Sorveglianza di Laboratorio delle Tossinfezioni Alimentari con particolare attenzione a Escherichia coli O157

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1 Università degli Studi di Siena Facoltà di Scienza Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea Specialistica in Biologia Sanitaria Sorveglianza di Laboratorio delle Tossinfezioni Alimentari con particolare attenzione a Escherichia coli O157 Relatore: Prof. Lungarella Giuseppe Relatore aziendale: Dr.ssa Irene A. Galanti Candidato: Dini Alessio

2 Malattie Trasmesse da Alimenti ( MTA ) Intossicazioni alimentari Tossinfezioni alimentari Infezioni alimentari

3 Alcuni dei più comuni agenti eziologici di MTA Agente eziologico Salmonella enteritidis Salmonella Spp. Campylobacter jejuni E.coli enteroemmorragici Lysteria monocytogenes Vibrio parahaemolitycus Cyclospora Cryptosporidium Shigella Staphylococcus aureus Bacillus cereus Clostridium perfringens Veicolo Uovo Pollame, carne, germogli, pesce Pollame Carne, germogli Formaggio, prodotti freschi, vegetali Frutti di mare Acqua, alimenti Acqua potabile Vegetali Manipolazione del cibo Riso, pasta, patate Carne

4 Le MTA si manifestano principalmente con una sintomatologia definita gastroenterite Diarrea ( C ) Febbre alta Dolori addominali diffusi a tutto l addome Vomito Segni generali di infezione

5 Salmonella Più di 2400 sierotipi Habitat: intestino di rettili, uccelli e mammiferi Specie adattate all ospite e non Trasmissione oro-fecale 4 specie: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonn Agente eziologico della dissenteria bacillare Spiccata invasività Produzione di tossine (Shiga) Reservoir: uomo Shigella Trasmissione: oro-fecale o contatto diretto Yersinia enterocolitica Reservoir: roditori, conigli, maiali, pecore, bovini, cani Isolato anche in acque superficiali Spiccata attività invasiva Ulcerazioni della mucosa dell ileo terminale Campylobacter Microaerofilia: 3-5% di ossigeno e 2-10% di CO2 Solo le specie termofile sono fonte di gastroenterite (C.jejuni e C.coli) Reservoir: cani, polli, bovini, suini ed ovini Alimenti contaminati e mal cotti Alta incidenza

6 Adenovirus e Rotavirus Famiglia Adenoviridae Virus a DNA Affezioni che interessano soprattutto le vie respiratorie, ma possono interessare anche l apparato digerente e gli occhi Periodo di incubazione 7-8 gg Sintomatologia che perdura per 8-14 gg Famiglia Reoviridae Virus a RNA Uno dei principali agenti causa di gastroenterite acuta, soprettutto nei bambini di età inferiore ai 2 anni Periodo di incubazione 2 gg Sintomatologia che perdura per 3-8 gg

7 Escherichia coli Piccolo bacillo Gram negativo appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae, mobile, aerobio/anaerobio facoltativo T ottimale di crescita 37 C Cresce in habitat ampiamente diffusi Oltre sierotipi caratterizzati dalla diversa combinazione di antigeni O, H, K, F Contribuiscono alla digestione corretta del cibo Dal punto di vista clinico sono 5 i gruppi importanti:

8 Enteropatogeni (EPEC): adesione all epitelio e ( attachment/effacement ) distruzione dei microvilli Enterotossigeni (ETEC): producono tossine labili ( StB (Lt1, Lt2) e tossine stabili al calore (StA, Enteroinvasivi (EIEC): proliferano all interno del citoplasma degli enterociti dell intestino crasso ( like (Shigella Enteroaderenti (EAEC): adesione e colonizzazione dell intestino tenue Enteroemorragici (EHEC): lesione istopatologica ( Stx2 A/E, produzione di 2 tossine (Stx1,

9 Nell ambito degli EHEC viene distinto un sottogruppo chiamato VTEC (E.coli produttori di ( verocitotossina Tra i più temibili agenti patogeni alimentari, il loro capostipite è sicuramente l E.coli O157:H7

10 E.coli O157: H7 Sorbitolo - Idrolisi MUG manifestazione clinica molto grave dose infettante molto bassa epidemie nella popolazione molto estese una origine zoonosica: colonizza allevamenti animali ( bovini (ruminanti, soprattutto

11 Veicoli di E.coli O157 Carne macinata Hamburger Altri tipi di carne di origine bovina Salami ( caprino Latte crudo (bovino o ( germogli Vegetali (lattuga, Contatto diretto con animali

12 E.coli O157: H7 sintomatologia principalmente intestinale: infezione asintomatica diarrea acquosa, diarrea sanguinolenta con crampi addominali ( emorragica (colite ( stool (All blood and no Circa il 5% dei casi è complicato dalla Sindrome Emolitico ( SEU ) Uremica

13 Ingestione di E.coli O157 Crampi addominali e diarrea acquosa 1 settimana 1-8 giorni 1-2 giorni Diarrea emorragica 5% SEU 95% Guarigione 60% guarigione 30% insufficienza renale cronica 5% proteinuria 3-5% morte

14 E.coli O157: H7 Principali fattori di virulenza Stx1 e Stx2 Recettore Gb3 o Cd77 Internalizzazione Distruzione dell enterocita Neutrofili Cellule endoteliali renali

15 Epidemiologia di EHEC 344 casi registrati dal 1988 al 2004, secondo dati ENTERNET (ISS) e che si sono presentati con varie sintomatologie: SEU Diarrea Diarrea con sangue Nessun sintomo Sconosciuto 252 casi (73%) 38 casi (11%) 30 casi (8,7%) 19 casi (5,5%) 3 casi (0,87%)

16 Scopo della tesi 1. Verificare la prevalenza di alcune patologie nella popolazione del nostro territorio tramite un indagine epidemiologica retrospettiva della durata di un anno ( 2009 ) 2. Effettuare uno studio sperimentale della durata di 6 mesi (2 semestre 2009), includendo nelle batterie degli esami standard di circa 300 coprocolture diarroico/ematiche, la ricerca del patogeno E.coli O157 per poter valutare la sua diffusione nella popolazione (richiesto da U.O. Igiene degli alimenti, Dipartimento di Prevenzione U.S.L.8 in collaborazione con il Ce.R.R.T.A.)

17 Coprocoltura Coprocoltura standard : coltura per Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, Campylobacter Ricerca di virus enterici Rotavirus e Adenovirus con ( specifica metodi non colturali (dietro richiesta

18 Raccolta del campione Coprocoltura Nei giorni che precedono la coprocoltura non utilizzare lassativi, purghe o supposte per evacuare. Sospendere, secondo quanto prescitto dal proprio medico eventuali terapie antibiotiche Munirsi di un recipiente pulito Deporre le feci nel recipiente o foderare il water di carta igenica Evitare di mescolare feci con urine Raccogliere con il cucchiaio del vasetto ( 4 più campioni sulla superficie delle feci in punti diversi (3 o Portare immediatamente in laboratorio o dopo 24 ore dalla raccolta avendolo conservato in frigo

19 Coprocoltura Tecnica di isolamento su terreno agarizzato Prelevare con l ansa una piccola quantità di feci dal contenitore L area iniziale di semina deve ricoprire una superficie di circa un terzo della piastra Flambare le anse metalliche, sostituire le monouso Scopo della semina è ottenere delle colonie batteriche ben isolate

20 Ricerca di Salmonella e Shigella su Hektoen enteric agar Il terreno contiene: Carboidrati: lattosio, saccarosio e salicina Indicatori di ph: blu di bromotimolo e fucsina acida Agenti selettivi: Sali biliari n 3 Indicatori di H2S: sodio tiosolfato e ferro ammonio citrato Incubazione a 37 C per ore Colonie di Salmonella: verde blu, con o senza centro nero Colonie di Shigella: verde chiaro, il terreno non vira al blu Confermare il risultato con Mucap test, card GN Vitek2 o antisieri anti-salmonella o anti-shigella Ricerca di Yersinia enterocolitica su CIN agar Il terreno contiene: Carboidrati: mannitolo Agenti selettivi: sodio desossicolato, cristal violetto, Irgasan Antibiotici: novobiocina, cefsulodina Incubazione a 37 C per ore Colonie di Yersinia enterocolitica rosso-porpora circondate da un bordo trasparente (colonie ad occhio di bue) Confermare il risultato con card GN Vitek2

21 Ricerca di Campylobacter su Campylobacter selective agar Il terreno contiene: Antibiotici: vancomicina, polimixina B, trimetoprim, cefalotina, amfotericina B Carboidrati: destrosio Peptoni, estratto di lievito Sangue di montone Incubazione a 42 C in microaerofilia per ore Colonie di Campylobacter appaiono mucoidi, di piccole o medie dimensioni, in genere verdastre, piatte con bordi irregolari, non emolitiche Confermare il risultato con card NH Vitek2 Ricerca di E.coli O157 su Mac Conkey Sorbitol Agar (SMAC) Il terreno contiene: Carboidrati: sorbitolo al posto del lattosio Agenti selettivi: Sali biliari n 3, cristal violetto Indicatori di ph: rosso neutro Peptone e sodio cloruro Incubazione a 37 C per ore Colonie di E.coli O157 appaiono chiare (NSF), mucose Confermare il risultato con card GN Vitek2 e E.coli O157 Latex kit

22 Vitek 2 Questo strumento consente: L identificazione sulla base di test biochimici tradizionali di cocchi Gram positivi, di bacilli Gram negativi e dei lieviti Di saggiare, con metodica della microdiluizione in brodo, 32 antibiotici per i cocchi Gram positivi, e 46 per i bacilli Gram negativi

23 E.coli O157 Latex Kit Test rapido di agglutinazione al lattice per verificare la presenza dell antigene somatico/parietale O157 Trasferire una goccia della sospensione di particelle al lattice nella apposita card Prelevare la colonia sospetta Stemperare in una goccia di fisiologica Mescolare le 2 soluzioni Ruotare delicatamente la card Valutare l agglutinazione

24 Risultati Nel corso dell anno 2009 al laboratorio di Microbiologia dell USL8 Ospedale San Donato di Arezzo sono pervenuti 3936 campioni di feci per esami microbiologici; su tutti i campioni è stata eseguita la coprocoltura standard per Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter (S,S,Y,C) secondo il protocollo in uso presso il laboratorio. Dietro richiesta specifica su 111/3936 campioni (2,8%) è stata eseguita, oltre alla coprocoltura standard, la ricerca di Rotavirus e su 1318/3936 campioni (33.5 %) la ricerca di Adenovirus oltre a tutti i precedenti.

25 N di campioni % 33,5% 2,8% 63,7% 100% Microrganismi ricercati S.S.Y.C. Rotavirus Adenovirus S.S.Y.C. Rotavirus S.S.Y.C. Dei campioni analizzati, 294/3936 (7.5%) sono risultati positivi per almeno un microrganismo Percentuale di positività delle coprocolture 7,5% campioni di feci per esami microbiologici risultati negativi per la ricerca di batteri e virus (3642) campioni di feci per esami microbiologici risultati positivi per la ricerca di batteri e virus 92,5% (294)

26 Le positività dei vari microrganismi risultano così distribuite nei 294 campioni Microrganismo Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter Adenovirus Rotavirus Totale Totale numero % 19,4% 0% 3,4% 27,9% 10,9% 38,4% 100% Distribuzione di frequenza per microrganismo 38,4% 19,4% 0,0% 3,4% Salmonella (57) Shigella (0) Yersinia (10) Campylobacter (82) Adenovirus (32) 10,9% 27,9% Rotavirus (113)

27 Frequenza dei vari microrganismi nei campioni Microrganismo Tot. esami Positivi Negativi % Salmonella ,45% Shigella % Yersinia ,25% Campylobacter ,08% Adenovirus ,43% Rotavirus ,90% Totale % 7,90% 8,00% 7,00% 6,00% 5,00% 4,00% 3,00% 2,00% 1,45% 2,08% 2,43% Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter Adenovirus Rotavirus 1,00% 0% 0,25% 0,00% 1

28 0,97% 0% 0,23% 1,80% 2,30% 6,60% 0,00% 1,00% 2,00% 3,00% 4,00% 5,00% 6,00% 7,00% 1 Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter Adenovirus Rotavirus campioni positivi e pazienti positivi (casi) 1,86% Totale 8,86% Rotavirus 3,03% Adenovirus 2,61% Campylobacter 0,33% Yersinia 0% Shigella 1,38% Salmonella % Pazienti positivi Campioni positivi Numero pazienti Numero campioni Microrganismo

29 Distribuzione in base all età (infezioni batteriche 119 ) 26,9% 73,1% bambini con infezioni di tipo batterico (87) adulti con infezioni di tipo batterico (32) Età Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter < 1 anno (4,2%) 1-3 anni 11 (28,9%) 0 6 (66,7%) 31 (43,1%) 4-7 anni 8 (21%) 0 1 (11,1%) 17 (23,6%) 8-10 anni 4 (10,5%) 0 1 (11,1%) 5 (6,9%) Adulti 15 (39,5%) 0 1 (11,1%) 16 (22,2%) Totale 38 (100%) 0 9 (100%) 72 (100%)

30 Distribuzione in base all età (infezioni virali 125 ) 8,8% bambini con infezioni di tipo virale (114) adulti con infezioni di tipo virale (11) 91,2% Età < 1 anno 1-3 anni 4-7 anni 8-10 anni Adulti Totale Adenovirus 3 (10%) 16 (53,3%) 6 (20%) 3 (10%) 2 (6,7%) 30 (100%) Rotavirus 5 (5,3%) 62 (65,3%) 16 (16,8%) 3 (3,2%) 9 (9,4%) 95 (100%)

31 Risultati per E.coli O157 Nel secondo semestre 2009 da 1800 coprocolture totali pervenute al laboratorio di Microbiologia dell USL8 Ospedale S. Donato di Arezzo, circa un sesto (286) sono state selezionate per la ricerca del batterio E. coli O157, anche se non esplicitamente richiesto, e analizzate aggiungendo il terreno selettivo (SMAC) alla batteria standard utilizzata per la coprocoltura Nessuno dei 286 campioni selezionati per la ricerca di E.coli O157 è risultato positivo Sugli stessi campioni sono stati ricercati anche altri microrganismi 6,8% 93,2% campioni risultati negativi per la ricerca di batteri e virus (272) campioni risultati positivi per la ricerca di batteri e virus (14)

32 Le positività per gli altri microrganismi sono così distribuite Microrganismo Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter Adenovirus Rotavirus E.coli O157 Totale Positivi 6 (30%) 0 3 (15%) 4 (20%) 6 (30%) 1 (5%) 0 20 (100%)

33 Discussione L assenza di isolamento di E.coli O157, contrariamente ad altri patogeni, conferma la scarsa diffusione di questo microrganismo nella popolazione. Si consiglia di ricercare tale microrganismo solo in casi fortemente sospetti (diarrea ematica o pazienti con SEU), e quindi sulla base di una richiesta specifica del clinico. In questi casi specifici aggiungere, oltre all esame colturale, anche la ricerca delle tossine specifiche (Stx1, Stx2). Siamo in attesa che il C.e.R.R.T.A. (Centro di Riferimento Regionale per le Tossinfezioni Alimentari) renda noto il risultato dell indagine effettuata nel 2009 fra i laboratori della Regione Toscana relativamente all isolamento dei patogeni legati ad infezioni alimentari, per poter confrontare i dati ottenuti in questo studio con quelli delle altre province.

34 Discussione Elevata frequenza di isolamento di Salmonelle (38) Più frequente agente eziologico associato a MTA: Rotavirus (95) Agente batterico maggiormente isolato: Campylobacter (72) Alcuni isolamenti di Yersinia enterocolitica (9) Confermata l assenza di isolamento di Shigella

35 Grazie per la gentile attenzione Un ringraziamento particolare a tutti i tecnici della U.O. di Microbiologia ed in particolare alla Dr.ssa Irene A. Galanti