Incorporazione in proteine di aminoacidi non naturali

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Leonora Farina
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1 Incorporazione in proteine di aminoacidi non naturali

2 La catena laterale dei 20 amminoacidi naturali manca di gruppi elettrofili non permette reazioni chimiche precise

3 Incorporazione di aminoacidi non naturali Sonde fluorescenti modifiche post traduzionali marcatura per fotoaffinità biotina chelanti per metalli

4 Metodi per incorporare aminoacidi Selettiva modifica chimica di un amminoacido non naturali aa* aa* ome si può modificare selettivamente un aamminoacido?

5 Methods for Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Sintesi chimica limitata a residui ligazione del frammento H R 1 SR' H 2 HS H H R 1 H 2 S H H R 1 HS H H Dawson, P. E.; Muir, T. W.; lark-lewis, I.; Kent, S. B. H. Science 1997, 266, Modifica Post-traduzionale tramite reazioni chimiche o enzimatiche

6 Metodi per Incorporare Aminoacidi modificati in Proteine In vivo crescita in un mezzo che contenga l aminoacido modificato In vitro modifica di tra già acilati lisina/cisteina alterazione dell anticodone 4 basi o 5 basi inserimento di nucleotidi modificati.. H H H H H H P P H P P H H H H P P H P P H H - pair iso-iso pair

7 Misacylation del tras cysteine-tra ys alanine-tra ys hapeville, F.; Lipmann, F.; von Ehrenstein,.; Weisblum, B.; Ray, W. J.; Benzer, S. Proc. atl. Acad. Sci. 1962, 48, von Ehrenstein,.; Weisblum, B.; Benzer, S. Proc. atl. Acad. Sci. 1963, 49,

8 Incorporazione di aminoacidi modificati mediante l uso di tra soppressori nonsenso

9 Sintesi proteica DA tra aa~amp mra Aminoacyl-tRA synthetase (aars) R H 2 peptide chain H 2 H 2 R EF-Tu acylated tra mra ribosome

10 odice genetico

11 Traduzione ATP TP elongation factor Tu aminoacyl tra synthetase

12 Terminazione Amber (UA), pal(ua), chre(uaa)

13 Yeast tra Phe e RF1 (Release Factor) umano Bertram,.; Innes, S.; Minella,.; Richardson, J. P.; Stansfield, I. Microbiology 2001, 147,

14 tras Soppressori

15 onsense Mutation nonsense mutation proteina troncata e non funzionale

16 Prima evidenza della possibilità di usare Soppressori onsenso per inserire in una catena polipeptidica aminoacidi modificati Introduzione della diazirina in un sito che portava la mutazione amber Mediante modifica chimica del suppressor tra acilato F H H 2 Shih, L. B.; Bayley, H. Anal. Biochem. 1985, 144,

17 In vitro P.. Schultz et al. Science 1989, 244, 182

18 Misacylation of Suppressor tras pdpa-amino acid chemical suppressor tra(-a) aminoacyl tra synthetase in vivo suppressor tra amino acid

19 In vitro and in vivo Systems to Produce Protein + in vitro in vivo translational mixture Xenopus oocyte Thorson, J. S.; ornish, V. W.; Barrett, J. E.; load, S. T.; Yano, T.; Schultz, P.. Methods Mol. Biol. 1998, 77, Dougherty, D. A. urr. pin. hem. Biol. 2000, 4,

20 Incorporazione di aminoacidi nonnaturali in vivo

21 In Vivo Misacylation L aminoacido modificato non deve essere tossico e deve poter entrare nella cellula Il Suppressor tra deve essere acilato solo dalla sintetasi eterologa (orthogonal tra/synthetase pair) Saks, M. E. Proc. atl. Acad. Sci. 2001, 98,

22 li amminoacidi vengono attivati mediante adenilazione La formazione dell amminoaciladenilato è catalizzata dall amminoacil-trasintetasi Amminoacil AMP (amminoaciladenilato) ATP+amminoacido+tRA PPi + tra AMP + amminoacil-tra Amminoacil-tRA+ AMP+ PPi 2Pi

23 Esistono due classi tra sintetasi che si differenziano per: Riconoscimento dell anticodone Enzimi di classe II non interagiscono con l anticodone Sito di amminoacilazione Enzimi di lasse I caricano l amminoacido sull H 2 Struttura

24 Le sintetasi riconoscono le anse dell anticodon e gli steli accettori delle molecole di tra

25 Le due classi di tra sintetasi legano lati diversi del tra

26 Alcune tra sintetasi hanno il sito per la correzione di bozze

27 onsense Suppression Methodology mutazione non senso in un tra specifico per un determinato aminoacido modificato amminoacil sintetasi in grado di riconoscere e attivare l amminoacido modificato Site-directed mutagenesis inserimento del codone di stop nella posizione in cui si vuole inserire la mutazione transcription translation oren,. J.; Anthony-ahill, S. J.; riffith, M..; Schultz, P.. Science 1989, 244,

28 Ricerca di una coppia tra /sintetasi in grado incorporare aminoacidi modificati Le t-ra sintetasi e tra degli eucarioti e degli archea sono simili tra loro e diverse da quelle di coli Tentativi di Produrre di tra soppressori / sintetasi a partire da lutamil tra /sintetasi di Ecoli non hanno portato a risultati positivi

29 Selezione del tra Soppressore on deve essere acilato da sintetasi endogene Unnatural Amino acid Incorporated Into protein reacylation none

30 Selezione dei tra Suppressori glycyl-tra sintetasi non ha attività di editing Fersht, A. R.; Dingwall,. Biochemistry 1979, 18, Mutagenesi nello stelo accettore per eliminare il riconoscimento con la E. coli ly sintetasi Bain, J. D.; Diala, E. S.; labe,..; Wacker, D. A.; Lyttle, M. H.; Dix, T. A.; hamberlin, A. R. Biochemistry 1991, 30,

31 tra soppressore di lievito da usare in Ecoli on è riconosciuto dalla sintetasi Phe di E. coli Bassa efficienza come soppressore Bassa affinità per il ribosoma E. coli aminoacidi polari non sono incorporati load, S. T.; Liu, D. R.; Froland, W. A.; Schultz, P.. hem. & Biol. 1996, 3, Ellman, J.; Mendel, D.; Anthony-ahill, S.; oren,. J.; Schultz, P.. Methods in Enzymology 1991, 202,

32 Sintetasi e tra M. jannaschii A U A U U A A A 5' p U A A A U A U 3' A H A T A A U U U A U U A M. jannaschii tra Tyr è ortogonale alla sintetasi di E. coli M. jannaschii TyrRS è ortogonale a E. coli tras M. jannaschii TyrRS non ha interazione con l anticodone M. jannaschii TyrRS non ha attività di editing

33 Selezione per tra/sintetasi M. jannaschii E. coli negative selection survivors orthogonal tras non-functional tras Toxic barnase tra library endogenous positive selection synthetase orthogonal tra/ synthetase pair ampicillin b-lactamase tra library endogenous Wang, L.; Schultz, P.. hem. & Biol. 2001, 8,

35 Evoluzione diretta di Mj TyrRS per selezionare trasintetasi in grado di identificare diversi aa modificati

36 rescono le colonie che contengono le sintetasi capaci di caricare su tra mut UA aa naturali e modificati

37 Expanded enetic ode in E. coli H 2 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H I 3 H H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H 2 - S H 2 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H 2 H B(H) 2 F 3 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H

38 Incorporazione del fotocrosslinker pbenzilfenilalanina (pbpa)

39 Produzione di proteine glicosilate in E coli p-acetilfenilalanina

41 MMetodi per ottimizzare la produzione d di proteine con aminoacidi modificati in E coli

42 ptimizing protein yields in E. coli E. coli prolyl-tra promoter and terminator for the amber suppressor tra Mutated form of the glns promoter for the synthetase D286R substitution in the synthetase gene Multiple copies of the suppressor tra gene Yield of adiponectin (lu123bpa) mutant: 0.4g/L Ryu & Schultz at. Methods 3, 263 (2006)

43 Mj tra expression cassette E. coli prolyl tras have 1-72 pair, which is major identity determinant of MjtRA Important context for the precise tra processing prok tra is most frequently used in E. coli FIS enhances tra transcription A RAse T, PH etc RAse P 5' A U U U U U A A A A A A U A A U 3' A A A U U A A A A U U A A A RAse E RAse III U A A A U U A U U U U U U U U A A U JYTR Terminator

44 espressione di MjtRA aars promoter glns glns glns glns glns glns tra promoter - lpp prok prok prok prok tra copy # JYTR

45 Mutant glns promoter enhances the synthetase expression WT Mutant -35 region -10 region +1 AAAAAATAAATTTATTTTATAAATATATTATATT AAAAAATAAATTTATTTT-TAATATATATTATATT WT Mutant BpaRS

46 Asp286Arg (D286R) aumenta tra(ua) binding affinity TyrRS (WT) tra Tyr (WT) TyrRS (WT) tra Tyr (UA) TyrRS (D286R) tra Tyr (UA) His283 Asp Asp Arg Phe261 K m = 0.35 mm k cat = 0.19 s -1 k cat /K m (relative) = 1 K m = 39 mm k cat = s -1 k cat /K m (relative) = K m = 0.68 mm k cat = s -1 k cat /K m (relative) = 0.22 Kobayashi et. al. at. Struct. Biol. 10, 425 (2003)

47 b-alactosidase assay for suppression efficiency TA arabad promoter leader lacz prok prok + D286R prok + glns prok + glns + D286R + 3TR + 6TR

48 Incorporazione differenti aminoacidi modificati 3 I H 2 2 H H 2 2 H H 2 2 H H 2 2 H Bpa pacphe pazphe piphe

50 Strategy to identify the YebF transporter

51 Unnatural protein medicinal chemistry

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