DIAGNOSI DI E. COLI CORSO ECM PARASSITI, CLOSTRIDI, ALIMENTAZIONE: CORRELAZIONI, PROFILASSI, TERAPIE. Patrizia Nebbia

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1 DIAGNOSI DI E. COLI Patrizia Nebbia CORSO ECM PARASSITI, CLOSTRIDI, ALIMENTAZIONE: CORRELAZIONI, PROFILASSI, TERAPIE 17 GIUGNO 2010 Centro Polifunzionale G. Arpino Largo della Resistenza, 21 BRA (CN)

2 1893 THE IMPORTANCE TO THE SURGEON OF FAMILIARITY WITH THE BACILLUS COLI COMMUNIS. BY ROSWELL PARK, M.D., OF BUFFALO. PROFESSOR OF SURGERY IN THE UNIVERSITY OF BUFFALO. The bacterium coli commune was first described, in I885, by Escherich and was at first regarded as a saprophyte and intestinal parasite. In I887 Hueppe found it in the stools of patients suffering from cholerine. Its positive pathogenic properties were first made known by Laruelle

3 The Journal of Immunology, 1947, 57, Copyright 1947 by The American Association of Immunologists, Inc. The Serology of the Coli Group F. Kauffmann From the State Serum Institute, Copenhagen; Director: J. Ørskov, M.D.

4 Caratterizzazione Antigenica Struttura antigenica usata per la classificazione su base sierologica Antigeni LPS somatici (O) 173 differenti tipi antigenici Antigeni capsulari (K) 80 differenti tipi antigenici Antigeni fimbriali (F) 56 differenti tipi antigenici (H)

5 1955 Paper No 2031 the Journal Series of the Pennsylvania Agricultural Experiment Station, University Park, Pa.

6 varianti non patogene batteri anaerobi facoltativi predominanti isolati dalle feci commensali sintesi cofattori responsabili di resistenza alla colonizzazione varianti patogene numerose specie ospite organi target: intestino, meningi, rene Perché?

7 Esistono diversi ceppi di E. coli che differiscono per potenziale patogeno dipende dal tipo di geni specifici di virulenza presenti nel genoma Capacità di codificare per fattori di virulenza Capacità di scambi genetici coniugazione batteriofagi isole di patogenicità frammenti di DNA codificanti VF es. E. coli 0157:H7

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9 bassa virulenza Infezioni opportuniste alta virulenza Infezione conclamata

10 PATOTIPI Combinazioni di particolari geni di virulenza determinano specifici patotipi di E. coli Ciascun patotipo tende a causare una varietà limitata di patologie affezioni intestinali affezioni extraintestinali

11 AFFEZIONI INTESTINALI Ceppi enterotossici ETEC Ceppi enteropatogeni EPEC Ceppi enteroemorragici EHEC Ceppi necrotossigeni NTEC Ceppi enteroaggregativi EAggEC Ceppi enteroinvasivi EIEC

12 AFFEZIONI EXTRA-INTESTINALI EXPEC Numerosi ceppi INFEZIONI URINARIE Ceppi uropatogeni UPEC INFEZIONI MENINGI/SEPSI MNEC APEC

13 Associazione fra patotipi e forme enteriche TIPO ACRONIMO SITO SEGNI E. coli enterotossici ETEC I. tenue Diarrea neonatale E. coli enteropatogeni EPEC I. tenue e crasso E. coli enteroemorragici EHEC I. crasso E. coli necrotossigeni NTEC I. tenue Diarrea Colite emorragica nel bovino Diarrea in bovino e suino

14 SCHEMA PATOGENETICO Colonizzazione intestino Elusione dalle difese dell ospite replicazione Danneggiamento tessutale

15 SCHEMA PATOGENETICO DEI CEPPI DIARROGENICI Antigeni fimbriali specifici vs piccolo intestino Produzione enterotossine (ETEC) Invasione (EIEC) Adesione (EPEC ed EHEC)

16 CEPPI ENTEROTOSSICI ETEC = ENTERO TOXIGENIC ESCHERICHIA COLI 1. diarrea neonatale nei mammiferi 1. Diarrea acuta, acquosa a volte seguita da batteriemia 2. Feci biancastre, gialle, grigie 2. diarrea grave nell uomo 3. In associazione con rotavirus, coronavirus, BVD, cryptosporidium, salmonella Producono adesine fimbriali ed enterotossine

17 CEPPI ENTEROTOSSICI ETEC = ENTERO TOXIGENIC ESCHERICHIA COLI FIMBRIE F4 (K88) suini F5 (K99) O8, O141, ecc suini, bovini, pecore F41 bovini, suini O8, O9, O120, ecc O9, O101, ecc Recettori specifici sulle cellule intestinali Frequentemente in associazione a F5

18 CEPPI ENTEROTOSSICI ETEC, ENTERO TOXIGENIC ESCHERICHIA COLI TOSSINE tox. termolabile ceppi umani e suini LT-1 LT-2 tox. Termostabile ceppi umani, suini, bovini STa STb

19 CEPPI ENTEROPATOGENI EPEC ENTERO PHATOGENIC ESCHERICHIA COLI 1. diarrea e malassorbimento in animali e uomo 2. diarrea cronica, mucosa 3. no elaborazione shiga-tossine 4. tipica lesione (attaching and effacing, A/E) Ridotto assorbimento intestinale Alterazioni equilibrio osmotico DIARREA

20 CEPPI ENTEROPATOGENI EPEC ENTERO PHATOGENIC ESCHERICHIA COLI la patogenicità di questi ceppi è legata a un fattore di adesività localizzata che determina la distruzione dei microvilli delle cellule intestinali L intimina crea uno stretto contatto batterio/cellula ospite

21 CEPPI ENTEROEMORRAGICI EHEC, ENTERO HAEMORRAGIC ESCHERICHIA COLI Principale rappresentante: O157:H7 riconosciuto responsabile di forme enteriche nell uomo (1982 ) Diarrea, colite emorragica Sindrome uremico-emolitica In seguito altri VTEC Bovino asintomatico serbatoio per l uomo, bassa prevalenza escrezione fecale intermittente, contaminazione alla macellazione delle carcasse, consumo prodotti carnei, latte, vegetali, acqua cont.

22 CEPPI ENTEROEMORRAGICI EHEC, ENTERO HAEMORRAGIC ESCHERICHIA COLI Nella maggior parte dei ceppi il meccanismo patogenetico è simile a quello degli EPEC producono potenti citossine Shigatossine o Verotossine/ verocitotossine STx o VT

23 CEPPI ENTEROEMORRAGICI EHEC, ENTERO HAEMORRAGIC ESCHERICHIA COLI STEC/VTEC Ceppi produttori di tossine appartenenti alla famiglia delle shigatossine (Stx/VT) EHEC Ceppi produttori di Stx e EAE

24 CEPPI ENTEROEMORRAGICI EHEC, ENTERO HAEMORRAGIC ESCHERICHIA COLI Definizione di tipo clinico: EHEC STx EAE E-hly VTEC VTx

25 STEC Principali reservoires bovini, pecore, cervi, capre Nel vitello (sotto i 30 gg di eta ) diarrea acquosa o emorragica Forme subcliniche Piu del 70% dei ceppi sono EAE+ Frequentemente produttori di emolisina Es. O26, O111 Tutti patogeni per l uomo? Fattori di virulenza Emolisina, fattori di colonizzazione Non presenti in tutti i ceppi

26 CEPPI ENTEROINVASIVI EIEC, ENTERO INVASIVE ESCHERICHIA COLI 1. Relativamente pochi sierogruppi 1. O 28, O112, O115, ecc. 2. Sono immobili e non fermentano il lattosio 3. Provocano diarrea 4. Si moltiplicano nelle cellule epiteliali, distruggendole e causando la desquamazione di pezzi di mucosa 5. uomo

27 CEPPI ENTEROADESIVI EAEC, ENTERO ADHERENT ESCHERICHIA COLI 1. Aderiscono in vitro a una particolare linea cellulare (Hep-2) 2. Non sembra che elaborino tossine, né che siano invasivi 3. uomo

28 CEPPI UROPATOGENI UPEC Sottogruppo dei ceppi patogeni extraintestinali Infezione del tratto urinario con sintomatologia (UTI) Colonizzano le vie urinarie (uretra) per via ascendente dall intestino (infezioni endogene), risalgono fino alla vescica e possono migrare al rene o alla prostata Ben distinti dai commensali x presenza di VFs

29 E LA DIAGNOSI?

30 FORME ENTERICHE Anamnesi Sintomi Diarrea Altro Lesioni anatomo-patologiche

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32 CAMPIONE Isolamento ed identificazione da diversi materiali biologici Dopo la morte dell ospite diffusione nei tessuti sangue cardiaco midollo osseo parenchimi

33 Esame Colturale Morfologia Bastoncelli Gram - Coltura Nutrient Agar, blood agar, terreni selettivi Caratteri biochimici Acidificazione totale Produzione di gas

34 Caratterizzazione profilo antigene Ceppi diarrogenici Ceppi commensali

35 Caratterizzazione Antigenica O139 : K82 : H2 LPS polisac. flagelli O SIEROGRUPPO H SIEROTIPO

36 Caratterizzazione Antigenica O LPS ETEC STEC 8,9,20,64,101 5,8,20,26,103 EXPEC 8,9,15,20

37 Caratterizzazione antigenica H flagelli PCR-RFLP agglutinazione Gene flic

38 Identificazione fenotipica Effetto citopatico O157 H7 Effetti citotossici di cnf1 su cellule VERO Effetti citotossici di eae/cif su cellule HELA

39 Identificazione molecolare identificazione del gene Pho-A Permette di discriminare E. coli da altri batteri enterici M M: 100 bp DNA Ladder Plus; linee 1,3,4,6-10: E. coli; linea 2: P. aeuroginosa; linea 5: P. mirabilis; linea 11: controllo negativo PCR

40 Caratterizzazione molecolare identificazione di geni codificanti VFs: tossine Es. enterotossine ETEC VF O157 fimbrie e adesine Es. K99 (F5), eae, Tir, F41

41 ETEC ST K99 F41 F17 EPEC - EAE VTEC/EHEC VT EAE E-hly

42 Caratterizzazione molecolare identificazione di geni codificanti VFs M Multiplex PCR per la ricerca di geni di virulenza su ceppi di E. coli M: 100 bp DNA Ladder Plus; linea 1: SLT1, SLT2, eae, CNF1; linea 2: STI, STII, CNF2; linea 3: EHEC; linea 4: EPEC; linea 5: ETEC; linea 6: NTEC1, linea 7: controllo negativo. Tossine/adesine LT STI STII eae VT1 VT2 CNF1 CNF2 Amplicone (bp)

43 Tipizzazione Molecolare REP- PCR BOX-PCR ERIC-PCR

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45 Alfredo Caprioli Laboratorio Comunitario e Nazionale di Referenza per E.coli Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanità