Digital PCR: the evolution of PCR.

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1 Digital PCR: the evolution of PCR

2 Digital PCR: the evolution of PCR The rare target may not be amplified by PCR because of competition for reagents from the more abundant DNA

3 Real time PCR vs. digital PCR RNA cdna qpcr In ddpcr (droplet digital PCR) a sigle sample is partitioned in a droplets

4 Droplet digital PCR system

5 Droplet digital PCR system

6 Dropled digital PCR Dropled digital PCR is an analytical technique for quantification of nucleic acid samples based on PCR amplification of single template molecules Partition reagents and sample into droplets Perform PCR on thermal cycler Count droplets with a positive PCR product (fluorescent) and a negative PCR product Digital readout provides concentration of target DNA

7 Dropled digital PCR: emulsion Partition reagents and sample into droplets

8 Making droplets

9 qpcr reaction in the drop

10 Fluorescent molecules used in quantitative real time PCR Emitted light

11 Fluorescent molecules used in quantitative real time PCR

12 Fluorescent molecules used in quantitative real time PCR

13 Assorbance and emission spectra of non-sulfonated cyanidine dyes

14 Read droplets Il software di analisi per la ddpcr applica al dato ottenuto il calcolo statistico della distribuzione di Poisson ed esprime il risultato in numero di copie di templato per ul di reazione (copie/ul), considerando che il volume di reazione che è pari a 20 ul

15 Stima della concentrazione del DNA d interesse Vi è una distribuzione casuale (di eventi indipendenti) delle molecole di DNA (da analizzare) nelle gocce, queste vengono ripartite casualmente durante l emulsione del campione. Producendo un numero sufficientemente elevato di gocce avremo la probabilità queste conterranno una sola molecola di DNA. Il numero di gocce contenenti una molecola di DNA dipenderà dalla concentrazione di DNA del campione Poisson equation: positives -ln(1- ) total counted (positives + negatives) Siméon Denis Poisson ( ) Legge dei piccoli numeri o degli eventi rari

16 Stima della concentrazione del DNA d interesse

17 Stima della concentrazione del DNA d interesse

18 Two analyzed genes using two probes in ddpcr assay

19 Non-invasive detection of trisomy 21 is an effective way for prenatal diagnosis Maternal blood sample and fetal cell free DNA The degree of overrepresentation depends on the fractional fetal DNA concentration in the cfdna. For example, when placental DNA was analyzed, the theoretical proportion of chr21 in the T21 fetal genome should be 0,6. When analyzing a maternal plasma sample containing 3% fetal DNA, the theoretical proportion of chr21 would decrease. Ratio= 50 (chr21 positive wells) 100 (50 chr chr21 positive wells) = 0,5 Ratio= 75 (chr21 positive wells) 125 (50 chr chr21 positive wells) = 0,6

20 Genetic Variants for CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) haplotyping

21 Applications of the droplet digital PCR system Absolute quantification: cancer biomarker studies and copy number variation, Using Droplet Digital PCR for Cancer and Liquid Biopsy Studies Rare mutation detection: measure varying degrees of cancer mutations, detect rare DNA targets, and resolve copy number variation states with superior sensitivity and resolution. Predesigned and wet-lab validated PrimePCR ddpcr assays are now available for mutation and copy number detection. Phasing of Genetic Variants for CFTR haplotyping Rare species detection employ the extreme precision of the (QX200 Bio-rad) system to quantify small fold changes in target DNA or RNA molecules for pathogen detection and monitoring (viral genome in human DNA). Next generation sequencing Single cell analysis Perform quality control and absolute quantification of NGS libraries without the use of a standard curve. Ultra-Sensitive Quantification of Genome Editing Events by Droplet Digital PCR (ddpcr ) Gene expression analysis Achieve reliable and reproducible measurements of small fold changes for low abundance mrnas and mirnas. Environmental monitoring, test a wide variety of environmental samples like soil and water using the (QX200 Biorad) system. Allergen detection in food: food testing Perform routine evaluation of genetically modified organisms (GMOs) using validated ddpcr methods. Linkage analysis

22 Real-time PCR vs. digital PCR Data are absolute, no standard curve needed Directly compare data from different days and with different laboratories Thousands of droplets or replicates result in high precision measurements, no replicate wells needed

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24 Real-time PCR vs. digital PCR Major advantage of real time PCR Well-established protocols and data analysis techniques Wide dynamic range Low per-sample cost High sample throughput Major advantage of digital PCR No reliance of standard curves and reference samples Highly tolerant to inhibitors Simpler workflow for detection of rare targets

25 Le tecnologie omiche

26 Le tecnologie omiche Per tecnologie omiche si intendono quelle applicazioni biotecnologiche che hanno un potere di indagine molecolare esteso all intero potenziale codificante della cellula. Si distinguono: la genomica: che studia tutti i geni di un organismo (NGS; SNP-array) la trascrittomica: si occupa dell'espressione dei geni negli mrna di un intero organismo o di un particolare organo, tessuto o cellula, in momento dello sviluppo dell'organismo o in particolari condizioni ambientali (microarrays: gene expression array; mir-profiling) la proteomica: che si occupa dell'insieme di tutte le proteine di un organismo, tessuto o cellula, con l'obbiettivo di determinarne la sequenza aminoacidica, la funzione, la struttura tridimensionale e le sue interazioni. la metabolomica è una branca della biochimica che si occupa del metabolismo, individuando ad esempio la quantità di diversi metaboliti con raffinate tecniche biochimiche quali la gascromatografia, nonché specifici saggi di attività enzimatica. Sul microchip possono essere immobilizzati: anticorpi, proteine purificate, lisati cellulari la biologia sistemica, si pone quindi come obiettivo lo studio delle interazioni tra le molecole di un intero organismo, considerandolo nella sua totalità, a differenza della tradizionale biologia molecolare che parte dallo studio di singole interazioni. Questa scienza interseca idealmente i dati di genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica.

27 Trascrittomica e utilizzo di microarray Oggi è possibile analizzare l espressione di tutti i geni di una cellula contemporaneamente grazie ai microarray o biochip. Si tratta di piccole lastre di vetro o plastica delle dimensioni di un chip di computer, su cui sono immobilizzate migliaia di sonde molecolari ognuna corrispondente ad una singola sequenza genica, all interno di micropozzetti da 50 µm. Oggi sono disponibili set di microarray che coprono tutta la porzione codificante del genoma umano (90 milioni di sonde).

28 Trascrittomica e utilizzo di microarray Microarray o biochip: Il chip ha una superficie di vetro o silicone piccole sonde di DNA o RNA ancorate alla superficie (10-20 copie, fino a centinaia di migliaia) ciascun gene occupa una determinata posizione sul Chip (spot) il campione in analisi viene amplificato per PCR il campione da analizzare viene marcato con una molecola fluorescente il campione viene caricato sul chip tutti i geni espressi nel campione in analisi ibridizzano con le rispettive sonde specifiche sul chip contemporaneamente la fluorescenza in ciascuno spot del chip, corrispondente a ciascun gene viene rilevata come segnale ed analizzata da un sistema di elaborazione dati Detection Due biochip, uno per l analisi del genoma umano e uno per quella del genoma del topo.

29 Tipi di microarray 1. cdna arrays 2. Oligonucleotidi arrays

30 Trascrittomica e utilizzo di microarray Un applicazione dei microarray è l analisi dell espressione differenziale di geni in due popolazioni cellulari. 1. l mrna è estratto da cellule di controllo (ad es. cellule di un individuo sano) e dal campione sperimentale (es. cellule tumorali). 2. l mrna viene convertito in cdna e marcato con sonde fluorescenti di diverso colore per i controlli (ad es. verde) e i campioni (ad es. rosso).

31 3. i cdna vengono ibridati al microarray. L illuminazione al laser rivelerà segnali rossi o verdi in corrispondenza dei geni espressi solo in ciascuna delle due popolazioni, e gialle (rosso+verde) per quelli espressi in entrambe. Trascrittomica e utilizzo di microarray

32 Trascrittomica e utilizzo di microarray

33 Trascrittomica: analisi dei geni espressi in cellule trattate/controllo

34 Trascrittomica: analisi dei geni espressi in diversi tessuti

35 Trascrittomica: analisi dei geni espressi in cellule neoplastiche di diversi pazienti RNA RNA RNA RNA RNA

36 Trascrittomica: effetti dell inquinamento ambientale sull espressione genica

37 Trascrittomica: analisi dei dati di espressione genica Heatmap, o comparazione quantitativa: Il lettore di fluorescenza compara il livello relativo ai due segnali (rosso-verde) geni espressi egualmente nei due campioni hanno livelli uguali delle due fluorescenze e il loro un rapporto sarà pari a 1 rapporti superiori o inferiori riflettono un espressione differenziale nei due campioni L operatore definisce un soglia di «differenza», un cut-off, secondo il quale valori superiori a tale valore definiscono un espressione differenziale nei due campioni (esempio=2.ma arbitrario) I geni sono riportati più volte sul chip, quindi più spot per ogni gene Oppure ciascun campione almeno in triplicato, per dare valenza statistica, e determinare se le differenze siano quindi significative Utilizzo di analisi statistiche

38 Trascrittomica: analisi dei dati di espressione genica Il test t è un test statistico di tipo parametrico con lo scopo di verificare se il valore medio di una distribuzione si discosta significativamente da un certo valore di riferimento. p = P( X E x E ) Utilizzo di analisi statistiche (non solo il p value0,05 o p0,001) più complicate come metodo SAM (che considera anche la frequenza di eventi falsi positivi e falsi negativi) p value dice se i dati osservati sono statisticamente significativi. Se p0.05, H0 viene, in genere, rifiutata e la discrepanza viene detta statisticamente significativa se 0.01 p0.05; molto significativa se p0.01; estremamente significativa se p0.001.

39 Trascrittomica: problematiche Si assume che ciascun passaggio (estrazione RNA, reazione di retrotrascrizione, PCR, marcatura, ibridazione) abbia la stessa efficienza per ogni gene e per ciascun campione La ripetizione del campione elimina variazioni casuali, ma non eventuali errori sistematici: ad es. gene non amplificato bene per PCR a causa di una competizione dei primers su altri bersagli La stessa concentrazione definita per ciascun mrna bersaglio non indica il livello di trascrizione di quel gene, ma sarà influenzata dalla velocità di sintesi e di degradazione del trascritto stesso, dalla sua stabilità (esempio mrna poco trascritti, ma molto stabili possono essere presenti a livelli più alti rispetto a trascritti meno stabili) Dati da validare con altre tecniche, come RT-PCR quantitativa di singoli geni Verificare la sua traduzione in proteina: proteomica

40 Biologia sistemica

41 Trascrittomica: limiti Vengono analizzati i trascritti, ovvero gli mrnas aventi sequenza nota, dei quali risulta possibile quindi costruire le sequenze probe Non possono essere identificate variazioni nella struttura secondaria nell mrna Non possono essere identificate isoforme di uno stesso mrna Non è un metodo di valutazione assoluta, bensì comparativa Problematiche superate con l RNA-sequencing