Enterobacteriaceae. E.coli. Shigella. Salmonella

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1 Enterobacteriaceae Shigella E.coli Salmonella

2 GENERALITA La famiglia delle Enterobacteriaceae comprende una grande varietà di batteri dotati di caratteristiche morfologiche e colturali comuni. E il gruppo più vasto ed eterogeneo di bacilli Gram negativi importanti dal punto di vista medico. Sono stati individuati 40 generi e 150 specie Nonostante la complessità di questa famiglia meno di 20 specie sono responsabili di più del 95% delle infezioni

3 MORFOLOGIA E GENERALITA I membri di questa famiglia sono bacilli Gram-negativi di modeste dimensioni (da 0,3 fino a 6 mm) Gram-negativi Aerobi e anaerobi facoltativi Asporigeni Ossidasi negativi Catalasi positivi Possono essere mobili per flagelli peritrichi Possono produrre capsula o esopolisaccaridi Fermentano il glucosio, riducono il nitrato e non hanno attività citocromo-ossidasica, caratteristica che li fa distinguere da altri bacilli Gram negativi fermentanti e non.

4 Sono microrganismi ubiquitari: suolo, acqua, vegetazione, flora intestinale di molti animali compreso l uomo Causano una vasta gamma di malattie nell uomo tra cui infezioni intestinali, setticemie (30-35%) infezioni delle vie urinarie (70%) Alcune specie sono sempre associate a malattia (Salmonella typhi, alcune specie di Shigella, Yersinia pestis), altre sono normale flora commensale e possono dare infezioni opportunistiche (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis). Un terzo gruppo di Enterobacteriaceae sono normali commensali che diventano patogeni se acquisiscono geni di virulenza su plasmidi, batteriofagi o isole di patogenicità (E.coli associato a isole di patogenicità) Le infezioni possono originare da un serbatoio animale (Salmonella, Yersinia pestis), da un portatore umano (specie di Shigella, S. typhi) o avere diffusione endogena in pazienti suscettibili (E.coli) e interessare quasi tutti i distretti corporei.

5 Siti di Infezione da parte delle più comuni Enterobatteriacee

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7 La classificazione dei generi è basata su proprietà biochimiche, struttura antigenica, tecniche di ibridazione e sequenziamento degli acidi nucleici. Le caratteristiche morfologiche delle colonie in diversi terreni selettivi hanno permesso di identificare i diversi membri della famiglia delle Enterobacteriaceae. Ad esempio la capacità a fermentare il lattosio ha permesso di distinguere E.coli o Klebsiella da quelli che non lo fermentano o lo fermentano lentamente come la Shigella. La crescita in terreni contenenti cianuro di potassio viene usata per discriminare i diversi enterobatteri. Inoltre, l utilizzo di coloranti consente di identificare le colonie dei lattosio- fermentanti (colorate) da quelle non fermentanti. Produzione di specifici prodotti terminali di alcune vie metaboliche: H 2 S; INDOLO (a partire da triptofano si evidenzia per aggiunta di p-dimetilamminobenzaldeide che si combina con l indolo a formare un colore rosso)

8 ANTIGENICITÀ E PATOGENICITÀ La classificazione sierologica degli enterobatteri si basa su tre principali gruppi di antigeni: Il polisaccaride somatico O; L antigene capsulare K; La proteina flagellare H.

9 ANTIGENICITÀ E PATOGENICITÀ ENTEROTOSSINA Il lipopolisaccaride (LPS), termostabile, è il maggiore antigene della parete cellulare e consiste di tre porzioni: l antigene somatico O, di natura polisaccaridica, un core polisaccaridico comune a tutte le Enterobacteriaceae (antigene comune) ed il lipide A. Per ciascun genere esistono specifici antigeni O, tuttavia sono comuni reazioni crociate tra generi più strettamente correlati (Salmonella con Citrobacter, Escherichia coli con Shigella). E causa delle manifestazioni generali comuni a tutti i Gram-negativi quali febbre, leucopenia, attivazione della cascata del complemento, coagulazione intravascolare disseminata, shock.

10 ENDOTOSSINA (rilasciato dopo lisi cellulare) COMPONENTE Lipide A ATTIVITÀ Attivazione del complemento Rilascio di citochine Leucocitosi Trombocitopenia Coagulazione intravascolare disseminata Febbre Diminuita circolazione periferica Shock e morte

11 CAPSULA Numerosi generi, compresi o meno nella famiglia delle Enterobacteriaceae, possiedono l antigene K, di natura polisaccaridica, che circonda il germe e rappresenta la base per la suddivisione in sierotipi. La sua localizzazione periferica può mascherare gli antigeni sottostanti. Compito principale di questa struttura capsulare è quello di eludere la fagocitosi e la successiva attivazione del complemento. PROTEINE FLAGELLARI Gli antigeni H sono proteine termolabili flagellari. Possono essere assenti o subire variazione antigenica con la presenza di due fasi (Antigene di fase 1 e fase 2). La variazione di fase è sotto il controllo genico del microrganismo proteggendolo dalla morte cellulare anticorpo-mediata. I ceppi mobili possiedono flagelli peritrichi distribuiti sulla superficie. Nelle specie uropatogene questo carattere viene considerato importante per l invasività e la possibile risalita al parenchima renale. Molte specie posseggono le fimbrie o pili che consentono al batterio di iniziare la colonizzazione in distretti specifici.

12 Sistemi di secrezione di tipo III Una varietà di batteri hanno un sistema effettore comune per rilasciare i geni della virulenza in cellule eucariotiche bersaglio. Questo sistema, chiamato sistema di secrezione di tipo III consiste di circa 20 proteine che facilitano la secrezione del fattore di virulenza nelle cellule ospiti. In assenza del sistema di secrezione di tipo III i batteri perdono la loro virulenza. Esotossine Produzione di diverse esotossine quali le tossine Shiga (Stx-1 e Stx-2), le tossine termostabili (Sta ed Stb), le tossine termolabili (LT-1 e LT-2). Inoltre, le emolisine (Hly-A) sono considerate importanti nella patogenesi della malattia causata da E.coli uropatogeni

13 Batteriocine Molti batteri Gram negativi producono batteriocine. Sono proteine ad alto peso molecolare che vengono prodotte da alcuni ceppi batterici e sono attivi contro alcuni stipiti della stessa specie o di specie correlate. La loro produzione è sotto controllo plasmidico. Colicine sono prodotte da E.coli Marcescine da Serratia Piocine da Pseudomonas

14 SEQUESTRO DI FATTORI DI CRESCITA La capacità di chelare il ferro attraverso la sintesi di enzimi con altissima affinità per questo cofattore favorisce la sopravvivenza e lo sviluppo delle Enterobacteriaceae nelle possibili fasi invasive. Questi microrganismi liberano i siderofori (enterobactina e aerobactina) che si contrappongono alla transferrina e lattoferrina del siero. Il ferro può essere anche rilasciato da cellule ospiti uccise in seguito all azione delle emolisine prodotte dal batterio. RESISTENZA AL KILLING SIERICO (UCCISIONE MEDIATA DAL SIERO) Sebbene la capsula protegga il batterio dal killing sierico altri fattori, poco definiti, possono prevenire il legame dei componenti del complemento al batterio e la seguente lisi complemento-mediata

15 Escherichia coli E il patogeno opportunista più frequente. E associato ad una varietà di malattie tra cui infezioni del tratto urinario, sepsi, meningiti, gastroenteriti. E l agente eziologico dell'80-90% delle infezioni delle vie urinarie in ambito comunitario. Dall'intestino, dove alberga nella popolazione microbica normale, può colonizzare le vie urinarie con meccanismo solitamente ascendente anche grazie alla sua mobilità per flagelli peritrichi e alla presenza di fimbrie (tipo 1) che ne permettono l'adesione ai recettori specifici (D-mannoso) delle cellule uroepiteliali delle basse vie escretrici, evitando di essere eliminato dalla motilità intestinale o dal flusso urinario. E il batterio associato al maggior numero delle infezioni nosocomiali.

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17 Escherichia coli I ceppi di E.coli presentano numerose adesine altamente specializzate. Queste comprendono antigeni del fattore di colonizzazione, fimbrie di adesione aggreganti, pili a fasci, intimina, pili P (che si legano ad antigeni del gruppo sanguigno P), proteina Ipa (antigene plasmidico di invasione) e fimbrie Dr (che si legano ad antigeni del gruppo sanguigno Dr).

18 Gastroenterite da E. coli Anche se usualmente E. coli è ospitato nella popolazione microbica normale dell'apparato digerente, può in alcuni casi causare affezioni intestinali che, sulla base dei diversi meccanismi di patogenicità posti in atto, è possibile ricondurre a cinque microrganismi distinti: Escherichia coli Enterotossigeni (ETEC) Escherichia coli Enteropatogeni (EPEC) Escherichia coli Enteroinvasivi (EIEC) Escherichia coli Enteroemorragici (EHEC) Escherichia coli Enteroadesivi (EAEC)

19 EPEC I ceppi di E.coli enteropatogeni rappresentano un importante causa di diarrea nel lattante. La malattia è rara in ragazzi più grandi e adulti, forse perché hanno sviluppato un immunità protettiva. La diarrea acquosa caratteristica di questa malattia è causata da malassorbimento dovuto al fatto che il microrganismo aderisce alle cellule epiteliali dell intestino tenue e causa distruzione dei microvilli. I geni responsabili per il locus della distruzione dell enterocita si trovano su un isola di patogenicità. Su quest isola sono presenti i geni che codificano per le molecole responsabili dell attacco e la distruzione della superficie mucosale dell ospite. I ceppi formano microcolonie sulla superficie delle cellule epiteliali. L adesione debole è inizialmente mediata da Bfp (pili formanti fasci), seguita da secrezione di proteine da parte del sistema di secrezione di tipo III nella cellula epiteliale dell ospite. La sintomatologia comprende diarrea non sanguinolenta, febbre, nausea e vomito.

20 ETEC Le gastroenteriti da ceppi di E. coli enterotossigeni si riscontrano molto nelle nazioni in via di sviluppo. Sono responsabili di sindromi diarroiche (diarrea del viaggiatore) Perchè si verifichi l infezione l inoculo deve essere alto. La trasmissione avviene come sempre per via oro-fecale. La diarrea si manifesta dopo pochi giorni di incubazione. Gli ETC producono due tipi di tossine termolabili (LTI, LTII) e tossine termostabili (Sta e STb). Possono essere prodotte entrambe o solo una. Queste tossine si trovano su plasmidi. Gli stessi plasmidi possono portare i geni per i fattori di colonizzazione che favoriscono l adesione del batterio all epitelio intestinale (adesine).

21 ETEC LT-1 è funzionalmente simile alla tossina del colera nell uomo. E una tossina AB, con 5 subunità B che si legano allo stesso recettore della tossina colerica (ganglioside GM1 dell orlo a spazzola delle cellule epiteliali del intestino). La subunità A ha attività ADP ribosilante. Una volta entrata ADP ribosila l adenilato ciclasi, incrementandone l attività. Ciò porta ad aumento dell AMP ciclico con fuoriuscita di acqua e cloro e diminuito assorbimento di sodio. Il lume intestinale è iperdisteso dal liquido e ciò causa ipermotilità e diarrea.

22 ETEC I plasmidi che trasportano i geni per le enterotossine LT e ST possono trasportare anche i geni per i fattori di colonizzazione che favoriscono l adesione dei ceppi di E.coli all epitelio intestinale. Determinati sierotipi di ETEC si trovano in tutto il mondo. E possibile che qualsiasi ceppo di E.coli possa acquisire un plasmide che codifica per le enterotossine.

23 EHEC I ceppi enteroemorragici (EHEC), sono produttori di una tossina citotossica simile a quella sintetizzata da Shigella (tossina Shiga Stx-1 e 2) che inibisce la sintesi proteica. E anch essa una tossina AB che funziona come quella dei ceppi enterotossigeni ETEC. Dopo una iniziale fase di adesione del germe alla mucosa, la tossina determina una vera e propria colite emorragica non accompagnata da febbre, con distruzione dei villi intestinali, ridotto assorbimento dei liquidi e aumentata secrezione di fluidi. Il principale serbatoio è rappresentato da alimenti provenienti da animali contaminati: carni macinate mal cotte e latte crudo. L eventuale passaggio in circolo della tossina può determinare la sindrome uremicoemolitica (HUS) caratterizzata da insufficienza renale acuta, trompocitopenia e anemia emolitica, una complicazione che si manifesta nel 10% dei ragazzi infetti di età inferiore ai 10 anni.

24 EIEC I ceppi di E.coli enteroinvasivi (EIEC) provocano una sintomatologia simile a quella presente nella dissenteria bacillare sostenuta da Shigella. Il meccanismo patogenetico è infatti analogo, con invasione degli enterociti e moltiplicazione intracellulare di E. coli cui conseguono lesioni necrotico-emorragiche della mucosa. La distruzione delle cellule epiteliali con infiltrazione infiammatoria può causare ulcerazione del colon. La sintomatologia comprende pertanto diarrea mucosanguinolenta, febbre, compromissione dello stato generale e presenza di leucociti nelle feci. La trasmissione avviene come sempre per via oro-fecale EAEC I microorganismi di tipo EAEC (enteroaggreganti) attualmente si distinguono solo per la capacità di aderire in vitro a cellule diploidi ed in vivo agli enterociti, provocando diarrea acquosa con tendenza alla cronicizzazione. La persistenza di questi batteri è associata a diarrea cronica e ritardi nella crescita nei bambini. I batteri sono caratterizzati dalla loro agglutinazione a forma di ammassi di mattoni, processo mediato da fimbrie formanti fasci codificate da un gene plasmidico. Gli EAEC stimolano la produzione di muco che avvolge i batteri in un biofilm che si stratifica sull intestino tenue.

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26 ALTRE MANIFESTAZIONI CLINICHE Alcuni ceppi di E. coli, in particolare quelli provvisti di polisaccaride capsulare K, sono tra i maggiori responsabili di meningiti neonatali E.coli può anche comportarsi da patogeno opportunista, specie in ambito nosocomiale, sostenendo infezioni delle vie respiratorie, dell'apparato urogenitale sia nel maschio che nella femmina ed, inoltre, peritoniti, osteomieliti, artriti, sepsi, ecc.. Tali quadri sono favoriti sia da una diminuita sorveglianza da parte delle difese dell'ospite, sia dalla circolazione di ceppi particolarmente virulenti.

27 Salmonella Agente eziologico dell enterite, setticemia, febbre enterica La classificazione tassonomica del genere Salmonella risulta problematica. Attualmente si riconoscono due specie: Salmonella enterica Salmonella bongori La Salmonella enterica è a sua volta suddivisa in 5 sottospecie, storicamente riportati come specie. S.typhi, Salmonella enterica serovar Typhi (febbre tifoide) S.paratyphi, Salmonella enterica serovar Paratyphi S.choleraesuis, Salmonella enterica serovar choleraesuisi S.typhimurium, Salmonella enterica serovar Typhimurium S.enteritidis, Salmonella enterica serovar Enteritidis

28 Contagio oro-fecale Cibi contaminati pollame, uova, prodotti caseari, cibi poco cotti o manipolati da persone infette La carica infettiva varia con le persone da <1000 organismi a oltre 10 milioni. La dose infettante è inferiore per le persone ad alto rischio di malattia a causa dell età, per uno stato di immunosoppressione o per altra patologia concomitante, ma anche per ridotta acidità gastrica. I microrganismi anche se presenti in bassa carica possono moltiplicarsi fino a raggiungere cariche elevate se gli alimenti contaminati sono conservati in maniera poco adeguate (temperatura ambiente). Dopo ingestione (13 giorni incubazione) febbre, diarrea (non sempre presente). Dall intestino ai vasi linfatici, noduli mesenterici, circolazione sanguigna Isolabile da sangue, feci, urine Vi sono portatori sani

29 CARATTERI DI PATOGENICITÀ Resistenza agli acidi Mobilità Induzione di segnali sulle cellule epiteliali Ruffling della membrana endocitosi secrezione IL8 Sopravvivenza nei macrofagi (catalasi, superossidodismutasi)

30 Il tifo Il tifo è una malattia di notevole gravità. Compare dopo alcuni giorni dall ingestione di cibi contaminati. Determina malessere generale e febbre che può giungere fino a 41 C, con torpore nel paziente che dura oltre una settimana. La Salmonella, superata la mucosa gastrica, viene portata in circolo dai macrofagi e si localizza nel fegato, nella milza e nei linfonodi. Si moltiplica velocemente portando alla comparsa di febbre persistente e, successivamente viene eliminata con la bile, inducendo la sintomatologia intestinale con diarrea e dolori addominali. Mortalità elevata se non trattato in tempo.

31 Cellule M: trasportano antigeni estranei ai macrofagi dello strato sottostante per l eliminazione. La salmonella è ingerita con alimenti. Passa indenne attraverso lo stomaco grazie al prodotto di un gene che determina acido toleranza (gene ATR - acid tolerance response). Invade le cellule M, localizzate nelle placche di Peyer localizzate nella porzione terminale dell intestino tenue, le supera e viene a contatto con i macrofagi. Sfugge alla fagocitosi e viene portata in circolo attraverso il sistema linfatico e quindi nel circolo ematico.

32 Due sistemi separati di secrezione di tipo III (SPI-1 e SPI-2) mediano l invasione iniziale della mucosa intestinale. Il sistema SPI-1 introduce le proteine di invasione secrete da Salmonella (Sips o Ssps) nelle cellule M, cui segue il riarrangiamento dell actina con increspamento della membrana (ruffling). Le membrane così circondano ed inglobano le salmonelle, che si replicano all interno di esse, nel fagosoma con successiva morte delle cellula ospite e diffusione alle cellule epiteliali adiacenti e al tessuto linfoide. Sansonetti. Gut 2002;50:iii2-iii8 doi: /gut.50.suppl_3.iii2

33 Shigella La classificazione comprende 4 specie che consistono di più di 45 sierogruppi basati sull antigene O. Shigella dysenteriae Shigella flexneri causa di shigellosi nei paesi in via di sviluppo Shigella boydii Shigella sonneri causa di shigellosi nel mondo industrilizzato Produce una tossina, la tossina Shiga con 1 subunità A e cinque B. Le subunità B si legano ad un glicolipide delle cellule ospiti favorendo l ingresso di A. Questa taglia rrna 28S della subunità ribosomale 60S. Ciò previene il legame del t-rna e blocco della sintesi proteica. Sintomi dopo 3 giorni, diarrea sanguinolenta e pus, crampi addominali, infezione autolimitante, ma è consigliato il trattamento antibiotico per ridurre il rischio di contagio. Rari i portatori sani.

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35 Meccanismo di invasione simile a quello di Salmonella. In questo caso il sistema di secrezione di tipi III media la secrezione di 4 proteine (IpaA, IpaB, IpaC, IpaD) all interno delle cellule epiteliali. Sansonetti. Gut 2002;50:iii2-iii8 doi: /gut.50.suppl_3.iii2

36 Yersinia Il genere comprende 11 specie di cui Y. pestis, Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis sono le patogene per l uomo. Y. pestis provoca due forme di infezioni: peste urbana che colpisce l uomo peste selvatica che colpisce scoiattoli, conigli, topi di campo e gatti domestici. Y. Enterocolitica ha come serbatoio naturale maiali, roditori, bestiame e conigli Y. pseudotuberculosis ha come serbatoio naturale roditori, animali selvatici e cacciagione. Patogenesi come Shigella e Salmonella. Sansonetti. Gut 2002;50:iii2-iii8 doi: /gut.50.suppl_3.iii2

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38 Invasive Molecular Strategies of Salmonella, Shigella, Yersinia and Listeria. (A) Salmonella translocates several effectors into target cells, several of them allowing the intial uptake of the bacterium: actin polymerization and actinfilament bundling; membrane ruffle formation; closure of the plasma membrane over internalized bacteria. (B) Shigella also translocates several TTSS effectors into target cells to induce invasion. (C) The Yersinia outer membrane invasin interacts with b1 integrin receptors and favors activation of the small RhoGTPase Rac1, which will indirectly modulate the phosphatidylinositol metabolism to induce actin rearragements at the site of bacterial entry, promoting invasion. Figure from Pizarro-Cerda et al. Cell 2006 Ruffling della membrana cellulare causata da Salmonella Typhimurium

39 Proteus mirabilis Questo bastoncino dallo spiccato pleiomorfismo si distingue per la sua capacità di sciamare sul terreni di coltura ricoprendo tutti gli altri batteri con una patina che lo rende subito riconoscibile. Non fermenta il lattosio ed è un forte produttore di ureasi, enzima che gli consente di scindere l urea in anidride carbonica ed ammoniaca, innalzando il ph delle urine. P.mirabilis colonizza normalmente il tratto intestinale dell'uomo e, al pari di E. coli, può determinare infezioni delle vie urinarie, specie in ambito comunitario.

40 FATTORI DI VIRULENZA: FLAGELLI grande mobilità può risalire sino ai reni PILI adesività ATTIVITÀ UREASICA che determina alcalinizzazione delle urine e formazione di calcoli.

41 Klebsiella pneumoniae K.pneumoniae si distingue dagli altri enterobatteri per essere assolutamente immobile. In compenso essa sintetizza una cospicua capsula che conferisce alle colonie un aspetto mucoso su terreni di coltura solidi e costituisce la base della tipizzazione degli oltre 80 sierotipi (antigene K). E un commensale del tratto intestinale ma è causa di infezioni delle vie urinarie di natura per lo più comunitarie. A livello ospedaliero K.pneumoniae esprime tutta la sua potenziale patogenicità. L acronimo K.E.S. (Klebsiella, Enterobacter-, Serratia) definisce infatti un gruppo di patogeni accomunati dalla prevalente diffusione nosocomiale e dalla difficoltà di eradicazione.

42 ALTRE MANIFESTAZIONI CLINICHE K.pneumoniae come altri germi capsulati (emofili, pneumococchi) causa polmoniti lobari, favorite da situazioni quali alcolismo, broncopneumopatie croniche ostruttive, deficit immunitari. A partenza dai foci urinari o respiratori può evolvere verso sepsi o meningiti.