossina Bt

42 Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis Gli insetti ingeriscono i cristalli parasporali L ambiente alcalino dell intestino (ph ) solubilizza il cristallo a formare la protossina Specifiche proteasi digestive presenti nell intestino dell insetto tagliano la protossina generando la tossina attiva Nell uomo e negli animali non sono presenti le proteasi specifiche La tossina si inserisce nella membrana delle cellule epiteliali dell intestino creando un canale ionico Ciò determina un alterazione dei flussi ionici e quindi la lisi delle cellule epiteliali L insetto smette di mangiare, si disidrata e muore

43 Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis

44 Applicazioni delle tossine di B.thuringiensis

45 Mais Bt Bacillus Thuringiensis è un batterio che produce diversi tipi di endotossine tossiche per diversi parassiti delle piante ma non per l uomo, gli animali o altri insetti benefici.

46 Vantaggi: - L'agricoltore non ha più bisogno di ricorrere agli insetticidi, quindi l'ambiente circostante non è più esposto a dosi massicce di insetticida nocivo. Svantaggi: - Gli insetti sono avvelenati per un periodo di tempo superiore rispetto a ciò che avviene quando un agricoltore irrora una o due volte i campi. In questo modo gli insetti possono sviluppare una resistenza al veleno. - Una moltitudine di insetti rischia di essere uccisa, compresi gli insetti predatori che si nutrono di insetti dannosi per le colture.(negli Stati Uniti, dove si fa gran uso di Bt-mais, si è acceso il dibattito sugli effetti nocivi del Bt-mais sulla splendida farfalla monarca.) -Il cotone e le patate sono altri esempi di piante geneticamente modificate che producono insetticida.

47 ALTRE TECNICHE PER CONFERIRE RESISTENZA AGLI INSETTI Gli inibitori delle proteasi L inibitore dell α-amilasi Il gene batterico della colesterolo ossidasi Gene inibitore della tripsina di V. sinensis p35s tnos tnos Gene NPT pnos Confine sinistro Plasmide Ti Confine destro Ori Kan r

48 PIANTE RESISTENTI AI FUNGHI E AI BATTERI Le piante rispondono spesso all invasione di un patogeno o ad altre sollecitazioni ambientali sintetizzando un gruppo di proteine dette proteine correlate con la patogenesi (PR). Le proteine PR comprendono le chitinasi, le β-1,3-glucanasi, le proteine traumatinasimili e gli inibitori delle proteasi. Per realizzare piante resistenti ai funghi patogeni sono state attuate manipolazioni tali da consentire alle piante di esprimere costitutivamente una o più proteine PR. Cassetta del gene di resistenza all igromicina Cassetta del gene della chitinasi La realizzazione di piante di patata transgeniche in grado di esprimere attivamente il lisozima del batteriofago T4 ha dato luogo a specie resistenti al batterio patogeno del suolo Erwinia carotovora e altri microrganismi p35s Lisozima T4 tcamv Pep. Segnale della α-amilasi di orzo

49 PIANTE RESISTENTI AI VIRUS I virus delle piante causano spesso danni considerevoli alle coltivazioni e ne riducono significativamente le rese. Per tale motivo si è fatto recentemente ricorso alle tecniche di ingegneria genetica per realizzare piante transgeniche resistenti ai virus.

50 RESISTENZA AI VIRUS Geni delle proteine di rivestimento virali Sequenze antisenso di geni virali E` stato osservato che piante transgeniche, che esprimono un gene che codifica una proteina di rivestimento di un virus, risultano resistenti all'infezione da parte di quel virus Il meccanismo di resistenza si basa su una sorta di silenziamento, per cui la presenza di tale gene nel genoma delle cellule vegetali interferisce con la formazione di particelle virali quando queste infettano la cellula, interrompendo così il ciclo di replicazione del virus. Le proteine di rivestimento espresse sono quelle del virus del mosaico del tabacco (TMV), virus del mosaico del cavolfiore (CaMV), virus del mosaico giallo della zucchina ecc.

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52 Per rendere le piante transgeniche resistenti a più di un virus, si è fatto uso di vettori binari basati sul plasmide Ti che esprimevano uno o più geni delle proteine di rivestimento: Costrutti T-DNA con gene della neomicina fosfotrasferasi (NTP II) come marcatore selezionabile e gene della β glucuronidasi come gene reporter. WMV2: Gene della proteina di rivestimento del virus 2 del mosaico dell anguria. CMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico del cetriolo. ZYMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico giallo delle zucchine.

53 PIANTE RESISTENTI A ERBICIDI

54 STRATEGIE: Inibire l assunzione dell erbicida Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all erbicida così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante la presenza dell erbicida. Attenuare l attitudine della proteina bersaglio sensibile all erbicida a fissare l erbicida stesso. Conferire alle piante la capacità di inattivare metabolicamente l erbicida. PIANTE RESISTENTI AL GLIFOSATO PIANTE RESISTENTI AL BROMOSSINILE NITRILASI

55 L ebicida glifosato Il glifosato è un erbicida sistemico ad ampio spettro,non selettivo E letale per tutti i tipi di piante L erbicida è assorbito attraverso le foglie e i tessuti giovani del fusto e trasportato in tutta la pianta Le piante trattate muoiono in giorni o settimane Il Glifosato agisce inibendo l azione dell enzima vegetale EPSP(5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasi) implicato nella sintesi degli aminoacidi aromatici

56 Aminoacidi aromatici

57 Soia Rundup resistente all erbicida glifosato La Soia Runpdup è stata ottenuta attraverso l inserimento del gene per l ESPS batterico, un enzima con bassa affinità per il glifosato, che permette alle piante transgeniche di sopravvivere in presenza del glifosato. Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-gm,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.

58 Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-gm,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.

59 MIGLIORAMENTO DELLE QUALITA NUTRIZIONALI

60 La SOIA TRANSGENICA è arrichita di acidi grassi insaturi per risolvere molte patologie cardiovascolari (trombosi,arteriosclerosi ) che affliggono una larga fetta della popolazione adulta dei paesi sviluppati. Il GOLDEN RICE. Nel 1991, gruppi di ricerca di Zurigo (una squadra guidata dal Dr. Ingo Potrykus dell'istituto Federale Svizzero di Tecnologia) di Friburgo e della Germania (Beier et al.) hanno sviluppato l'idea di introdurre il beta-carotene nell'endosperma del riso, per poter tentare di convertire questa coltivazione primaria in una fonte di Vitamina A nelle zone afflitte da VAD (vitamin A deficency). I ricercatori hanno manipolato geneticamente una varietà da laboratorio di riso giapponese (Taipei 309, adatto al clima temperato dellíeuropa piuttosto che a quello delle aree tropicali) introducendo una via metabolica per convertire in Beta-carotene una parte di un precursore ormonale (geranyl geranyl difosfato) presente nel riso. Nel gennaio 2000 il gruppo di scienziati ha pubblicato i suoi risultati su "Science. Il principale finanziatore del progetto per il riso GM negli ultimi sei anni è stata la Fondazione Rockefeller.

61 Golden Rice La carenza di vitamina A causa la cecità parziale o totale a bambini ogni anno, ma i metodi tradizionali di miglioramento sono stati inefficaci nel produrre colture ad elevato livello in vitamina A. Al contrario del riso wild type che produce beta-carotene solo nei compartimenti fogliari, il riso GM presenta un aumento nella produzione di beta- carotene a livello dell endosperma (la parte commestibile del riso). Il Golden Rice è stato ottenuto attraverso la trasformazione con 2 geni: - psy (phytoene synthase) dal narciso (Narcissus pseudonarcissus) - crt1 dal batterio della soia Erwinia uredovora

62 I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l endosperma. desaturasi Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo). Via biosinteica del beta-carotene:

63 Via biosinteica del beta-carotene: I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l endosperma. Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo).

64 MODIFICA DEL CONTENUTO NUTRIZIONALE contenuto e tipo di lipidi MODIFICA DEL SAPORE E DELL ASPETTO DELLE PIANTE DA FRUTTO Inibizione degli enzimi coinvolti nelle fasi iniziali dello scolorimento dei frutti e delle verdure (es. polifenolo ossidasi, che catalizzano l ossidazione dei monofenoli e degli o-bifenoli ad o-chinoni). PIANTE COME BIOREATTORI produzione di proteine ricombinanti polimeri per uso industriale (poli-idrossialcanoati)

65 OGM ANIMALI Animali nei quali, grazie a procedimenti di ingegneria genetica, è stata modificata,aggiunta o eliminata, una porzione di patrimonio genetico allo scopo di ottenere nuove caratteristiche, non presenti in natura e non ottenibili tramite incroci

66 VANTAGGI Superamento barriere naturali di incompatibilità sessuale tra specie Specificità di mutazione Velocità di comparsa della mutazione

67 Trasformazione Animale Per produrre animali geneticamente modificati si possono utilizzare: Oociti fecondati inserendo il DNA estraneo nel pronucleo maschile. Cellule staminali embrionali (in particolare ricavate dalla cavità della blastocisti). 67

68 Microiniezione dell uovo fecondato Negli ovociti prelevati da topine gravide si inietta il gene d interesse, nel pronucleo maschile (è quello di dimensioni maggiori) quando l embrione arriva allo stato di blastula, viene impiantato in una topina pseudo-gravida (ottenuta tramite preparazione ormonale)

69 La transgenesi avviene mediante microiniezione di un costrutto contenente il gene che codifica per la proteina di interesse in cellule uovo appena fecondate in vitro o in vivo (in questo caso le uova vengono recuperate mediante lavaggio uterino. Generalmente vengono iniettati con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA contenenti circa copie del gene di interesse. Il costrutto viene posto sotto un promotore specifico per il tessuto in cui si vuole ottenere l espressione, ad esempio sotto il promotore per le caseine nel caso in cui si vuole espressione nella ghiandola mammaria e conseguente purificazione del prodotto di interesse nel latte. Gli oociti così ingegnerizzati vengono poi trapiantati in femmine riceventi.

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72 Riconoscimento di una progenie transgenica insieme al gene d interesse si inserisce un gene per il colore del pelo, così riconosco subito tra la progenie il topo transgenico Prelievo di un campione di tessuto per fare un analisi Southern Blotting (per vedere in quante copie si è inserito il gene) Si definisce fondatore (founder) l individuo che porta il transgene anche nella linea germinale

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74 Sviluppo dello zigote fino allo stadio di blastocisti

75 Preparazione di cellule staminali embrionali (ES) Si prendono delle cellule staminali embrionali dalla blastocisti e si mettono su piastra con un feeder layer

76 Le cellule staminali vengono manipolate geneticamente e poi reinserite in altre blastocisti accettrici prese da altre topine gravide. Se le blastocisti attecchiscono e la gravidanza prosegue, nasceranno topi chimerici: avranno sia cellule normali che cellule transgeniche

77 Ogni cellula della blastocisti è il precursore di un tessuto del topo Se l inserzione è avvenuta nelle cellule della linea germinale, la progenie successiva porterà il transgene. Questo metodo permette o un knock-out specifico di un gene, oppure una sostituzione di un gene con ricombinazione omologa. La blastula si riorganizza bene dopo la colonizzazione delle blastocisti transgeniche e il topo non presenterà squilibri.

78 Trasferimento nucleare Clonaggio Oocita privato del pronucleo femminile Prelievo di un nucleo diploide da una cellula adulta Inserimento del nucleo nell oocita enucelato e stimolazione L oocita inizia lo sviluppo embrionale protando alla formazione di un individuo identico al donatore del nucleo Non tutte le cellule somatiche sono in grado di originare individui clonati (le migliori sono: cellule epiteliali, cellule staminali, cellule germinali, cellule embrio-staminali o ES)

79 Trasferimento nucleare Clonaggio

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81 Trasferimento nucleare - OGM

82 Cloning terapeutico

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85 Terapia genica

86 TOPI KNOCK-OUT

87 Formazione di cellule staminali embrionali portatrici di una mutazione (knock-out) Nel costrutto si utilizzano un gene di resistenza alla neomicina ed un gene di sensibilizzazione al ganciclovir. Questo garantisce una doppia possibilità di selezione, positiva e negativa, che assicuri l avvenuta ricombinazione omologa.

88 Questo sistema detto a doppia selezione consiste in: o selezione positiva: sopravvivono solo le cellule che posseggono il gene di resistenza. o selezione negativa: sopravvivono solo le cellule che non posseggono il gene di sensibilizzazione.

89 Procedura generale per produrre topi knock-out gene specifici I topi chimerici ottenuti vengono analizzati per individuare quali tra essi posseggono il transgene nella linea germinale. L analisi viene condotta mediante screening della progenie. Qualora il chimerico ha il transgene nella linea germinale la progenie sarà costituita interamente da topi transgenici. 89

90 Molecular Farming La produzione di proteine ricombinanti è effettuata in molte specie animali, tra cui: mucche, capre, conigli, pecore e polli. L uso di promotori tessuto-specifici garantisce l espressione della proteina transgenica nei fluidi corporei (latte,uova,sangue, urina e fluidi seminali) dai quali è possibile purificarla

91 Le ghiandole mammarie sono attualmente i bioreattori più efficienti sia per la grande quantità di latte prodotto, che l elevata espressione della proteina transgenica (1g/L) Più di 20 proteine sono state prodotte fino ad ora. Ad es.: anticorpi umani monoclonali, attivatore del plasminogeno tissutale, ecc.

92 Produzione di proteine ricombinanti nel latte Inserire il gene di interesse sotto il promotore del gene della beta-lattoglobulina Prelevare cellule uovo fecondate dalla capra Inserire il costrutto nel pronucleo di una cellula uovo Impiantare in una madre psudogravida e selezione della progenie GM Estrazione della proteina direttamente dal latte

93 Proteine terapeutiche prodotte in latte di animali transgenici Proteine espresse Mucca Origine del transgene Promotore Livello di esp (g/l) Lattoferrina cdna Alpha-S1 caseina bovina / Capra Anticorpi monoclonali Genomico beta-caseina caprina 10 tpa cdna beta-caseina caprina 6 Maiale Fattore VIII Proteina C cdna cdna Proteina acida di siero di latte murina (WAP) 3 1 Pecora Alpha-1 antitripsina Minigene beta-lattoglobulina ovina 35 Fattore IX cdna beta-lattoglobulina ovina 0,005 Fibrinogeno genomico beta-lattoglobulina ovina 5 Coniglio Calcitonina Proteina di fusione beta-lattoglobulina ovina 2,1 SOD cdna WAP murina 2,9 Eritropoietina cdna WAP di coniglio 0,05 Ormone della crescita Genomico WAP murina 0,05 IL-2 genomico beta-caseina di coniglio 0,0005

94 Produzione di proteine ricombinanti nell uovo L uovo fecondato nel magmun rappresenta un potenziale stadio d intervento per il trasferimento genico. Sfortunatamente i pronuclei non possono essere subito visualizzati parché il tuorlo e l opacità della membrana vitellina interferiscono con l illuminazione

95 La manipolazione viene effettuata sull uovo appena deposto. Aprendo una fenditura sulla superficie del guscio si ha accesso alla blastocisti che può così essere manipolata (trasferimento di DNA o inserimento di cellule ES precedentemente manipolate). L apertura sul guscio viene sigillata e l uovo è incubato per permettere lo sviluppo dell embrione, generando così individui chimerici.