Enterobacteriaceae. Bacilli Gram negativi

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1 Enterobacteriaceae Comprende un vasto numero di specie batteriche il cui habitat naturale è rappresentato dall intestino dell uomo e degli animali, ma anche dal suolo, acque, piante, materiali in decomposizione. Bacilli Gram negativi Gram negativi, generalmente mobili per la presenza di flagelli peritrichi (esistono anche varianti immobili), asporigeni, anaerobi facoltativi, fermentano il glucosio con produzione di acido o di acido e gas, ossidasi negativi, catalasi positivi

2 Enterobacteriaceae CARATTERI METABOLICI Poco esigenti: crescono su terreni comuni AEROBI/ANAEROBI FACOLTATIVI in anaerobiosi: FERMENTANO IL GLUCOSIO (tutti) FERMENTANO IL LATTOSIO (ad eccezione delle specie patogene es. Salmonella, Shigella) Producono vari prodotti dalla fermentazione che rappresentano un criterio identificativo e classificativo in aerobiosi: operano una completa ossidazione del substrato tramite la RESPIRAZIONE OSSIDASI NEGATIVI Mancano del sistema della citocromo C ossidasi e risultano negativi al test dell ossidasi. Il test utilizza alcuni reagenti (dicloruro di p-fenilendiamina) che presentano un simile livello di ossidazione del citocromo c ed un colore diverso nella forma ridotta (incolori) e ossidata (blu). Metodo: dischetti in commercio impregnati di reattivo colonia sospetta su dischetto sviluppo di colore blu in pochi secondi (test +) + -

3 Enterobacteriaceae CARATTERI ANTIGENICI: CARATTERI ANTIGENICI: K: capsulari (polisaccaridi); solo in alcuni generi è presente una capsula evidente; a volte una microcapsula. H: flagellari (proteine); se mobili O: somatici (LPS)

4 FATTORI DI VIRULENZA CAPSULA: varia nei diversi generi; attività antifagocitoria PILI: fattori di colonizzazione o di aderenza ENTEROTOSSINE: prodotte da alcuni generi (ceppi di Escherichia coli; Shigella) responsabili di importanti affezioni diarroiche nell uomo ENDOTOSSINA: LPS della parete

5 PRINCIPALI GENERI DI INTERESSE MEDICO TRA GLI ENTEROBATTERI GENERE: Escherichia SPECIE: coli Saprofita intestinale Indice di contaminazione fecale delle acque Alcuni ceppi patogeni causa di: INFEZIONI APPARATO URINARIO MENINGITI NEONATALI MALATTIE INTESTINALI: Ceppi enterotossici ETEC (diarrea infantile, diarrea del viaggiatore) (tossine LT e ST) Ceppi enteropatogeni EPEC non tossigeni Ceppi enteroinvasivi EIEC Ceppi enteroemorragici EHEC (tossine Shiga like, SLT) GENERI: Klebsiella, Enterobacter, Serratia Patogeni opportunisti, causa comune di infezioni nosocomiali Infezioni delle vie urinarie Polmoniti Infezioni di ferite Sepsi Edwarsiella GENERE: Salmonella 1 SPECIE: enterica Comprende più di 2200 sierotipi Parassiti dell uomo o degli animali Alcuni sierotipi causano gastroenteriti, cioè infezioni limitate all ileo terminale Alcuni sierotipi causano la febbre enterica o tifo, una grave infezione sistemica a trasmissione oro-fecale Citrobacter GENERE: Shigella SPECIE: dysenteriae, flexneri,boydii,sonnei Parassiti esclusivi dell uomo Agenti eziologici della DISSENTERIA BACILLARE Trasmissione per ingestione di alimenti contaminati da feci di malati o portatori sani Violente scariche diarroiche mucosanguinolente Tipica in zone a basso tenore socioeconomico S. dysenteriae produce una potente tossina (tossina Shiga) responsabile della morte cellulare Morganella GENERE: Proteus SPECIE: mirabilis, vulgaris, ecc. Comprende microrganismi presenti nel suolo o nell intestino dell uomo Patogeni nosocomiali Sono i più frequenti agenti eziologici di infezioni urinarie dopo i batteri del genere Escherichia Producono ureasi ed alcalinizzano l urina contribuendo al danneggiamento dell epitelio renale Infezioni alle basse vie respiratorie Providencia GENERE: Yersinia SPECIE:pestis, pseudotuberculosis, enterocolitica Peste: zoonosi contratta da animali infetti (ratti, topi) o dalle pulci degli animali

6 AZIONE PATOGENA PREVALENTEMENTE ESOGENE Gli enterobatteri possono essere coinvolti in una serie di affezioni morbose con caratteristiche molto varie: INFEZIONI SISTEMICHE rappresentate dalle febbri enteriche (tifo e paratifo) in cui l interessamento dell intestino si accompagna o è conseguente ad una diffusione dell infezione a tutto l organismo (per via ematica e/o linfatica) con localizazioni extraintestinali; INFEZIONI ESCLUSIVAMENTE INTESTINALI rappresentate da forme di enterite con sintomi diarroici o dissenterici PREVALENTEMENTE ENDOGENE INFEZIONI A LOCALIZZAZIONE EXTRAINTESTINALE rappresentate da infezioni nosocomiali (infezioni delle vie urinarie, delle vie respiratorie, delle ferite )

7 Salmonella È un genere molto vasto e diversificato che comprende oltre 2500 varianti sierologiche (SIEROTIPI O SEROVARS) appartenenti ad un numero limitato di specie. La tassonomia è complessa e soggetta a continue variazioni CARATTERI MORFOLOGICI: BACILLI GRAM- ASPORIGENI MOBILI per flagelli peritrichi NON FERMENTANO IL LATTOSIO ANTIGENI: I sierotipi sono identificabili sulla base di tre tipi di Ag: ANTIGENI O o somatici Sono di natura polisaccaridica (catene laterali dell'lps) Sono stabili al calore ANTIGENI H o flagellari Sono di natura proteica Sono termolabili Possono esistere in due forme FASE 1 e FASE 2; una data cellula esprime un Ag di fase per volta ed i due antigeni corrispondono a due diverse molecole di flagellina (es. di variazione antigenica) ANTIGENI Vi o capsulari Sono polisaccaridici Sembrano associati alla virulenza

8 Salmonella - PATOGENICITÀ Le Salmonelle sono microrganismi enterici invasivi che danno luogo nell'uomo a due principali forme cliniche Agenti eziologici GASTROENTERITI Numerosi per es. S. typhimurium S. enteritidis (SALMONELLE MINORI) FEBBRI ENTERICHE S. typhi S. paratyphi A, B, C (SALMONELLE MAGGIORI) Ospite naturale ANIMALI UOMO Via di trasmissione ALIMENTARE ORO-FECALE Dose infettante Solitamente alta più bassa Tempo di incubazione 8-48 ore giorni Localizzazione del germe Tratto intestinale; 1-4% dei pazienti sviluppa una batteriemia transiente Tratto intestinale; disseminazione sistemica setticemia Durata della malattia Pochi giorni 4 settimane, se non trattata Incidenza della febbre tifoide in Italia Incidenza delle salmonellosi non tifoidee in Italia

9 GASTROENTERITI DA SALMONELLE NON TIFOIDEE t Meno frequenti di quelle sostenute da Stafilococchi enterotossici, ma più gravi (letalità nei bambini e nei soggetti debilitati può raggiungere il 5%). t Sostenute da numerosi sierotipi di Salmonella; principali: S. typhimurium, S. enteritidis t Dose infettante: molto alta ( o più microrganismi); i microrganismi devono moltiplicarsi fortemente nel cibo prima che sia ingerito. t Trasmissione: dagli animali all'uomo (ZOONOSI); il numero di specie animali che possono essere infettate è enorme: animali domestici --> polli, tacchini, maiali, bovini animali selvatici --> topi, ratti Alimenti incriminati t carne cruda di maiale, più raramente di manzo, interiora, insaccati freschi e carne trita t polli macellati, tacchini, anatre t pesci, molluschi, per es: le cozze, ostriche crude t uova che possono infettarsi con salmonelle per via ematica già nell'ovaio o dopo la deposizione

10 PATOGENESI (GASTROENTERITI) Ingestione ed invasione della mucosa intestinale Penetrazione nelle cellule intestinali Infezione limitata all intestino; i microrganismi che raggiungono sedi extraintestinali sono fagocitati ed uccisi. Occasionalmente può esservi setticemia ed infezione in altri tessuti L invasione delle cellule epiteliali stimola la liberazione di citochine proinfiammatorie che porta ad una infiammazione acuta nell ileo e nel cieco con danno locale che porta a diarrea, dolore addominale, vomito e febbre; sintomi dopo 8-48 ore dall ingestione di cibo contaminato Nella maggior parte dei casi la gastroenterite acuta dura 2-5 gg. e guarisce da sola Si può instaurare uno stato di portatore, meno frequente che nel caso della Salmonella typhi

11 Salmonella typhi ED IL TIFO ADDOMINALE (ILEOTIFO) Trasmissione oro-fecale UOMO (malato o portatore asintomatico) FECI Posate, attrezzi di cucina, mani Ambiente Acque superficiali, fiumi, mare ALIMENTI, ACQUA DA BERE UOMO VEICOLI DI INFEZIONE PIÙ COMUNI t Acque superficiali non potabilizzate; t Verdure od altri vegetali consumati crudi; t Molluschi raccolti da acque di mare contaminate da sbocchi fognari e consumati crudi (particolarmente pericolose sono le ostriche nel cui epato-pancreas le Salmonelle si moltiplicano attivamente) CONTROLLO DELLE MALATTIE A CICLO ORO-FECALE CONTROLLO DELLE MALATTIE A CICLO ORO-FECALE controllo della contaminazione fecale dell'ambiente; efficienti sistemi di smaltimento dei rifiuti organici di origine domestica e di potabilizzazione delle acque (igiene ambientale)

12 PATOGENESI DEL TIFO ADDOMINALE (ILEOTIFO) 1 Il tifo addominale è un'infezione sistemica che decorre in 4 settimane. In seguito all'ingestione dei cibi contaminati le Salmonelle passano la barriera gastrica e stabiliscono una colonizzazione iniziale della mucosa dell'intestino tenue. Grazie alle sue spiccate capacità invasive il microrganismo riesce a penetrare attraverso le cellule della mucosa intestinale, a raggiungere i linfonodi mesenterici ed a penetrare, attraverso il dotto toracico, nel circolo ematico dove stabilisce una batteriemia temporanea

13 PATOGENESI DEL TIFO ADDOMINALE (ILEOTIFO) 2 Attraverso il circolo sanguigno il microrganismo si localizza prevalentemente a livello del sistema reticolo endoteliale dove si replica attivamente nei macrofagi del fegato e della milza. Quando il numero delle Salmonelle diventa considerevole esse vengono di nuovo riversate nel circolo ematico dove danno origine ad una seconda batteriemia questa volta di più lunga durata che coincide con la fine del periodo di incubazione e l'inizio della sintomatologia clinica e del rialzo febbrile. I batteri si distribuiscono a vari organi ed in particolare alla colecisti da dove, attraverso la bile, raggiungono di nuovo in gran numero l'intestino

14 DIAGNOSI DI LABORATORIO 1 La diagnosi di laboratorio può effettuarsi sia con metodi diretti che indiretti METODI DIRETTI 1) MATERIALI CLINICI La scelta del materiale clinico per la ricerca di Salmonella dipende dallo stadio della malattia Sangue (1 settimana) EMOCOLTURA: EMOCOLTURA isolamento dal sangue = diagnosi di malattia t Feci (2-3 settimana) COPROCOLTURA: COPROCOLTURA isolamento dalle feci può evidenziare uno stato di portatore t Urine, Urine biopsie tissutali, tissutali liquido peritoneale ecc.. t

15 DIAGNOSI DI LABORATORIO 2 2) TERRENI DI COLTURA PER L ISOLAMENTO DALLE FECI COLTURA DI ARRICCHIMENTO Permette la crescita dei batteri che voglio isolare inibendo lo sviluppo dei microrganismi non desiderati Importante Quando i batteri da isolare sono numericamente poco rappresentati rispetto ai commensali. es: portatori di Salmonelle 200 batteri/gr di feci 10 9 o +/gr di feci E. coli od altri Principio Esempi Allungano la fase di latenza dei coliformi; necessità di subcoltura dopo 6-8 ore BRODO AL SELENITO o AL TETRATIONATO TERRENI SELETTIVI e DISCRIMINATIVI MODERATAMENTE SELETTIVI AGAR MAC CONKEY AGAR EOSINA BLU DI METILENE (EMB) CRITERIO DISCRIMINATIVO: FERMENTAZIONE DEL LATTOSIO ALTAMENTE SELETTIVO AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) Evidenzia la produzione di H 2 S: Colonie incolori con centri neri Escherichia Enterobacter Klebsiella, ecc.. Lattosio + Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas Lattosio -

16 TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici. ESEMPIO: TERRENO AL SELENITO per l isolamento delle Salmonelle dalle feci Numero di batteri 6-8 ore Tempo (ore) Batterio patogeno che voglio isolare dalle feci (es: Salmonella typhi) Batteri non patogeni commensali intestinali

17 DIAGNOSI DI LABORATORIO 2 2) TERRENI DI COLTURA PER L ISOLAMENTO DALLE FECI COLTURA DI ARRICCHIMENTO Permette la crescita dei batteri che voglio isolare inibendo lo sviluppo dei microrganismi non desiderati Importante Quando i batteri da isolare sono numericamente poco rappresentati rispetto ai commensali. es: portatori di Salmonelle 200 batteri/gr di feci 10 9 o +/gr di feci E. coli od altri Principio Esempi Allungano la fase di latenza dei coliformi; necessità di subcoltura dopo 6-8 ore BRODO AL SELENITO o AL TETRATIONATO TERRENI SELETTIVI e DISCRIMINATIVI MODERATAMENTE SELETTIVI AGAR MAC CONKEY AGAR EOSINA BLU DI METILENE (EMB) CRITERIO DISCRIMINATIVO: FERMENTAZIONE DEL LATTOSIO ALTAMENTE SELETTIVO AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) Evidenzia la produzione di H 2 S: Colonie incolori con centri neri Escherichia Enterobacter Klebsiella, ecc.. Lattosio + Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas Lattosio -

18 DIAGNOSI DI LABORATORIO TEST BIOCHIMICI (API20E Enterobacteriaceae)

19 DIAGNOSI DI LABORATORIO 3 3) IDENTIFICAZIONE Le colonie sospette (identificazione presuntiva) vengono prelevate per allestire delle subcolture da utilizzarsi per l'identificazione definitiva IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Serie di prove che evidenziano delle proprietà metaboliche o fenotipiche del batterio. Alcuni esempi: Utilizzazione di carboidrati come fonte di carbonio Produzione di indolo (Salmonelle -; E. coli +; Proteus +) Utilizzazione del citrato (Salmonelle +; E. coli -; Proteus -) Produzione di ureasi (Salmonelle -; E. coli -; Proteus +) Decarbossilazione della lisina, ornitina, arginina Produzione di fenilalanina deaminasi (Salmonelle -; E. coli -; Proteus +) Motilità (Salmonella, E. coli, Proteus mobile; Shigella immobile) Produzione di H 2 S (Salmonelle +; Proteus ++; E. coli -) E. coli + P. vulgaris Salmonella ++

20 DIAGNOSI DI LABORATORIO 4 4) TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA Sono stati identificati più di 2300 sierotipi (serovar) di Salmonella utilizzando anticorpi specifici contro gli antigeni: K: capsulari (polisaccaridi); H: flagellari (proteine); O: somatici (LPS)

21 Escherichia coli Bacillo Gram negativo; anaerobio facoltativo; fermenta il GLUCOSIO ed il LATTOSIO (la maggior parte dei ceppi); spesso mobile per flagelli peritrichi. Colonizza l apparato digerente della maggior parte degli animali a sangue caldo a poche ore dalla nascita. È uno dei batteri più rappresentati della flora normale intestinale (INDICE DI CONTAMINAZIONE FECALE DELLE ACQUE) ALCUNI CEPPI PATOGENI!!! Indistinguibili dagli altri dal punto di vista morfologico e biochimico, ma solo con tecniche molecolari

22 TIPI DI PATOLOGIE, CAUSATE DA UN NUMERO LIMITATO DI CEPPI: INFEZIONI DELL APPARATO URINARIO (CEPPI UROPATOGENI) Responsabili del 90% delle infezioni urinarie. Colonizzano le vie urinarie (uretra) per via ascendente dall intestino (infezioni endogene), risalgono fino alla vescica (batteriuria) e possono migrare al rene o alla prostata. Producono adesine (in primo luogo pili) che che si legano alle cellule di rivestimento della vescica e delle vie urinarie superiori prevenendo l eliminazione del batterio con la minzione) Diagnosi: sintomi + almeno 10 5 batteri/ml di urina MENINGITI NEONATALI E. coli insieme agli Streptococchi di gruppo B causa la maggior parte delle infezioni del SNC in neonati di età inferiore ad 1 mese. Coinvolti particolari ceppi che possiedono l Ag capsulare K1 (attività antifagocitaria) MALATTIE INTESTINALI

23 E. coli ETEC (Enterotossigeni) Si legano lassamente alla superficie degli enterociti tramite fimbrie e rilasciano due tipi di tossine che penetrano nelle cellule senza danneggiare l epitelio: LT (termo labile) simile alla tossina colerica (causa diarrea con lo stesso meccanismo). Causa una sindrome molto simile al colera specialmente nei bambini malnutriti e debilitati. Agisce attivando l ADENILATO CICLASI, un enzima che porta ad un aumento dell AMP ciclico ST (termo stabile) È prodotta in associazione od in alternativa al LT. È una piccola proteina non antigenica. Agisce attivando la GUANILATO CICLASI, un enzima che porta ad un aumento del GMP ciclico. L aumento intracellulare del camp e cgmp porta ad una riduzione dell assorbimento del Na+ e ad un aumento dell escrezione di Cl- con un aumento del NaCl nel lume intestinale. Questo richiama acqua per osmosi con conseguente DIARREA ACQUOSA

24 E. coli EPEC (Enteropatogeni) EPEC aderiscono strettamente agli enterociti provocando la distruzione dei microvilli (con conseguente diarrea e malassorbimento) e la formazione di invaginazioni nella membrana degli enterociti attorno ai batteri. Lo stretto contatto è mediato da una proteina batterica della membrana esterna di 94 KDa codificata da un plasmide (INTIMINA) che è coinvolta nella formazione di un piedistallo di fibre di actina che si forma nella cellula dell ospite al di sotto dei batteri. Sono causa di epidemie di diarrea nei reparti di neonatologia; nelle comunità casi sporadici o epidemici di diarrea infantile; raramente diarrea negli adulti

25 E. coli EIEC (Enteroinvasivi) Sono molto simili a Shigella (immobili, non fermentano lattosio. Come Shigella si attaccano alla mucosa dell intestino crasso ed invadono le cellule per endocitosi; lisano la membrana del vacuolo endocitico e si moltiplicano all interno della cellula che viene uccisa. Diffondono alle cellule contigue, causando una notevole distruzione della mucosa intestinale ed una forte infiammazione. La loro patogenicità è legata ad una ISOLA DI INVASIVITÀ che include numerose proteine della membrana esterna tutte codificate da un plasmide. Causa una forma dissenterica (Shigella-like) caratterizzata da febbre, intensi crampi addominali, malessere ed abbondante emissione di feci, prima acquose quindi muco-sanguinolente e ricche di PMN (neutrofili).

26 E. coli EHEC (Enteroemorragici) Principalmente appartenenti al sierotipo O157:H7, riconosciuto una causa crescente di infezioni acquisite per via alimentare. Ceppi più comunemente responsabili di malattia nei Paesi industrializzati. Bassissima carica infettante (circa 50 batteri) La maggior parte dei casi di malattia è stata attribuita al consumo di carne macinata di manzo contaminata durante la lavorazione e consumata poco cotta (MALATTIA DELL HAMBURGER); consumo di acqua o di latte o succhi di frutta non pastorizzati contaminati da feci bovine. Conseguenze cliniche molto varie da una lieve diarrea ad una COLITE EMORRAGICA o dalla SINDROME UREMICO EMOLITICA

27 MECCANISMI PATOGENETICI Sono simili a EPEC, ma in più liberano due potenti citossine (SLT1 e SLT2): VEROTOSSINA 1 o SLT1 (Shiga-like toxin 1), identica alla tossina di Shigella dysenteriae. La tossina si lega ad uno specifico glicolipide sulle cellule bersaglio (globotriaosilceramide) particolarmente abbondante sulle cellule intestinali e renali. La porzione attiva della tossina una volta all interno delle cellule si lega all rrna 28S bloccando la sintesi proteica con conseguente distruzione dei villi intestinali, malassorbimento ed escrezione di fluidi. Gli effetti a distanza ad esempio sul rene sono conseguenti all entrata in circolo.

28 Shigella Non fermenta il lattosio. Si replica nelle cellule che rivestono la mucosa del colon -replicazione intracellulare-. Immobile.

29 Yersinia Zoonosi. Y. enterocolitica e Y. pestis non fermentano il lattosio. Immobili. Alexandre Yersin

30 Campylobacter PATOGENESI

31 Campylobacter