MONITORAGGIO DELLA CONTAMINAZIONE DA MICOTOSSINE IN PRODOTTI ALIMENTARI: ATTIVITA DEL POLO ALIMENTI ARPA PUGLIA-BARI

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1 MONITORAGGIO DELLA CONTAMINAZIONE DA MICOTOSSINE IN PRODOTTI ALIMENTARI: ATTIVITA DEL POLO ALIMENTI ARPA PUGLIA-BARI F. Ferrieri; C. Amenduni, N. Battista, A. Brunetti, G. Corte, N. Intini, E. Leonetti, F. Lo Greco, M. Palma, T. Santoro e F. Fiume Polo di Specializzazione Alimenti ARPA Puglia Bari PREMESSA Il presente lavoro riporta i risultati del monitoraggio sulle micotossine condotto nel triennio su campioni presentati al Laboratorio di Bari UOS Chimica degli Alimenti del Polo di Specializzazione Alimenti. Il monitoraggio ha riguardato la ricerca di Aflatossine, Ocratossina A, Deossivalenolo (DON) e Zearalenone (ZEA) ed essenzialmente è stato effettuato su campioni pervenuti nell ambito dei controlli delle merci all importazione da parte dell USMAF (Ufficio di Sanità Marittima, Aerea e di Frontiera), e su campioni prelevati da parte del NAS nell ambito di particolari campagne di monitoraggio. INTRODUZIONE I funghi filamentosi microscopici, comunemente noti come muffe, possono colonizzare le colture in campo, le derrate stoccate in fase post-raccolta ed i prodotti trasformati. In particolari condizioni i funghi appartenenti al genere Aspergillus, Penicillium e Fusarium danno origine, come prodotti del loro metabolismo secondario, a sostanze tossiche per l uomo e per gli animali, note come micotossine. L impianto e lo sviluppo delle muffe è influenzato da un ampio spettro di fattori chimici, fisici e ambientali, avviene sia nella fase di pre- che di post-raccolta e su un numero rilevante di derrate alimentari non solo di origine vegetale, quali cereali e derivati, semi oleaginosi, frutta (uva, mele), spezie, olive, caffè, vino, birra, frutta secca ed essiccata (fichi, arachidi, pistacchi), ma anche di origine animale quali formaggi e insaccati. 1

2 La presenza di micotossine in un alimento come risultato della crescita fungina e della produzione di tossina direttamente sulla derrata alimentare viene comunemente indicata come contaminazione diretta. Negli alimenti di origine animale, invece, la presenza delle micotossine o dei loro metaboliti prodotti dall animale stesso, è causa del carry over derivante dai mangimi nelle cui formulazioni gli ingredienti di base sono di solito costituiti dalle parti esterne dei cereali che sono spesso quelle maggiormente contaminate. In questo caso si parla di contaminazione indiretta. I principali fattori che favoriscono la proliferazione fungina e la produzione di micotossine sono: elevate escursioni termiche nel periodo di maturazione delle piante, forti precipitazioni al momento della raccolta, presenza di parassiti, stress idrici delle piante parassitate, errate lavorazioni ed errori durante lo stoccaggio, la conservazione e la miscelazione. La formazione di muffe e micotossine può avvenire anche nella conservazione casalinga, in frigo o a temperatura ambiente. La presenza di funghi tossigeni in un alimento non indica automaticamente la presenza di micotossine, così come l' assenza dei funghi non significa assenza di micotossine, dal momento che queste possono persistere nell' alimento anche dopo che la muffa ha cessato il suo ciclo vitale o è stata rimossa dalle operazioni tecnologiche di lavorazione. Come si può ridurre il rischio? Esistono alcune strategie che permettono di eliminare o ridurre le micotossine negli alimenti e nei mangimi e che sono riconducibili a: metodi di natura fisica, come l' irraggiamento solare e con microonde; di natura chimica, come il trattamento con bisolfito o l' uso di ammoniaca (vietati in Europa); di natura biologica, come l' uso di microrganismi antagonisti. Ma questi trattamenti non vengono eseguiti su larga scala o perché economicamente improponibili o perché non ancora studiati a sufficienza. Un sistema di prevenzione della contaminazione da muffe e micotossine può essere rappresentato dalla coltivazione di alcune tipologie di piante OGM. Non sono invece molti i processi tecnologici di lavorazione degli alimenti in grado di ridurre le tossine eventualmente presenti nella materia prima. Fra le poche: la raffinazione degli oli, la tostatura spinta del caffè (come quella in uso in Italia), la molitura dei cereali, che porta ad un impoverimento di micotossine nelle frazioni più interne del chicco e alla concentrazione nelle parti più esterne (crusca) in quanto le micotossine risultano in genere più concentrate nella parte esterna dei chicchi. La cottura casalinga, invece, generalmente non ha effetti significativi sulla riduzione delle tossine. 2

3 I PRINCIPALI GRUPPI DI MICOTOSSINE Il numero delle micotossine note e studiate è andato crescendo negli ultimi anni. Attualmente sono conosciute più di 300 molecole, ma i reali pericoli per l uomo e per gli animali d allevamento provengono da circa composti. Sono sostanze che presentano tossicità croniche e raramente acute; presentano basso peso molecolare; sono termostabili; sono ubiquitariamente presenti sul territorio; sono fortemente caratterizzate da una incidenza di contaminazione stagionale; presentano una tipologia di contaminazione eterogenea, a macchia di leopardo. A causa della loro enorme diversità strutturale, la gamma degli effetti indesiderati indotti da questi metaboliti tossici è molto diversificata. Possono avere un azione genotossica (in grado di danneggiare il DNA), cancerogena (sono capaci di provocare il cancro), mutagena (possono agire sui cromosomi alterandone l informazione genetica) e teratogena (provocano anomalie del feto). Possono essere classificate, in considerazione dei processi metabolici o dei recettori più vulnerabili nei vari organi umani e animali, anche come epatossine, nefrotossine, neurotossine, immunotossine e dermatossine. Di seguito vengono brevemente riportate alcune informazioni riguardanti quelle micotossine che, per i loro effetti, sono all attenzione della Comunità scientifica e delle Autorità governative e sanitarie. Le Aflatossine B1, B2, G1 e G2 sono le più pericolose per la salute umana. Sono prodotte dalle specie Aspergillus Flavus (B1, B2) e Aspergillus parasiticus (B1, B2, G1 e G2) e rappresentano agenti di contaminazione di frutta secca ed essiccata, semi oleaginosi, cereali, spezie e prodotti derivati. Il prodotto di idrossilazione metabolica della B1 è l Aflatossina M1 che può essere rintracciata nel latte e nei prodotti caseari provenienti da animali che hanno consumato alimenti inquinati dall aflatossina B1 (è stata rinvenuta anche in campioni di latte umano!). Di norma le contaminazioni degli alimenti con aflatossine si verificano principalmente nelle zone a climi caldi e umidi. Sono le micotossine più pericolose per la salute umana ed animale, classificate dallo IARC, l Agenzia Internazionale per la Ricerca contro il Cancro, come accertati cancerogeni per l uomo (Gruppo B1). Per la loro elevata tossicità non è possibile stabilire una soglia massima di assunzione con la dieta e pertanto, per il principio tossicologico di mantenere il livello il più basso possibile, il legislatore ha ritenuto opportuno fissare i limiti sul contenuto 3

4 complessivo di aflatossine (somma delle B1, B2, G1 e G2), su quello della sola aflatossina B1 che è quella di gran lunga più tossica in quanto genotossica, immunosoppressore ed epatotossica, e sulla aflatossina M1, per gli alimenti destinati a lattanti e bambini. L Ocratossina A (OTA) viene biosintetizzata da funghi del genere Aspergillus e da Penicillium che sono ubiquitari e rappresentano agenti di ammuffimento di diverse matrici alimentari. Gli alimenti maggiormente suscettibili alla contaminazione da OTA sono: cereali (grano, orzo, mais, avena), preparati di cereali, frutta, frutta secca (uvetta), caffè, cacao, spezie, liquirizia, vino, birra. Si rinviene anche nei prodotti derivati da animali perché trasferita dai mangimi, ed è perfino rintracciabile nel sangue umano! Gli effetti negativi dell OTA sulla salute umana sono ormai noti e riportati in letteratura: è una potente nefrotossina per tutte le specie animali testate, ad eccezione dei ruminanti adulti; è cancerogena per i roditori e provoca effetti teratogeni, immunotossici, e probabilmente anche neurotossici e genotossici. Nel 1993 lo IARC l ha classificata come un possibile cancerogeno per l uomo e sicuramente per gli animali (Gruppo B2). Un parere scientifico espresso, su richiesta della Commissione Europea, da parte di un gruppo di esperti dell EFSA (European Food Security Authority) sui contaminanti nella catena alimentare, fu adottato, in data 4 aprile 2006 e, aggiornato alla luce dei nuovi dati scientifici, stabiliva una dose settimanale tollerabile (TWI-tolerable weekly intake) pari a 120 ng/kg di peso corporeo. Sulla base di questi pareri sulla tossicità dell OTA, la normativa ha stabilito i tenori massimi su diversi prodotti alimentari (cereali, caffè, vini, succhi d uva, spezie, alimenti per l infanzia, liquirizia) che contribuiscono in misura significativa all esposizione all OTA della popolazione umana in generale o di gruppi vulnerabili di consumatori, quali i bambini. Lo Zearalenone (ZEA) è una micotossina prodotta da miceti del genere Fusarium. I ceppi tossigeni iniziano la loro attività in campo e possono proseguirla anche nei silos. Lo ZEA si ritrova nei cereali e in particolare nel mais. Possiede spiccati effetti estrogenici determinando alterazioni nei cicli riproduttivi degli animali, ipofertilità e fenomeni di pubertà precoce. Nel 2000, in seguito all adozione di una serie di pareri scientifici, è stato fissata una dose giornaliera tollerabile temporanea (TDI-tolerable daily- intake) pari a 0,2 µg/kg di peso corporeo. Lo IARC ha classificato lo ZEA nel Gruppo 3, cioè non classificabile come agente cancerogeno per l uomo. 4

5 I Tricoteceni, tra cui la tossina T-2, HT-2, il Deossivalenolo (DON), Nivalenolo (NIV), sono un gruppo costituito da almeno 70 metaboliti prodotti da diversi generi fungini; i più importanti da un punto di vista tossicologico sono quelli sintetizzati da Fusarium. Sono funghi tipici di climi nordici che crescono soprattutto in campo ma, in condizioni di umidità superiori a 20-22%, le tossine possono essere prodotte anche dopo la raccolta, durante lo stoccaggio. I prodotti maggiormente contaminati da tricoteceni sono: frumento, orzo, avena, segale e mais e prodotti da essi derivati. Hanno effetti immunosoppressori, dermatotossici ed emorragici. Tra essi, la tossina più studiata, anche se quella con una minore tossicità acuta, è il DON in quanto riscontrabile negli alimenti in modo più diffuso. Sull uomo provoca nausea, vomito, disordini gastrointestinali e cefalea. Nel 2002 il Comitato Scientifico per l Alimentazione (SCF) ha stabilito per il DON una assunzione massima giornaliera (TDI) di 1 µg/kg di peso corporeo, per il NIV 0,7 µg/kg di peso corporeo e per le tossine T-2 e HT-2 0,06 µg/kg di peso corporeo. Nel 1993 lo IARC ha classificato il DON nel Gruppo 3. La Patulina è una micotossina prodotta da funghi dei generi Penicillium, Aspergillus e Byssochlamis. Sebbene si possa trovare in molti frutti ammuffiti, cereali, ortaggi ed altri alimenti, le fonti principali di contaminazione sono le mele e i prodotti derivati. E relativamente termostabile, particolarmente a bassi ph. E riconosciuta come genotossica e nel 2000 l SFC ha approvato la massima dose giornaliera tollerabile provvisoria (PMTDI- provisional maximum tolerable dailyintake) della patulina fissandola a 0,4 µg/kg di peso corporeo. Nel 1993 lo IARC ha classificato la patulina nel Gruppo 3. ALCUNE INFORMAZIONI SULLA CONTAMINAZIONE DA MICOTOSSINE Già dal 1985 la FAO (Organizzazione per l Alimentazione e l Agricoltura) stimava che nel mondo circa il 25% delle derrate alimentari erano contaminate da micotossine A causa dell elevata tossicità di alcune di esse, le Autorità competenti di molti paesi annoverano le contaminazioni da micotossine tra le principali priorità in tema di sicurezza alimentare. Esse rappresentano attualmente uno degli aspetti più rilevanti e preoccupanti delle contaminazioni chimiche di alimenti e bevande: a livello nazionale ed europeo costituiscono la categoria di contaminanti chimici con il più alto numero di non conformità, come si registra da 5

6 diversi anni e come rivela la recente relazione sul Sistema di Allerta Comunitario 2010 della Direzione Generale della Sicurezza degli Alimenti e della Nutrizione Ministero della Salute. Il dato evidente, infatti, è quello per cui le micotossine risultano come i contaminanti chimici più frequentemente notificati attraverso il RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) che è il sistema in vigore all interno della Comunità Europea a cui partecipano la Commissione Europea, l EFSA( Autorità per la sicurezza alimentare) e gli Stati membri dell Unione, la cui base legale è il Reg. CE 178/2002 che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare ed individua la procedura da seguire per ottenere una sempre maggiore sicurezza alimentare. Il RASFF notifica sia le allerte (alert notificatios) che riguardano gli alimenti già presenti sul mercato per i quali è necessario intraprendere azioni immediate, sia le semplici informazioni (information notifications), pubblicate settimanalmente dalla Commissione Europea, che riguardano invece gli alimenti che non hanno ancora raggiunto i mercati o sono già sottoposti a misure di controllo. In caso di allerta, i paesi produttori, distributori o che smerciano i prodotti allertati vengono tempestivamente informati dalla Comunità Europea. La maggior parte delle notifiche nel 2010, come negli anni scorsi, ha dunque riguardato le micotossine: il 95,3% di esse ha riguardato le aflatossine ed il 4% le ocratossine. Il più alto numero di segnalazioni si riferisce alla frutta secca (quasi 500!), seguita dalle spezie (125) e dai cereali (27). Sull Ocratossina A nel vino, indagini e studi condotti a livello europeo iniziarono a partire dalla metà degli anni 90. Il risultato è che il vino spesso contiene quantità significative di OTA, fino a 10 µg/l: soprattutto i vini rossi e soprattutto quelli prodotti nel bacino Mediterraneo dove le uve provengono da vigneti prospicienti il mare, in zone dal clima caldo umido, condizione favorevole per la crescita fungina. Nel 1998 il Codex Alimentarius Commission, l Organismo internazionale che fissa i parametri di sicurezza dei contaminanti alimentari, effettuava una ricerca sul diverso contenuto di OTA nei cibi da cui emergeva che con il vino si assume il 15% della quantità totale. Nel 2002 il Report EU 2002 sulla valutazione dell assunzione di OTA nella dieta della popolazione degli Stati Membri, evidenziava che i cereali sono in prima posizione (50%), seguiti dal vino (13%), caffè (10%), spezie (8%), birra (5%), cacao (4%), frutta secca (3%) 6

7 Nel 2005 uno studio condotto sulle principali cause di tumori dall oncologo U. Veronesi, una delle massime autorità italiane nel campo della ricerca oncologica, evidenziava che all alimentazione si può imputare il 30% dei tumori, mentre all inquinamento urbano dall 1 al 4%. La sua affermazione: fa più male la polenta dello smog, si riferiva alle ricerche condotte dall Università Cattolica di Piacenza che riguardavano un monitoraggio effettuato su campioni di farina di mais prelevati nei mesi successivi all estate 2003, quando un clima eccezionalmente caldo si registrò per settimane in tutta la penisola e favorì la contaminazione da aflatossina: sul 25% dei campioni si riscontrò una concentrazione di aflatossina B 1 che superava il limite di legge europeo. NORMATIVA La normativa relativa alle micotossine risulta molto complessa ed in continua evoluzione. La prima normativa europea sui limiti delle micotossine fu emanata con il Reg. CE 1525/98, in ritardo rispetto alle ricerche sperimentali. Tale Regolamento non era però completo, ad es. non venivano riportati i limiti per l OTA nell uva e prodotti derivati, per cui in Italia, una delle nazioni più attente al problema micotossine, il Ministero della Sanità intervenne con la Circolare n. 10 del 09/06/1999 sopperendo parzialmente all incompletezza del suddetto Regolamento e tale normativa italiana fu adottata nel 2001 dall UE. Progressivamente l UE emanava nuovi Regolamenti (Reg. CE 466/01 modificato poi dal Reg. CE 123/05) con pacchetti di limiti massimi ammissibili sempre più completi, in molti alimenti e per le principali micotossine. Attualmente il panorama legislativo è abbastanza completo ed in Italia alcune disposizioni esistenti a livello nazionale sono state aggiornate al fine di eliminare disarmonie. Infatti la recente Circolare del Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche sociali del 10/12/2009, in seguito ad una specifica valutazione dell Istituto Superiore di Sanità circa l esposizione all OTA che indicava che non sussistono rischi per la salute del consumatore italiano derivanti dal consumo di cacao e di prodotti derivati, ha abrogato, in allineamento con l Unione europea, i tenori massimi di OTA nel cacao e derivati che, la normativa comunitaria non prevede, mentre in Italia erano stati fissati dalla Circolare Ministero della Salute n. 6 del 28/11/2003. Ciò nelle more dell emanazione di una prossima normativa comunitaria. La normativa attualmente vigente che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari è il Reg. CE 1881/2006 del 19/12/2006 (Parte 2). 7

8 Oltre alle micotossine tale Regolamento fissa i limiti per i seguenti contaminanti: nitrati (Parte 1), piombo, cadmio, mercurio, stagno (Parte 3), 3-monocloro-1,2-propandiolo (Parte 4), diossine e PCB (Parte 5) e benzo(a)pirene (Parte 6). Il Reg. 1881/06 ha subito sei modifiche, tre delle quali hanno riguardato le micotossine: Reg. CE 1126/07 (aggiornamento dei limiti per le Fusarium tossine nel granoturco e prodotti derivati) Reg. UE 105/2010 (introduzione del limite per l OTA su spezie e liquirizia) Reg. UE 165/2010 (introduzione dei limiti per le aflatossine su semi oleosi e innalzamento dei limiti su mandorle, pistacchi, semi di albicocche, nocciole e noci del Brasile). E necessario, nel tempo, rivedere e quindi modificare alcuni tenori massimi di micotossine in determinati prodotti alimentari per tener conto degli sviluppi nel Codex Alimentarius, delle indicazioni di gruppi di esperti scientifici sui contaminanti nella catena alimentare (CONTAM) dell Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) e alla luce di nuove informazioni contenute in recenti pareri scientifici. Inoltre, in seguito a nuove prassi di produzione non sempre è possibile mantenere i tenori di alcuni contaminanti ad un livello tanto basso quanto richiesto dalla normativa in vigore. I limiti di legge europei, comunque, sono del tutto precauzionali in quanto i livelli di tossicità effettivi sono di gran lunga superori. Particolarmente restrittivi sono, ovviamente, i limiti di legge per prodotti destinati a gruppi vulnerabili di persone quali il baby food e gli alimenti dietetici. Anche le metodologie riguardanti il campionamento sono state armonizzate a livello comunitario. Il prelievo dei campioni, infatti, svolge un ruolo molto importante nella determinazione accurata dei tenori di micotossine, analiti distribuiti in modo eterogeneo in una partita. Da qui la necessità di stabilire i criteri generali ai quali devono essere conformi i metodi di campionamento. La normativa vigente relativa ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari è il Reg. CE 401/2006 del 23/02/2006. Tale Regolamento riportata anche i criteri per esprimere la conformità di un campione. E un testo unico che ha abrogato tutte le precedenti Direttive, ciascuna riguardante una singola micotossina. E stato recentemente modificato con il Reg. UE 178/201, in alcune Parti in cui si articola l Allegato I: ogni Parte si riferisce ad una specifica matrice alimentare. 8

9 Per ogni matrice vengono riportate le disposizioni sul metodo di campionamento di prodotti commercializzati sfusi, in contenitori, in imballaggi singoli (sacchi, confezioni al dettaglio ). Nelle tabelle riepilogative sono riportate, in corrispondenza del peso della partita, le indicazioni sul numero e il peso dei campioni elementari da prelevare e mescolare per formare il campione globale che deve essere inviato al laboratorio di analisi per le operazioni di omogeneizzazione e le successive determinazioni analitiche. IL NOSTRO PERCORSO NELLA RICERCA DELLE MICOTOSSINE La ricerca delle Aflatossine e dell Ocratossina è iniziata, nel laboratorio di Bari, sin dalla fine degli anni 90. Veniva successivamente interrotta per problematiche legate a scarsa disponibilità di risorse umane e strumentali. Nel frattempo la normativa in materia di micotossine subiva notevoli modificazioni sulla base di informazioni rinvenenti da nuovi studi e dai vari pareri scientifici. Venivano pertanto adottati nuovi Regolamenti e Direttive, poi abrogati e/o modificati, sia relativi a metodi di campionamento ed analisi per il controllo ufficiale, sia relativi ai tenori massimi che man mano venivano introdotti, rivisti e modificati per i vari prodotti alimentari. Nel 2006 sono stati finalmente adottati e sono ancora in vigore, i due Regolamenti fondamentali sopra citati: il Reg. CE 1881/2006 e succ. mod. (riguardante i tenori massimi) e il Reg. CE 401/2006 e succ. mod. (riguardante i metodi di campionamento e analisi). Quest ultimo stabilisce, relativamente ai metodi di analisi utilizzati dai laboratori preposti al controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari, sia prescrizioni generali che prescrizioni specifiche. Le prime stabiliscono che i metodi analitici devono essere conformi alle disposizioni dei punti 1 e 2 dell Allegato III del Reg. CE n. 882/2004, ossia devono essere caratterizzati da criteri quali: esattezza, LOD, LOQ, ripetibilità, recupero, linearità Le prescrizioni specifiche: stabiliscono, per ogni singola micotossina, che i metodi da utilizzare debbano rispettare determinati criteri di rendimento in termini di Recupero, RSD r, RSD R. Il laboratorio chimico ARPA Puglia di Bari, alla luce delle nuove normative e di quanto prescritto, ed in seguito alle innumerevoli richieste che pervenivano soprattutto dall USMAF per il controllo sulle merci importate, riprendeva nel 2006 la ricerca delle micotossine in collaborazione con ISPA-CNR (Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari) con cui veniva stipulata una convenzione, nell attesa di un potenziamento dell organico e dell apparato strumentale. 9

10 Fino al 2009 la ricerca di micotossine sono state richieste soprattutto dall USMAF e sulle merci di importazione. Il grano è stata la matrice più monitorata, e su tutti i campioni di cereali sono stati ricercati anche DON e ZEA oltre che l OTA e Aflatossine. Nel 2010, scaduta la convenzione con ISPA-CNR ed in seguito all avvio della fase di potenziamento dell organico dell ARPA Puglia e in particolare del Laboratorio Chimico di Bari, l UOS Chimica degli Alimenti del Polo di Specializzazione Alimenti di Bari ha ripreso ad effettuare in maniera autonoma e come prescritto dalla normativa vigente, le indagini analitiche sull Ocratossina A e sulle Aflatossine. Su richiesta dell Assessorato alle Politiche della Salute a seguito delle segnalazioni in merito alle difficoltà riscontrate nell individuazione di corrette procedure di campionamento, molto spesso complesse, il laboratorio chimico di Bari è stato anche protagonista nell avvio della formazione degli operatori sanitari addetti ai prelievi per l esecuzione dei programmi ufficiali. Al fine di potenziare il controllo ufficiale su alimenti e bevande, oltre che agevolare i traffici commerciali di derrate alimentari attraverso i porti regionali, l Assessorato alle Politiche della Salute e ARPA Puglia hanno condiviso un percorso programmatico con una stima di fabbisogno analitico in base al quale l ARPA si impegna e stabilisce come obiettivo per l anno 2011, l accreditamento delle Aflatossine e dell Ocratossina nelle varie matrici alimentari. Sono stati pertanto avviati, nell Unità Operativa Chimica del Polo di Specializzazione Alimenti di Bari, tutti quei percorsi volti ad assicurare l affidabilità dei dati analitici: qualificazione del personale tecnico, validazione dei metodi di analisi, stesura delle procedure di dettaglio, elaborazioni statistiche dei dati ottenuti, partecipazione a circuiti interconfronto, Attualmente la ricerca delle Aflatossine e dell Ocratossina A viene eseguita solo sui campioni prelevati ai sensi del Reg. CE 401/2006 e succ. mod. I METODI DI ANALISI Il laboratorio chimico del Polo di Specializzazione di Bari opera con un sistema di gestione della qualità conforme alla norma UNI CEI EN ISO/IEC Le determinazioni delle micotossine nelle varie matrici vengono effettuate utilizzando i seguenti metodi Per l Ocratossina A nel vino e nella birra: UNI EN 14133:2009; Per l Ocratossina A nei cereali: estensione metodo UNI EN 14132:2003; Per l Aflatossina B 1 e della somma di aflatossina B 1, B 2, G 1, G 2 nei cereali: UNI EN 12955:1999; 10

11 Per l Aflatossina B 1 e della somma di aflatossina B 1, B 2, G 1, G 2 in nocciole, nella crema di arachidi, in pistacchi, in fichi e nella paprica in polvere: UNI EN 14123:2007. Essi prevedono: una fase di preparazione del campione, una fase di estrazione, la purificazione con colonnine di immunoaffinità e l analisi strumentale con cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) a fasi inverse e rivelazione spettrofluorimetrica. I metodi che sono stati validati e sono in attesa di accreditamento da parte di ACCREDIA, soddisfano le prescrizioni generali relative ai criteri previsti dal Regolamento CE 882/2004 (All. III), nonché le prescrizioni specifiche stabilite dal Reg. CE 401/ punto (a) e (b) dell All II, riguardanti il rispetto dei criteri di rendimento del metodo analitico (RSD r %, RSD R % e recupero) per le Aflatossine e l Ocratossina A. La validazione è stata condotta su campioni sia fortificati che naturalmente contaminati, ed è stata verificata la compatibilità con i dati di precisione riportati nelle suddette norme. Il laboratorio partecipa regolarmente a circuiti interlaboratoriali sull Ocratossina A. Il risultato analitico per ciascun campione viene riportato in forma corretta per il recupero ed associato all incertezza estesa di misura, così come previsto dal Reg. CE 401/2006 (punto 4.4 dell All II). L incertezza estesa viene ottenuta moltiplicando per un fattore 2 il valore dell incertezza composta che viene calcolata utilizzato l approccio di Horwitz modificato (Thompson), avendo il laboratorio verificato, in sede di validazione, che il rapporto di HORRAT rientra nella fascia di Horwitz. L incertezza estesa è indispensabile ai fini della valutazione di conformità del dato analitico rispetto ai limiti fissati dal Reg. CE 1881/2006. RISULTATI DEL MONITORAGGIO Nel triennio sono state effettuate 1858 determinazioni di micotossine. L attività analitica dei primi due anni comprende anche quella svolta in collaborazione con ISPA-CNR. Come si evince dalla Fig. 1, il maggior numero di determinazioni (51,7%) ha riguardato la ricerca di Aflatossine B 1, B 2, G 1, G 2 ; la normativa, su diversi prodotti alimentari, fissa il tenore massimo per la B 1 e per le totali. Le aflatossine sono state ricercate su cereali (grano, pasta, prodotti della macinazione) e sulla frutta a guscio (arachidi, mandorle, noccioli di albicocca). Il 23,6% delle determinazioni ha riguardato la ricerca di Ocratossina A effettuata su cereali, caffè e vino. DON e ZEA costituiscono ciascuno il 12,4% delle determinazioni e sono state ricercate sui cereali. 11

12 Fig. 1: Distribuzione delle determinazioni di micotossine In Fig. 2 è riportata la distribuzione delle matrici su cui è stata effettuata la ricerca delle micotossine. Le tipologie di alimenti maggiormente monitorate sono stati i cereali (51,3%) e i vini (44,6%). La frutta a guscio è stata monitorata per il 2,2%, mentre il caffè costituisce l 1,8% dei campioni analizzati per la ricerca delle micotossine. Fig. 2: Distribuzione delle tipologie di alimenti monitorati 12

13 Cereali Più del 95% dei cereali analizzati è costituito da grano di varia provenienza (soprattutto proveniente da Australia Canada, Kazakistan, Russia e USA: Fig. 3); il campionamento è stato effettuato principalmente dall USMAF (73%) ai punti di entrata nel territorio nazionale o effettuato a destinazione, sempre per conto dell USMAF, dal personale appartenente ai Servizi delle AA.SS.LL. (37%). Fig. 3: Paesi di provenienza dei campioni di grano Sui cereali è stata effettuata la ricerca di quelle micotossine per le quali sono previsti i tenori massimi dalla normativa: Ocratossina A, Aflatossina B 1 e Totali, Deossivalenolo (DON) e Zearalenone (ZEA). Il 26,5% dei campioni di cereali analizzati è risultato naturalmente contaminato da OTA, il 19,6% da DON, 1,7% da aflatossina B1 e lo 0,4%, è risultato naturalmente contaminato da ZEA(Fig. 4). 13

14 Fig. 4: Distribuzione della contaminazione nei campioni di cereali Tra i campioni di cereali naturalmente contaminati da OTA, il 73,7% presenta comunque livelli di contaminazione inferiore a 2 µg/kg. Si tratta di grano non trasformato per il quale la normativa fissa come tenore massimo di OTA un valore di 5 µg/kg. I campioni con più alti livelli di contaminazione sono risultati quelli provenienti dal Canada (fino a 4,9 µg/kg) e dalla Grecia (fino a 4,4 µg/kg); nessun campione ha presentato valore superiore al tenore massimo fissato. Tra i campioni di cereali contaminati da DON sono stati riscontrati livelli di contaminazione fino a 600 µg/kg. La provenienza dei campioni di grano più contaminati da DON è risultata la Croazia e il Canada. Presenza di DON è stata riscontrata anche in alcuni prodotti della macinazione quali semole e farine. La normativa UE fissa un limite per il DON di: 500 µg/kg per il pane, prodotti da forno e cereali da colazione; 750 µg/kg per prodotti della macinazione e paste; 1750 µg/kg per il grano duro non trasformato. Nessun campione è risultato non conforme per la presenza di DON superiore ai tenori massimi fissati. La contaminazione da Aflatossina B 1 nei campioni di cereali analizzati è stata riscontrata a livelli molto bassi, al massimo 0,2 µg/kg: tutti i campioni i contaminati provenivano dalla Russia. La normativa fissa per tutti i cereali e loro prodotti derivati, compresi i prodotti trasformati a base di cereali, un limite per la B 1 2 µg/kg e per le Aflatossine totali un limite di 4 µg/kg. 14

15 Vini Sui campioni di vino è stata ricercata l Ocratossina A per la quale la normativa fissa come tenore massimo ammissibile 2 µg/l. Oltre all OTA, sono stati ricercati tutti quei parametri che da tempo vengono determinati di routine sul vino: residui di fitofarmaci, piombo, metanolo, solfiti, titolo alcolometrico, acidità totale, ph. La distribuzione tra rossi, bianchi e rosati dei campioni di vino analizzati è quella riportata nella Fig. 5 in cui risulta che i vini rossi sono quelli maggiormente monitorati (54%). Fig. 5: Distribuzione tipologia dei vini analizzati per la ricerca di OTA L 85% dei campioni di vino su cui è stata ricercata l OTA, sono stati campionati nel 2010, sopratutto dal NAS (BA e FG), nell ambito di un attività di monitoraggio su vini nazionali, pianificata dal Comando dei Carabinieri per la Tutela della Salute di Roma e finalizzata al rintraccio di vini sofisticati e/o contaminati. Più dell 80% dei campioni analizzati era costituito da vini di produzione pugliese (Foggia, Nord Barese, Sud Barese, Lecce, Taranto); il resto proveniva da altre regioni di Italia (Basilicata, Campania, Sicilia, Emilia, Lazio, Lombardia, Piemonte, Valle d Aosta, Veneto). Un campione di vino era di origine spagnola. Il 52.8% dei campioni analizzati è risultato naturalmente contaminato da OTA ossia con livelli di OTA superiori ai limiti di quantificazione (LOQ=0,1 µg/l ). 15

16 Fig. 6: Distribuzione della contaminazione da OTA sul totale dei campioni di vino E interessante notare come varia la distribuzione della contaminazione per ogni tipologia: i vini rossi analizzati sono risultati contaminati al 70,9%; la percentuale di contaminazione nei rosati risulta più bassa (52,4%) ed ancora più bassa nei vini bianchi (23,1%) (Fig. 7a-7b-7c). Fig. 7a: Distribuzione della contaminazione sui vini rossi Fig. 7b: Distribuzione della contaminazione sui vini rosati Fig. 7c: Distribuzione della contaminazione sui vini bianchi La distribuzione dei livelli di contaminazione è riportata in Fig.8. Nella maggior parte dei vini naturalmente contaminati sono stati riscontrati livelli di OTA inferiore a 0,5 µg/l. Più dell 80% dei campioni con livelli di contaminazione superiore a 0,5 µg/l sono vini rossi. 16

17 Fig. 8: Distribuzione dei livelli di contaminazione nei campioni di vino Il 3.6% dei campioni naturalmente contaminati ha presentato livelli di OTA superiore al limite di legge di 2µg/l; in tutti questi casi l intervallo di concentrazione fornito dall incertezza di misura abbracciava il limite di legge pertanto ritenuti conformi, in base a quanto indicato nel punto H.3. del Reg. CE 401/2006 secondo cui: un campione viene ritenuto non conforme se il valore riscontrato supera il limite massimo oltre ogni ragionevole dubbio, tenendo conto dell incertezza di misura. Frutta a guscio Limitato è stato il numero dei campioni di frutta a guscio monitorati per la ricerca di micotossine: solo il 2,2%. Sono state ricercate le Aflatossine così come prevede la normativa che fissa il limite per B 1 e per le totali. I limiti di legge variano con la tipologia di frutta a guscio e, per la stessa matrice, sono diversi a seconda che il prodotto debba subire trasformazione, oppure sia destinato al consumo umano diretto. Per la B 1 i tenori massimi vanno da 2 µg/kg fino a 12 µg/kg (per mandorle, pistacchi e semi di albicocca da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico); per le aflatossine totali i tenori massimi arrivano a 15 µg/kg. 17

18 E dunque importante, al momento del campionamento, reperire tutte le informazioni relative alla destinazione d uso in modo da applicare correttamente i tenori massimi e poter esprimere un altrettanto corretto giudizio di conformità. In assenza di una chiara indicazione attestante la destinazione d uso, la normativa (Reg. CE 1881/06, art. 5) prevede che vengano applicati i tenori massimi più restrittivi, ossia quelli previsti per i prodotti destinati al consumo umano diretto. Sebbene limitato il numero dei campioni di frutta a guscio monitorati, il 40% è risultato naturalmente contaminato da aflatossine ed è in questa categoria che sono state riscontrati campioni con valori di aflatossine di gran lunga superiori ai limiti di legge: il 20% dei campioni analizzati! Una delle non conformità riscontrate si riferisce ad un campione di arachidi sgusciate provenienti dalla Cina, destinate ad essere sottoposte a cernita o ad altro trattamento fisico: su uno dei due campioni di laboratorio in cui venne suddiviso il campione globale fu riscontrato un tenore di B 1 5 volte superiore al tenore massimo! Un altro caso di superamento del limite massimo si riferisce ad un campione di mandorle amare sgusciate provenienti dall India destinate a subire trasformazione prima del consumo. Su uno dei tre campioni di laboratorio fu riscontrato un valore di B 1 4 volte superiore al limite di legge. Furono adottati dal Laboratorio gli adempimenti del caso. Caffè Una piccola percentuale di campioni monitorati (1,8%) è costituita da caffè in cui è stata ricercata l OTA. Il 12.5% dei campioni analizzati è risultato naturalmente contaminato ma con livelli non superiori a 0,5 µg/kg. Si tratta di caffè torrefatto il cui limite di legge fissato dalla normativa europea è di 5 µg/kg. Un campione era costituito da caffè crudo proveniente dal Messico e presentato dall USMAF. In questo caso, non essendo previsto il limite comunitario è stato preso come valore guida pari a 8,0 µg/kg, quello stabilito dalla normativa nazionale, la Circolare n. 10 del 09/06/1999 che, sebbene superata, resta in vigore per quelle matrici o quelle micotossine non contemplate nel Regolamento CE. CONSIDERAZIONI FINALI Dalle informazioni acquisite da studi ed indagini condotte altrove, dai risultati ottenuti dal nostro monitoraggio relativo al periodo e alla luce delle problematiche già riportate in letteratura ed emerse dalla nostra esperienza, è possibile evidenziare i seguenti punti: 18

19 Per quanto riguarda la contaminazione da Aflatossine, il nostro monitoraggio è in linea con quanto riscontrato a livello nazionale e comunitario e notificato attraverso il RASFF: la matrice con più alti livelli di contaminazione, anche al di sopra dei limiti di legge, è rappresentata dalla frutta a guscio. Relativamente alla contaminazione da Ocratossina A è emerso che è la micotossina maggiormente riscontrabile nei cereali e che nei vini è largamente diffusa, soprattutto nei rossi che presentano i più alti livelli di contaminazione Il DON è risultato essere, tra le micotossine presenti nei cereali, abbastanza diffusa dopo l OTA. Sarebbe interessante estendere la ricerca a tutti quei prodotti da forno di largo consumo quali il pane, i prodotti della pasticceria e biscotteria, i cereali da colazione che, come riportano molti lavori svolti altrove, risultano largamente contaminati. Gli studi condotti finora hanno evidenziato che la contaminazione da micotossine è un problema diffuso e può avvenire in qualsiasi punto della filiera alimentare. Poiché la loro presenza è rilevabile solo mediante analisi chimica, i controlli analitici andrebbero dunque intensificati e la ricerca andrebbe estesa anche nelle fasi di preparazione e conservazione. La normativa, in continua evoluzione, molto complessa seppure ben dettagliata, prevede che il campionamento venga effettuato da personale qualificato e in base a quanto prescritto (rappresentatività dei punti di campionamento, numero di campioni elementari, peso e omogeneizzazione del campione globale, numero di campioni di laboratorio); la fase del campionamento svolge, al pari delle procedure di preparazione ed analisi dei campioni, un ruolo di primo piano ai fini dell accuratezza del risultato finale; occorre evitare che tempo ed impegno vengano spesi per effettuare analisi accurate ma su campioni non rappresentativi che, per analiti distribuiti in modo eterogeneo, costituiscono una fonte di errore anche fino al 90%. Corrette procedure di campionamento inoltre, sono necessarie poiché prelievi effettuati in maniera non rigorosa, date le criticità legate alla eterogeneità della contaminazione da micotossine, potrebbero portare ad applicare in maniera non corretta i criteri di accettazione o di rifiuto di una partita con il rischio, in quest ultimo caso, di pesanti ripercussioni economiche oltre che creare inutili allarmismi. Controlli pianificati, mirati e magari intensificati potrebbero aiutare nello studio e nella ricerca di nuove correlazioni tra livelli di contaminazione da micotossine con tutti quei fattori 19

20 favorevoli all attività delle muffe patogene e legati a: annata di produzione, ossia andamento climatico; zone geografica di provenienza; pratiche agronomiche e/o processi produttivi. E auspicabile dunque un monitoraggio continuo ed esteso ad una più vasta tipologia di alimenti in modo da assicurare che i tenori delle micotossine nei prodotti alimentari vengano mantenuti a livelli accettabili sul piano tossicologico, ai fini della tutela della salute pubblica. BIBLIOGRAFIA - Rapporti ISTISAN 5/ : 1 Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agroalimentare -Rapporti ISTISAN 10/ : 3 Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agroalimentare e zootecnica -Relazione sul Sistema di Allerta Anno 2010: Direzione Generale della Sicurezza degli Alimenti e della Nutrizione -Reg. (CE) N. 1881/2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 364/5. - Reg. (CE) N. 1126/2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il Reg. (CE) N. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium-tossine nel granoturco e nei prodotti a base di grnoturco. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 255/14. - Reg. (UE) N. 105/2010 della Commissione del 5 febbraio 2010 recante modifica del Reg. (CE) N. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari, per quanto riguarda l Ocratossina A. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 35/7. -Reg. (UE) N. 165/2010 della Commissione del 26 febbraio 2010 recante modifica, per quanto riguarda le aflatossine, del Reg. (CE) N. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 50/8. -Reg. CE N. 401/2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 70/12. - Reg. UE N. 178/2010 della Commissione del 2 marzo 2010 che modifica il Reg. CE N. 401/2006 per quanto concerne le arachidi, gli altri semi oleosi, la frutta a guscio, le mandorle di albicocche, la liquirizia e l olio vegetale.. Gazzetta Ufficiale dell Unione Europea L 52/32. Si ringrazia per la collaborazione il personale amministrativo del settore chimico DAP Bari: M. Dimauro, M. Mele 20