SVILUPPO E APPLICAZIONE DI UN PROTOCOLLO INNOVATIVO PER LA RICERCA DI ESCHERICHIA COLI VEROCITOTOSSICI IN CAMPIONI DI LATTE E FILTRI DI MUNGITRICE

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1 SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN IGIENE E TECNOLOGIA DEL LATTE E DERIVATI Dipartimento di Medicina Veterinaria SVILUPPO E APPLICAZIONE DI UN PROTOCOLLO INNOVATIVO PER LA RICERCA DI ESCHERICHIA COLI VEROCITOTOSSICI IN CAMPIONI DI LATTE E FILTRI DI MUNGITRICE Lodi 09 Ottobre 2017

2 Escherichia coli Batterio Gran negativo anaerobio facoltativo Ospite comune del tratto gatrointestinale di umani e animali Alcuni ceppi sono importanti agenti patogeni I ceppi patogeni (patotipi) sono divisi in due ampie categorie: CEPPI CHE CAUSANO PATOLOGIE DEL TRATTO INTESTINALE: Escherichia coli enterotossigeni Escherichia coli enteropatogeni Escherichia coli produttori di verocitotossine (VTEC/STEC) ed enteroemorragici (EHEC) Escherichia coli enteroaggreganti Escherichia coli diffusamente aderenti Escherichia coli enteroinvasivi CEPPI CHE CAUSANO PATOLOGIE IN SEDE EXTRA-INTESTINALE: Escherichia coli uropatogeni Escherichia coli associati a meningiti

3 Escherichia coli produttori di verocitotossine (VTEC) ed enteroemorragici (EHEC) E. COLI PODUTTORI DI VEROCITOTOSSINE (VTEC): Tutti i ceppi in grado di produrre verocitotossine (VT1, VT2, VT2c, e VT2d). E. COLI ENTEROEMORRAGICI (EHEC): Tutti i ceppi in grado di produrre verocitotossine e in possesso di ulteriori fattori di patogenicità quali le intimine. I ceppi enteroemorragici sono in grado di causare colite emorragica (HC) che in alcuni casi (circa il 10%) evolve in sindrome emolitico-uremica (HUS). Rappresentano una seria preoccupazione per la salute pubblica.

4 Colite emorragica La colite emorragica è caratterizzata dalla comparsa improvvisa di crampi addominali intensi, seguiti a poche ore dalla comparsa di diarrea acquosa e profusa che evolve rapidamente in diarrea emorragica con espulsione di feci ricche di sangue non digerito, sintomatologia simile a quella presente in caso di emorragia intestinale.

5 Sindrome emolitico-uremica (HUS) E una grave complicazione della colite emorragica L'incidenza della HUS nei focolai d infezione da EHEC del sierotipo O157:H7 è in genere del 7-10%. La gravità della HUS varia da una forma clinicamente lieve a una malattia grave e fulminante con il coinvolgimento di più organi tra cui il tratto gastrointestinale, il cuore, i polmoni, il pancreas e il sistema nervoso centrale. La sindrome emolitico-uremica è definita da tre caratteristiche: Insufficienza renale acuta Trombocitopenia Anemia emolitica microangiopatica.

6 Ceppi EHEC e antibiotico-resistenza Il trattamento delle infezioni da EHEC con antibiotici è generalmente controindicato. Tuttavia, numerosi studi sono stati condotti per valutare i modelli di resistenza agli antibiotici dei ceppi EHEC. I dati ottenuti hanno dimostrato che l antibiotico-resistenza è comune sia nel sierotipo O157:H7 sia negli altri sierotipi EHEC. È comune la resistenza multipla a principi antibiotici quali streptomicina, sulfamidici, e tetraciclina e ci sono evidenze che la resistenza possa essere crescente nel tempo. I risultati di studi piuttosto recenti hanno dimostrato che la resistenza agli antibiotici varia tra fagotipi e tra differenti linee cellulari batteriche.

7 Epidemiologia In Europa, nel 2009, un totale di 242 pazienti infettati da EHEC ha sviluppato la sindrome emolitico-uremica. Ogni anno negli USA: 73,000 casi d infezione e 600 morti. I dati forniti dall ECDC sulle infezioni alimentari nel periodo hanno evidenziato un trend in leggero aumento del numero d infezioni dal 2007.

8 Più della metà (51,7%) delle segnalazioni d infezioni da EHEC nell uomo sono state associate al sierogruppo O157 e il 5,4% al sierogruppo O26. Nel corso del periodo , più di un terzo dei casi di malattia da EHEC è stato attribuito a sierotipi non-o157, con il 20% a causa di cinque sierogruppi: O26, O103, O91, O145 e O111. Fatta eccezione per l O91, questi sierogruppi rappresentato la maggior parte dei sierogruppi non-o157 associati alla HUS. Sierogruppo Casi di malattia da VTEC Casi di SEU N % N % O ,3 O , ,5 O ,5 20 4,4 O ,9 1 0,2 O , O , O ,4 0 0 O ,8 1 0,2 O ,7 2 0,7 Altri ,9 22 4,9 Totale

9 I dati epidemiologici mostrano una stagionalità dell infezione, che si manifesta con maggiore frequenza nei mesi caldi dell anno, che vanno da maggio fino a ottobre.

10 Germania 2011 Nel 2011, in Germania, importante focolaio d infezione da EHEC a causa dal sierotipo O104:H4 (4321 casi d infezione con 852 casi di sindrome emolitico-uremica che ha causato 58 decessi). Il ceppo O104:H4 è risultato essere in possesso dei geni che codificano per le verocitotossine (stx) ma non di quelli che codificano per le intimine (eae). PRIMA DEL 2011: Campione positivo per stx e eae escluso dal consumo DOPO IL 2011: Campione positivo solo per stx escluso dal consumo Tuttavia, la positività solo per stx non è sinonimo di malattia (Norman et al., 2012).

11 Fonti d infezione per l uomo I bovini rappresentano il principale reservoir di questo patogeno Gli alimenti di origine bovina, soprattutto la carne macinata cruda e il latte non pastorizzato, costituiscono le principali fonti d infezione Altre possibili fonti d infezione, seppur sporadiche, comprendono: lattuga, germogli di erba medica, germogli di ravanello e di soia, spinaci, sidro di mele, il consumo o l'uso ricreativo di acqua non potabile, il contatto diretto con bovini o loro escrementi, la partecipazione a fiere zootecniche, l uso ricreativo dei pascoli La trasmissione secondaria da parte di persone infette, per esempio, all'interno delle famiglie, degli asili e degli ospedali è ben documentata

12 LATTE E DERIVATI COME FONTE D INFEZIONE Non-O157 O157 Latte crudo 10% 12,5% Prodotti lattierocaseari 6,2% 9,2% ESCREZIONE FECALE ESCREZIONE INTRA- MAMMARIA CONTAMINAZIONE DEL LATTE

13 Prevenzione della contaminazione del latte La riduzione della contaminazione fecale del latte durante la mungitura è la chiave di volta per la gestione di questi patogeni in allevamento. I ceppi VTEC possono, potenzialmente, persistere nell impianto di mungitura nel caso in cui quest ultimo non sia adeguatamente pulito e/o sottoposto alla necessaria manutenzione. L escrezione intra-mammaria del ceppi VTEC si previene riducendo l incidenza delle mastiti da E. coli in allevamento.

14 VTEC e produzione dei formaggi Anche se le tecnologie di lavorazione cui è sottoposto il latte durante la caseificazione possono creare condizioni fisico-chimiche non adatte per la moltiplicazione di E. coli, esse possono non causarne l'inattivazione. La sopravvivenza del batterio nel prodotto finito può rappresentare un problema. Alcuni formaggi, in particolare quelli a pasta molle o semi-molle, possono essere soggetti a contaminazione superficiale da parte di batteri durante il periodo di maturazione. Per questo motivo, così com è importante l accurato controllo delle condizioni igieniche durante il processo di caseificazione, è altresì importante il controllo di tali condizioni anche durante la maturazione dei formaggi e l eventuale successiva stagionatura.

15 Legislazione LATTE CRUDO: Circolare 13/SAN del 13 aprile 2007 Regione Lombardia. Tenore di germi a 30 C (per ml) inferiore o uguale a UFC; Contenuto di cellule somatiche (per ml) inferiore o uguale a UFC; Assenza di Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter termotolleranti, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli O157 e loro tossine; Stafilococchi coagulasi positivi < 100 UFC in 1ml; Residui di sostanze inibenti: non superiore ai limiti fissati negli allegati I e II del Regolamento CEE n. 2377/90. FORMAGGI: Reg CE. 1441/2007. Listeria monocytogenes: assente in 25 gr. (al momento dell uscita dall azienda produttrice) Salmonella spp.: assente in 25 gr. (durante la vendita e la conservazione) Enterotossine stafilococciche: non rilevabili in 25 g (durante la vendita e la conservazione) Escherichia coli O157:H7: assente in 25 gr.

16 Scopo del lavoro Valutare la presenza di VTEC nel latte di massa e nei filtri degli impianti di mungitura di alcuni allevamenti della Lombardia e del Trentino Alto Adige. Ottimizzare il protocollo diagnostico, sia per quanto riguarda la sensibilità sia per quanto riguarda i tempi d esecuzione e la riduzione dei costi, affiancando le tradizionali tecniche d isolamento e d identificazione ad alcune tecniche innovative.

17 Materiali e metodi Messa a punto del protocollo Fase 1 95 colonie di E.coli isolate da latte di singolo quarto (casi clinici di mastite) 43 colonie di E.coli isolate da 7 filtri di macchina mungitrice I campioni sono stati analizzati mediante: Fase 2 ISOLAMENTO SU PIASTRA mpcr qpcr-hrma (tecnologia biomolecolare di nuova generazione) 67 campioni di latte di massa e 67 filtri di mungitrice analizzati mediante VIDAS (test immunoenzimatico), mpcr e qpcr-hrma con l obiettivo di: RIDURRE I TEMPI DI ANALISI AUMENTARE LA SENSIBILITA DELLA METODICA CONTENERE I COSTI

18 Messa a punto del protocollo Inoculo di latte con quantità note di E. coli appartenenti a cinque sierogruppi VTEC (O157, O111, O145, O103, O26). Immuno-concentrazione dei campioni tramite VIDAS. Ricerca dei ceppi presenti nell immuno-concentrato tramite tecniche microbiologiche e multiplex-pcr. Ottimizzazione del protocollo e adattamento per i filtri di mungitrice Problema: ridotta sensibilità mpcr Inoculi di 10 2 e 10 3 UFC/ml dei sierogruppi E.coli VTEC hanno sempre dato esito negativo in mpcr contrariamente ai risultati microbiologici.

19 Soluzione: re-incubazione in BHI dell immuno-concentrato rilasciato dal VIDAS prima della mpcr.

20 Il protocollo si è dimostrato efficace nell isolamento di anche poche colonie di E.coli VTEC (10 1 UFC/campione), qualora presenti nel campione prima dell incubazione in termostato

21 Protocollo per il latte di massa

22 Protocollo per i filtri di mungitrice Il protocollo per l analisi dei filtri di mungitrice prevede la diluizione 1:100 dei campioni per ridurre la concentrazione batterica.

23 Risultati: Fase 1 95 colonie isolate da campioni di latte bovino di singolo quarto 43 colonie isolate dai 7 filtri e dai 7 campioni di latte di massa Positività (mpcr) Sierogruppi 3 O O26 0 / Gli isolati positivi per il sierogruppo O157 non sono stati sottoposti a qpcr-hrma poiché questo sierogruppo è considerato sempre pericoloso per la salute umana. L isolato positivo per il sierogruppo O26, sottoposto a qpcr-hrma è risultato non- VTEC

24 Risultati: Fase 2 Latte di massa Totale campioni Campioni positivi % Sierogruppi N % sul totale Latte di massa (Lombardia) ,3 O157+O ,13 O45 1 2,13 Latte di massa (Trentino Alto Adige) ,0 O45 1 5,00 Prevalenza sierogruppi ,5 O ,49 O45 2 2,99 O ,49 Nella seconda fase, a scopo esplorativo, sono stati ricercati anche i sierogruppi O121 e O45 («Top seven» USA).

25 Latte di massa qpcr-hrma Sierogruppo N N ceppi VTEC % O % O % O % Totale % L assenza dello SNP (T C) nel gene rmlb 966 conferma che il ceppo O145 isolato non è VTEC

26 Risultati: Fase 2 Filtri mungitrice Filtri mungitrice (Lombardia) Filtri mungitrice (Trentino Alto Adige) Prevalenza sierogruppi Totale campioni Campioni positivi , , ,9 % Sierogruppi N % O ,89 O ,13 O26 3 6,38 O26+O ,13 O157+O ,13 O157+O26+O103 +O ,13 O ,00 O ,00 O ,00 O121+O ,00 O ,93 O ,48 O26 5 7,46 O45 2 2,99 O ,99 O ,97

27 Filtri mungitrice qpcr-hrma Sierogruppo N N ceppi VTEC % O % O % O % O % O % O % Totale %

28 Conclusioni La contaminazione intra-mammaria del latte è un fattore di rischio da tenere in considerazione. L utilizzo di strumenti come il VIDAS è utile per ridurre i tempi d analisi, aumentare la sensibilità analitica e il numero di campioni processabili contemporaneamente, riducendo i costi. La presenza dei ceppi di E. coli O45 e O121 nei filtri di mungitura, ceppi poi risultati essere VTEC, dimostra come l indicazione da parte dell EFSA di ricercare solo i 5 ceppi (O157, O111, O145, O103, O26). definiti come top five, sottostimi i pericoli derivanti dalla presenza di altri ceppi di E. coli VTEC. La ricerca di ceppi VTEC nei filtri di mungitrice può rappresentare un efficiente metodo di monitoraggio epidemiologico con una sensibilità molto maggiore rispetto alla ricerca nel latte di massa.

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