Nelle piante l embrione deriva solo da uno zigote fecondato?

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1 Nelle piante l embrione deriva solo da uno zigote fecondato?

2 La capacità delle piante di produrre embrioni non è limitata solo allo sviluppo della cellula uovo fecondata. Cellule somatiche sono in grado di sviluppare una pianta completa passando attraverso stadi embrionali senza però passare attraverso la fusione dei gameti. Questo processo è noto come EMBRIOGENESI AVVENTIZIA O SOMATICA L'embriogenesi somatica quindi è il processo per cui cellule somatiche, e non, sviluppano interi organismi attraverso una serie di stadi molto simili a quelli dello sviluppo dell'embrione zigotico (fase globulare, a cuore, torpedo, cotiledonare). In natura avviene naturalmente solo in pochissime specie, ed i tessuti competenti sono sia tessuti implicati nella riproduzione, ad es. le cellule della nucella (entro l ovulo), le microspore, ma anche cellule somatiche quali tessuti fogliari.

3 In Crassula multicava cellule dell epidermide fogliare, dopo che la foglia è stata staccata dalla pianta, riprendono a dividersi e formano embrioni avventizi che successivamente differenziano piante. (Esempio di induzione di embrioni somatici mediante stress meccanico). Le cellule della foglia in condizioni naturali non differenzierebbero mai embrioni, però il distacco dalla pianta (meccanicamente) riattiva alcune cellule epidermiche alla divisione ed alla successiva organizzazione di embrioni.

4 Sebbene il controllo genico dello sviluppo degli embrioni zigotici e somatici sia simile, i meccanismi che portano alla fase di induzione embrionale è molto diversa nei due processi. Le cellule somatiche acquisiscono competenza embriogenica in seguito a trattamenti chimici e/o stimoli meccanici. L organizzazione di embrioni somatici richiede una riprogrammazione dell espressione genica con l attivazione e/o spegnimento di una serie di geni per permettere ad alcune cellule il passaggio dalla condizione vegetativa alla condizione embrionale.

5 L embriogenesi somatica può essere indotta sia direttamente, in cellule appartenenti ad una struttura già differenziata (foglie, stelo, radici, cotiledoni ecc.) sia indirettamente in calli allevati su un mezzo agarizzato o in sospensioni cellulari. L embriogenesi somatica diretta avviene, in coltura in vitro, da tessuti o cellule già determinate a produrre embrioni, prima del prelievo dalla pianta madre. Questi espianti richiedono pochi regolatori di crescita (ormoni) o solo condizioni ambientali favorevoli alla ripresa delle divisioni cellulari e alla successiva espressione della loro competenza, cioè produrre embrioni. Diversamente, l embriogenesi somatica indiretta richiede che ai tessuti di partenza venga modificato il loro destino. Questo è possibile inducendoli a proliferare inizialmente in masse cellulari (callo) indifferenziate. Solo successivamente alcune cellule di callo vengono indotte a dare origine ai PEM (masse proembriogeniche), è a trasformarsi in embrioni somatici.

6 Esempi di tessuti che producono embrioni somatici direttamente: l epidermide dell ipocotile, e le cellule della nucella. Nell embriogenesi indiretta, una singola cellula del callo o, nella maggior parte dei casi, un aggregato di cellule detto complesso pro-embrionale può originare uno o più embrioni. Ogni embrione che si sviluppa passa attraverso le stesse fasi di sviluppo dell embrione zigotico.

7 Dal Libro di testo: Elementi di Biologia dello Sviluppo delle Piante, ed. EdiSES

8 Differenze fra embriogenesi zigotica e somatica: I due processi sono morfologicamente identici dallo stadio globulare in poi. Possono esserci piccole differenze perché gli embrioni somatici presentano spesso il fenomeno della fasciazione, o un numero di cotiledoni diverso rispetto a quello tipico della specie. Però le prime fasi di sviluppo possono essere differenti nei due processi, in particolare manca il sospensore nell embrione avventizio. Nell embriogenesi somatica è frequente il fenomeno della formazione di embrioni a partire direttamente dall epidermide di un altro embrione somatico. Si chiamano embrioni secondari. In genere la produzione di embrioni secondari è associata al fallimento dello sviluppo di quello primario

9 Importante è la composizione del mezzo di coltura per indurre embriogenesi somatica. In genere sono richiesti due tipi diversi di mezzi, uno per l induzione delle cellule embriogeniche ed un secondo per il successivo sviluppo dell embrione. Il primo mezzo deve contenere auxina, il secondo ne deve essere privo o ne deve contenere una concentrazione notevolmente inferiore rispetto al primo

10 Se non intervengono eventi che inducano variazione genetica nelle cellule che danno origine all embrione somatico, le piante ottenute da embrioni somatici sono geneticamente identiche ai tessuti somatici di partenza. però Eventi di variazione somaclonale sono frequenti nelle colture in vitro.

11 Il rimodellamento della cromatina è un prerequisito per lo stabilirsi della totipotenza nelle cellule staminali durante l embriogenesi somatica Negli animali il rimodellamento della cromatina è un importante strumento di conversione staminale. Nelle piante la struttura della cromatina si rimodella continuamente durante lo sviluppo, ed il silenziamento genico dipendente dalla cromatina è coinvolto nel mantenimento dello stato differenziato.

12 Le cellule staminali presentano uno stato della cromatina più dinamico delle cellule differenziate perchè proteine strutturali della cromatina, come gli istoni, sono scambiati più rapidamente nelle cellule staminali che nelle cellule differenziate e questo favorisce rapidi cambiamenti nei programmi di espressione genica.

13 La ristrutturazione della cromatina svolge due ruoli principali nei primi stadi dell embriogenesi somatica Sia nell embriogenesi diretta che nella indiretta, l unfolding della cromatina è richiesto per lo sdifferenziamento delle cellule somatiche. Perchè? E necessario per consentire l espressione di geni che sono stati inattivati dalla eterocromatizzazione che ha luogo durante il processo del differenziamento.

14 Il rimodellamento della cromatina è anche necessario alla fine del processo embriogenico Perchè? Per reprimere i geni specifici dell embriogenesi, riattivando il differenziamento, almeno in specifici distretti cellulari dell embrione somatico.

15 Altri meccanismi epigenetici L ipermetilazione del DNA, per esempio causato dall auxina esogena (l ormone induttore), causa la formazione di cellule somatiche embriogeniche

16 Chi la media??? La metilazione del DNA è mediata da almeno tre classi di metiltransferasi. La METHYLTRANSFERASE1 (MET1) è una delle tre. Embrioni met1 (somatici e zigotici) si sviluppano in modo improprio.

17 Sembra che un azione concertata di metilazione del DNA e demetilazione degli istoni sia essenziale all induzione di embrioni somatici Durante lo sviluppo del seme, Arabidopsis MET1 interagisce con MEDEA, uno dei componenti del complesso FERTILIZATION INDEPENDENT SEED (FIS) -PRC2, dimostrando che un azione concertata dei programmi epigenetici di metilazione del DNA e metilazione degli istoni regola le variazioni dei cambiamenti di sviluppo

18 Altre modificazioni... Le modificazioni della cromatina includono l acetilazione delle code istoniche per il rilassamento del packing del DNA, al fine di facilitarne l accesso da parte di molte proteine regolatrici L iperacetilazione degli istoni si associa ad attiva espressione genica, mentre l ipoacetilazione si correla a repressione genica.

19 L attività di numerosi fattori di trascrizione è coinvolta nella riprogrammazione della totipotenza necessaria all embriogenesi somatica E questo è in accordo con quanto ha luogo nelle cellule somatiche umane ove una specifica combinazione di FT riprogramma le cellule differenziate in cellule staminali.

20 La lista dei FT che influenzano l induzione dell embriogenesi somatica include WUSCHEL (WUS), geni WUSCHELrelated homeobox (WOX), AGAMOUS- LIKE15 (AGL15), LEAFY COTYLEDON (LEC), e geni MYB come EMBRYOMAKER.

21 AGL15 In Arabidopsis e riso, le proteine a dominio MADS, come AGL15, svolgono ruoli importanti in vari eventi dello sviluppo, come tempo di fioritura, organogenesi del fiore e del frutto e sviluppo del seme.

22 AGL15 accentua l embriogenesi somatica riducendo i livelli dell acido gibberellico (GA) attraverso l induzione di una GA2- ossidasi che inattiva GA, inoltre è un componente del complesso SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1)

23 WUSCHEL Durante l embriogenesi zigotica in Arabidopsis WUS si esprime prima dello stabilirsi della nicchia staminale nell apice caulinare. Nella stessa pianta la sovraespressione di WUS causa aumento dell embriogenesi somatica senza alcun fitormone esterno, suggerendo che questo FT sia coinvolto nel processo di embriogenesi somatica promuovendo la transizione vegetativo-embriogenica. Inoltre, l induzione di WUS ha luogo prima di quella di CLV3, marcando i gruppetti cellulari iniziali dell embriogenesi.

24 WOX I geni WOX svolgono ruoli importanti nel coordinare la trascrizione nelle prime fasi dell embriogenesi somatica in Vitis vinifera. VvWOX2 e VvWOX9 sono quelli più espressi, vengono definiti geni di identità embrionale. Nell embriogenesi somatica di Arabidopsis WOX5 and WUS si esprimono prima dei geni di identità embrionale, ad es. di WOX2

25 LEC e LEC-like LEC1 codifica una proteina simile ad una subunità di Heme-Activated Proteins 3 (HAP3). LEC1-LIKE (LIL) è anche richiesto per lo sviluppo dell embrione somatico in numerose piante, es.cacao. I geni LEC-like sembrano importanti per coordinare eventi primari che portano alla competenza embriogenica. LEC2 and FUS3 presentano un motivo di legame al DNA (B3) unico degli FT delle piante. La formazione di embrioni somatici da parte dell auxina richiede la funzione dei geni LEC

26 L auxina:livelli, trasporto e biosintesi Gradienti di auxina attivano nel callo embriogenico il trasportatore polare di auxina PIN1, e la soppressione di WUS e PIN1 mostra che entrambi i geni sono necessari all induzione dell embriogenesi somatica. e LEC???

27 I carrier di efflusso dell auxina PIN1 e PIN2, i geni della biosintesi dell auxina YUCCA2 (YUC2) e YUCCA4 (YUC4) ed I fattori di risposta all auxina ARF5, ARF8, ed ARF10, e SERK1 sono controllati da LEC2

28 L auxina endogena promuove la rottura di alcune proteine auxin/iaa (AUX/IAA) (repressori), che, quando attivi, bloccano i Fattori di Risposta all Auxina (ARF) formando dimeri inattivi. L inattivazione delle AUX/IAA consente agli ARF di legare gli elementi di risposta all auxina presenti sui geni di risposta all ormone, provocandone l attivazione. Tuttavia gli stessi AUX/IAA sono rapidamente indotti dall auxina, che così restaura la repressione degli ARF, perchè? Per ridare equilibrio al sistema

29 MONOPTEROS MP (ARF5) è un gene chiave dell embriogenesi zigotica ove influenza il trasporto polare dell auxina attraverso l attivazione di PIN1. Gli embrioni somatici non si formano quando il trasporto auxinico è inibito e MP represso.

30 Il 2,4-D può agire direttamente come auxina, oppure può modificare il metabolismo intracellulare dell IAA e/o agire come induttore di stress attivando geni di risposta allo stress (es. ROS).

31 Etilene???? I ruoli dell etilene nell induzione dell embriogenesi somatica non sono ben conosciuti, perchè sono stati ottenuti sia risultati di promozione che di inibizione in specie diverse e diversi sistemi di coltura in vitro.

32 Acido gibberellico In Arabidopsis, i livelli endogeni di GA si correlano negativamente con il potenziale embriogenico. In supporto del ruolo inibitorio, geni importanti per la regolazione negativa delle risposte-ga sono sovraespressi, come i geni DELLA

33 ABA Nella carota l applicazione di ABA alle plantule induce embriogenesi somatica ed anche causa embriogenesi secondaria. L ABA è indotto dallo stress ed induce i geni Late-Embryogenesis Abundant (LEA) nell embriogenesi zigotica.

34 In Arabidopsis, AtECP31 e AtECP63 sono gli omologhi dei geni LEA della carota, e sono indotti dall ABA durante l embriogenesi somatica, ed egualmente l espressione del gene ABI3 è coinvolta AGL15 ha ruoli multipli, controlla anche ABI3, è anche capace di reprimere la sua stessa espressione e di attivare LEC2.

35 Le somatic-receptor-kinases sono coinvolte nel network di regolazione per l induzione di cellule staminali e per il loro mantenimento nell embriogenesi somatica I geni SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (SERK) sono infatti coinvolti nell embriogenesi somatica in numerose monocotiledoni (es. Dactylis glomerata, riso, Triticum aestivum, noce di cocco, banana, mais) e dicotiledoni (es. A.thaliana, Medicago truncatula, Ocotea catharinensis, Citrus unshiu, Vitis vinifera, patata).

36 EMBRIOGENESI SOMATICA Generazione di embrioni da cellule diverse dallo zigote Per APOMISSIA: da cellule uovo non fecondate da cellule dei tessuti materni dell ovulo Per TOTIPOTENZA in vitro: di alcune cellule vegetali: Da colture embriogeniche per esempio da espianti di radici di Daucus carota, Da espianti di ipocotile trattati con auxina sintetica (2,4 D) o da giovani foglie

37 IN NATURA l embriogenesi può avvenire anche da tessuti somatici :Viviparia PIANTA DELLA MATERNITA APOMISSIA da cellule vegetative Kalanchoe daingremontiana

38 EMBRIOGENESI SOMATICA L embriogenesi somatica è il processo attraverso il quale cellule somatiche, in opportune condizioni colturali induttive, passando attraverso una serie di cambiamenti morfologici e biochimici, danno origine ad un embrione, del tutto simile ad un embrione zigotico, senza che avvenga la fusione dei gameti (fecondazione). Le cellule somatiche più idonee per indurre l embriogenesi somatica sono le cellule meristematiche, i tessuti che costituiscono gli embrioni zigotici e tessuti giovani anche se differenziati. In numerose specie tale processo è stato osservato avvenire spontaneamente sia da tessuti riproduttivi (nucella e cellule sinergidi) che da tessuti somatici (foglia). Con un processo molto simile a quello proprio degli embrioni zigotici, gli embrioni somatici possono svilupparsi, formando plantule che, dopo un periodo di crescita in vitro, possono essere ambientate e trasferite in serra o in pieno campo.

39 EMBRIOGENESI ZIGOTICA A CONFRONTO CON LA SOMATICA

40 EMBRIOGENESI SOMATICA DIRETTA ED INDIRETTA L embriogenesi somatica può avvenire per via diretta o indiretta. Nella diretta l embrione deriva direttamente da alcune cellule dell espianto, senza passare attraverso la formazione di un callo. Le cellule proembriogeniche sono già determinate e richiedono solo regolatori di crescita e condizioni favorevoli per la crescita cellulare e l espressione dell embriogenesi. Nella indiretta è richiesta proliferazione di callo e rideterminazione di cellule già differenziate in uno stato embriogenico. In questo caso i regolatori di crescita sono necessari non solo per la ripresa delle divisioni mitotiche ma anche per la determinazione dello stato embriogenico

41 ESPIANTI FOGLIARI Callogenesi PIANTA Prelievo degli espianti Sterilizzazione Inoculo in mezzo callogenico CALLO Callogenesi ESPIANTI CAULINARI

42 Embriogenesi da callo Gruppi di cellule meristematiche nella massa del callo. Iniziali dell embrione

43 Rigenerazione di pianta di peperone attraverso embriogenesi somatica indiretta Callo Embione somatico Pianta sviluppata Plantula

44 Analisi molecolare dell embriogenesi Sono stati identificati geni inducibili dagli ormoni come i geni PIN. PIN1 che codifica per un trasportatore dell auxina, è il primo espresso in cellule proembriogeniche. Un altro gene associato alla competenza embriogenica delle cellule e marcatore precoce del processo è SERK, isolato in singole cellule (competenti a formare embrioni somatici) in una sospensione cellulare di Daucus e Dactylis. Si ipotizza che le proteine SERK possano agire come recettori transmembrana per segnali nel mezzo di coltura e per innescare l embriogenesi. Studi di trascrittomica hanno identificato alcuni geni per fattori di trascrizione coinvolti nell embriogenesi somatica, come i membri della famiglia AP2/ERF (APETALA /Ethylene-responsive factor) codificati da BBM. BBM è un fattore di trascrizione espresso nell embrione che gioca un ruolo chiave nell induzione e mantenimento dello sviluppo dell embrione nella pianta. Over-espressione ectopica (espressione di un gene con una differente localizzazione da quella normale) di BBM, in Arabidopsis e Brassica napus, induce lo sviluppo spontaneo, indipendentemente dall auxina, di embrioni somatici in tessuti vegetativi.

45 I geni SERK sono regolati dall auxina in alcune specie, e dall auxina e dalla citochinina in altre

46 Cyclamen persicum Mill. è una delle più importanti specie ornamentali invernali (in Europa la produzione annuale si aggira intorno ai 140 milioni di piante). Il solo modo commerciale di propagare il ciclamino è attraverso semi ibridi. L embriogenesi somatica in Cyclamen persicum è un efficiente metodo per ottenere linee con eccellenti caratteri.

47 Il ruolo dei geni SERK nell embriogenesi somatica del ciclamino è stata descritta,

48 Two SERK genes are markers of pluripotency in Cyclamen persicum Mill. Savona M, Mattioli R, Nigro S, Falasca G, Della Rovere F, Costantino P, De Vries S, Ruffoni B, Trovato M, Altamura MM. J Exp Bot. 2012;63(1):

49 PEA, aggregato preembriogenico Sequenza istologica della formazione di embrioni somatici (A-I) sul mezzo induttivo Sviluppo degli embrioni sul mezzo induttivo (K-M) J Exp Bot. 2012;63(1):

50 CpSERK2 CpSERK1 CpSERK2 CpSERK1 Analisi dei profili di espressione dei geni CpSERK1 e CpSERK2 mediante RNA in situ hybridization durante l embriogenesi somatica in C. persicum CpSERK1 CpSERK2 CpSERK2 RNA in situ hybridizations usando sonde senso di CpSERK1 e CpSERK2 (controlli) J Exp Bot. 2012;63(1):

51 Risultati in pianta CpSERK1 CpSERK1 e CpSERK2 si esprimono nel ricettacolo, negli ovuli, nella nucella, nell embriosacco, e, dopo la fecondazione, nell embrione zigotico fino allo stadio di torpedine. L espressione rimane nel procambio e nei poli radicale e caulinare dell embrione allo stadio cotiledonare CpSERK2 CpSERK2 CpSERK1 RNA in situ hybridizations con sonde senso di CpSERK1 e CpSERK2 (controlli) CpSERK2 J Exp Bot. 2012; 63(1):

52 L embriogenesi somatica come risposta allo stress L embriogenesi somatica può essere considerata una risposta adattativa allo stress, perchè vari stress la inducono. Per esempio, in carota è stimolata dall applicazione di sali di metalli pesanti (Cd 2+, Ni 2+, Cu 2+, Co 2+), alta pressione osmotica, alte temperature, tutto in assenza di fitormoni esogeni.

53 Anche il 2,4-D può funzionare come agente di stress per l espianto Durante l embriogenesi della patata indotta da 2,4-D si osserva sovraregolazione di geni dello stress ossidativo e della difesa.

54 Quindi L embriogenesi somatica è accentuata da livelli aumentati di ROS, ad esempio nel grano, e l applicazione di antiossidanti al mezzo induttivo riduce l embriogenesi somatica in Eucalyptus globulus

55 I ROS sono in relazione con l ABA e con il Boro L ABA incrementa i livelli di ROS negli embrioni di mais Anche il micronutriente Boro mette in moto i pathway mediati dallo stress durante l embriogenesi somatica con un diretto impatto sui livelli di ABA, che aumentano, come osservato nell embriogenesi somatica di carota. Lo stress ed i ROS stimolano l induzione di embriogenesi somatica, ma poi devono essere detossificati, ad es. dalle proteine DELLA

56 L ossido nitrico L ossido nitrico è un fattore critico per lo sviluppo e le risposte allo stress nelle piante, ed è uno stressor per l induzione dell embriogenesi somatica, forse influenzando la disponibilità di ioni Ca 2+ entro le cellule attraverso l attività di proteine-chinasi. In alternativa, potrebbe incrementarla aumentando la produzione di auxina attraverso la repressione del gene MYC2, che è un repressore di biosintesi dell auxina, come dimostrato nell embriogenesi somatica di Arabidopsis.

57 La morte cellulare programmata è essenziale all embriogenesi somatica

58 Le cellule del sospensore (quando c è) muoiono per PCD come nell embriogenesi zigotica.

59 Abies alba dimostra che la PCD deve però avvenire anche prima, e quest ondata di PCD è specifica dell embriogenesi somatica ed essenziale per il suo successo. Dove avviene? Nei PEM Perchè?

60 Dal PEM non possono partire troppi embrioni, perchè se no nessuno arriverà a compimento! Esperimenti con linee cellulari composte di PEM deficienti nel programma di PCD lo dimostrano, infatti queste linee sono incapaci di formare embrioni, indipendentemente dal trattamento.

61 Lo zinco Lo Zinco è un potente regolatore di PCD negli animali, ed è cruciale per la formazione regolare dell embrione somatico, come dimostrato nelle conifere...ma attenzione ai suoi ruoli: L esposizione dei giovani embrioni ad agenti chelanti lo zinco conduce alla morte dell embrione, e l aggiunta di zinco esogeno sopprime il differenziamento terminale del sospensore e la sua eliminazione, causando l inibizione della maturazione dell embrione.

62 Possibili utilizzi dell embriogenesi somatica: -trasformazione genetica, per ottenere piante con geni desiderati (particolarmente utili per le trasformazioni con Agrobatterio) - propagazione massiccia e piuttosto veloce di piante il cui ciclo biologico naturale è molto lungo. - Applicazione biotecnologica : SEMI SINTETICI -Conservazione della biodiversità (banche del seme)

63 Gli embrioni somatici allo stadio di torpedo possono essere conservati per moltissimi anni. Necessitano però di trattamenti particolari. Gli embrioni, a questo stadio, vengono inglobati in sostanze sintetiche, ad es. l alginato di sodio. Questo serve per nutrire l embrione e contemporaneamente a proteggerlo dalla disidratazione e dai danneggiamenti fisici e meccanici. Embrioni così incapsulati sono detti SEMI ARTIFICIALI O SINTETICI All alginato spesso vengono aggiunti altri composti (olio di silicone ed altri) in grado di assorbire ossigeno. L incapsulamento, quindi deve fornire una protezione fisica e può contenere delle sostanze nutritive, dei regolatori di crescita, degli antibiotici e dei fungicidi, tutti in grado di portare alla formazione della pianticella in campo. Non si è ancora verificato un utilizzo diffuso dei semi sintetici.

64 SEMI SINTETICI Embrioni inclusi in pallini di alginato di calcio

65 Il rivestimento, endosperma artificiale, di un seme sintetico deve essere preparato in relazione alle caratteristiche della specie e delle potenzialità di germinazione. L unità di propagazione formata dall embrione somatico più l involucro, seme sintetico, può anche essere criopreservato per lunghi periodi in azoto liquido o conservato in condizioni di sviluppo rallentato a temperature comprese tra 7 C e 10 C. Questa potenzialità rappresenta una strategia per la conservazione del germoplasma in programmi di protezione della biodiversità. La produzione di semi sintetici è un obiettivo biotecnologico per una specie di rilevanza dal punto di vista economico come potrebbero essere le piante agronomicamente importanti o quelle ornamentali.

66 E possibile un applicazione biotecnologica dei geni SERK? Possono essere idonei per un rapido screening di calli potenzialmente embriogenici per ridurre i costi della produzione di semi utilizzando la tecnologia di produzione di semi artificiali

67 Un altra via per l embriogenesi

68 Le Angiosperme producono una grande quantità di granuli pollinici all interno delle antere. Il granulo di polline è composto da un massimo di 3 cellule. Ogni granulo pollinico, essendo un prodotto della meiosi ha cellule apliodi. Ha origine dalla microspora, mononucleata

69 La meiosi può essere sfruttata per aumentare la biodiversità. Come? Le microspore ed i granuli pollinici immaturi possono essere spinti a dividersi in colture in vitro per formare embrioni. Questi embrioni sono APLOIDI e possono dare origine a piante APLOIDI. Questi embrioni sono detti EMBRIONI ANDROGENICI. Come conseguenza della meiosi, ogni microspora è unica dal punto di vista genetico, quindi ogni embrione androgenico (prodotto da una sola microspora o granulo pollinico) è diverso da tutti gli altri. Si pensi alla enorme variabilità che si può ottenere con gli embrioni androgenici. Gli embrioni androgenici sono aploidi ed hanno solo il set cromosomico paterno.

70 L androgenesi può essere diretta o indiretta. L indiretta prevede la formazione di callo prima di iniziare il differenziamento dell embrione. Es. di androgenesi indiretta si ha nelle colture di antere dei cereali. Gli embrioni androgenici vengono rilasciati dall esina (parete del granulo pollinico) allo stadio globulare.

71 Nell androgenesi lo stadio di microspora uninucleata rappresenta un punto di partenza ideale per la produzione degli embrioni androgenici. La microspora viene deviata dalla via gametofitica verso quella sporofitica.

72 Come è possibile che durante una coltura di microspore o granuli pollinici immaturi avvenga una deviazione dal normale sviluppo gametofitico per cui le microspore sono destinate? In pianta la prima mitosi della microspora è asimmetrica e porta alla formazione di una grossa cellula vegetativa con un nucleo diffuso ed una piccola cellula con un nucleo denso, che si divide successivamente per formare i due nuclei spermatici. Durante l androgenesi la prima mitosi è simmetrica e dà origine a due nuclei piccoli e simili. Da questi prenderà origine l embrione androgenico. Così una divisione mitotica simmetrica, al posto di una asimmetrica è alla base del cambiamento del destino della microspora.

73 NORMALE SVILUPPO GAMETOFITICO Granuli di polline maturo I 2 KI È evidente un citoplasma molto denso con un alto contenuto in amido La cellula generativa mostra una forma allungata con cromatina altamente condensata

74 Formazione di embrioni aploidi a partire da una coltura di polline di tabacco. A

75 Il processo androgenico prevede tre fasi fondamentali: FASE 1 acquisizione della potenzialità embriogenetica da parte della microspora mediante un fattore di stress: quindi da una parte repressione del normale sviluppo del gametofito maschile, dall altra indirizzamento verso una via embriogenetica. FASE 2 divisione cellulare della microspora che conduce ad uno stato multicellulare FASE 3 passaggio dalla struttura multicellulare (definita embryolike structure) ad un embrione vero e proprio

76 Per indurre la microspora all androgenesi bisogna agire con uno stress che induce la microspora a cambiare il suo programma di sviluppo e formare due cellule uguali che daranno l avvio dell embriogenesi aploide. Nell orzo è stato utilizzato uno stress osmotico, attraverso incubazione delle antere con mannitolo. Ma recenti esperimenti hanno dimostrato che si può ricorrere anche a stress con calcio e acido abscissico; per il frumento è stato utilizzato uno stress da calore. E stato osservato che quando c è meno contatto tra le microspore e quando viene distrutta la loro organizzazione ordinata nello spazio c è più possibilità di deviare il loro sviluppo verso una via androgenica. E sufficiente un trattamento di calore (32 c) durante le prime 8 ore di coltura delle microspore per indurre l androgenesi. Per il tabacco è stato utilizzato come stress la privazione di alcuni nutrienti come la glutammina e lo zucchero e poi trasferimento in un terreno con elevato glucosio. Ma altri stress abiotici possono essere utilizzati come uso di colchicina, mancanza di azoto, auxina, bassa temperatura e radiazioni gamma in associazione a calore.

77 Il fenotipo delle piante aploidi è dato dall espressione dell unica copia di geni che contengono. Le piante aploidi sono particolarmente indicate per i programmi di selezione di specie aventi caratteri desiderati. Nell individuo aploide, essendo presente un solo allele per carattere, ogni mutazione indotta diviene manifesta. La generazione di piante aploidi è stata realizzata per un gran numero di specie vegetali (oltre il centinaio tra cui, tabacco, orzo, vite, banano, patata, riso, granturco, frumento).

78 Limite delle piante Aploidi: Sono Sterili.

79 Tuttavia è possibile renderle fertili raddoppiando il loro contenuto cromosomico. Si ottengono così piante diploidi fertili diploidi omozigoti). (piante DH, individui COME SI FA? Somministrando colchicina che induce un raddoppiamento cromosomico o direttamente alla pianta aploide o all embrione androgenico; oppure coltivando gli espianti della pianta aploide in vitro (endoreduplicazine spontanea, fusione nucleare). Al momento le linee DH (double haploids) sono i più avanzati sistemi per selezionare linee resistenti a virus o batteri.

80 Gli embrioni androgenici aumentano la biodiversità. Gli embrioni androgenici possono essere facilmente trasformati. Anche le microspore di partenza si trasformano facilmente. L importate conseguenza che le piante ottenute da microspore transgeniche sono omozigoti per il transgene, anche dopo il raddoppiamento cromosomico, ha fatto di questi individui un ottimo modello da utilizzare per manipolazioni genetiche.

81 Oltre all androgenesi esiste anche la ginogenesi. In quest ultimo caso gli embrioni avventizi si sviluppano da tessuti del gametofito femminile (Apomissia) Tuttavia, l androgenesi sperimentale è un sistema più efficiente della ginogenesi, in contrasto a ciò che avviene in natura. Infatti in diverse specie frequentemente si osservano casi di formazione di embrioni a partire da tessuti del macrogametofito, mentre sono molto scarsi i casi di androgenesi naturale.

82 CRIOCONSERVAZIONE

83 TECNICA DELLA CRIOCONSERVAZIONE Consiste nello STOCCAGGIO DI GERMOPLASMA A TEMPERATURA ULTRA-BASSA ( 196 C), propria dell azoto in fase liquida

84 Possibili origini di embrioni nelle piante M Granulo di polline (n) Embrio sacco (n) F Androgenesi Embrione zigotico Ginogenesi DH DH Sporofito (2n) Embrio sacco Apomissia materna Embriogenesi somatica

85 Domande: Cos è l embriogenesi somatica? A cosa serve? Quali sono i principali geni implicati? Lo stress ha un ruolo? E la PCD? Cos è l androgenesi? A cosa serve? Qual è il motivo per cui l embriogenesi somatica avviene? Che tipo di divisione cellulare è alla base dell androgenesi? Cosa sono i semi sintetici?