il flusso delle informazioni che parte dal DNA nel nucleo cellulare e si concretizza nella sintesi proteica all interno del citoplasma, passando per
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- Eleonora Orsini
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2 il flusso delle informazioni che parte dal DNA nel nucleo cellulare e si concretizza nella sintesi proteica all interno del citoplasma, passando per l intermediario fondamentale mrna
3 RNA
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5 produzione di fiori di petunia con una colorazione più vivace e intensa. Le due piante in alto sono petunie wild-type; mentre le due in basso contengono transgeni che inducono soppressione sia del gene endogeno che del transgene, generando zone bianche prive di pigmento nel fiore. la down regulation è dovuta ad un inibizione post-trascrizionale dell espressione genica tramite un aumento della velocità di degradazione dell mrna Per raggiungere questo scopo, introdussero in petunie rosa alcune copie aggiuntive del gene decodificante la chalcone synthase, un enzima chiave per la pigmentazione dei fiori nelle petunie normalmente colorate in rosa o viola. molte piantine transgeniche non avevano gli intensi colori attesi ma presentavano fiori con petali parzialmente o completamente bianchi
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7 Iniettarono dsrna all interno di Caenorhabditis elegans, un verme nematode, individuando un potente effetto di silenziamento. Il termine RNA interference fu coniato in questa occasione. Il C. elegans era un sistema sperimentale utile poiché l origine evolutiva di tutte le cellule di questo organismo è nota ed è possibile iniettare RNA in embrioni ai primi stadi ed osservare i cambiamenti rispetto al modello durante lo sviluppo. Effetto fenotipico dopo l iniezione di RNA unc-22 a singolo o doppio filamento nella gonade di C. elegans. Il gene unc-22 codifica per una proteina contenuta nelle miofibrille muscolari. È noto che una diminuzione dell attività di unc-22 provochi una forte contrazione nei movimenti. L iniezione di dsrna, ma non di ssrna, ha indotto le contrazioni nella progenie
8 I principali risultati di tali esperimenti possono essere così riassunti: a)il silenziamento genico è indotto efficacemente mediante iniezione di dsrna, invece solo debolmente o per nulla in seguito all iniezione di ssrna senso o antisenso; b) il silenziamento è specifico per l mrna omologo al dsrna iniettato, altri mrna non sono coinvolti; c)il dsrna deve corrispondere alla sequenza dell mrna maturo, né la sequenza del promoter né quelle relative agli introni inducono una risposta. Ciò indica presumibilmente un meccanismo citosolico post-trascrizionale; c)l mrna selezionato, ovvero omologo al dsrna esogeno, scompare suggerendo una sua degradazione; c)soltanto poche molecole di dsrna per cellula sono sufficienti a realizzare un silenziamento totale. Ciò indica che il dsrna è amplificato e/o agisce cataliticamente piuttosto che in modo stechiometrico; c)gli effetti del dsrna possono diffondersi tra i tessuti e persino alla progenie, suggerendo una trasmissione dell effetto tra le cellule.
9 L interferenza dell RNA o RNAi Processo mediante il quale RNAds silenzia, in maniera sequenza-specifica, l espressione di geni omologhi attraverso l appaiamento con mrna bersaglio seguito dalla sua degradazione: silenziamento post-trascrizionale Meccanismo biochimico conservato (dalle piante ai funghi, agli animali) Probabilmente coinvolge più di 10 geni (analisi genetica) e gruppi di proteine correlate Funzioni biologiche: -Resistenza ai virus -Silenziamento trasposoni -Regolazione dell espressione genica La sua funzione antivirale è dimostrata chiaramente in piante (e insetti) dalla presenza nei virus di geni che codificano soppressori dell RNAi, importanti per la virulenza, mentre non è ancora provata nei vertebrati La sua funzione di silenziamento dei trasposoni è dimostrata dall osservazione che l inattivazione di geni coinvolti nell RNAi nei nematodi causa l attivazione di molti trasposoni della linea germinale
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11 Cosa sono i mirna Sono piccoli RNA non codificanti costituiti da circa 22 nucleotidi La loro scoperta risale al 1993 Il primo mi-rna fu identificato nel nematode C.elegans Successivamente furono ritrovati sia nelle piante che negli animali Oggi si ritiene che il numero complessivo di geni codificanti per mi-rna rappresenti circa lo 0.5-1% del numero di geni codificanti per proteine
12 Funzione Agiscono a livello post-trascrizionale Inibiscono la traduzione dei propri bersagli
13 Biogenesi Generalmente i geni codificanti per mirna sono trascritti nel nucleo dalla RNApolimerasi II che dà vita a lunghi trascritti,i pri-mirna,che presentano il cap e la poliadenilazione Questi ultimi vengono processati da un RNasi III,Drosha,e dal suo cofattore,pasha Si ottengono così trascritti di circa 70 nucleotidi,detti pre-mirna
14 Successivamente le proteine RAN-GTP ed exportin 5 trasportano i pre-mirna dal nucleo al citoplasma,dove un altra RNasi III,Dicer,li processa per generare molecole di RNA duplex di circa 22 nucleotidi,dette mirna:mirna* Queste molecole vengono,poi,caricate nel complesso mirisc (mirna-associated multiprotein RNA-induced silencing complex) I mirna maturi a singolo filamento vengono poi mantenuti all interno del complesso
15 Meccanismo d azione I mirna possono avere due modi diversi d agire a seconda della complementarietà che vi è tra il mirna e il suo target
16 1.Complementarità imperfetta I mirna bloccano l espressione dei loro geni target a livello post-trascrizionale Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR), per le quali presentano omologia
17 2.Complementarità perfetta I mirna che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto In questo caso i mirna trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante
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19 sirna e mirna GLI sirna rappresentano un altra classe di piccoli RNA non codificanti Gli sirna e i mirna,pur presentando numerose analogie in termini di struttura e biogenesi,svolgono funzioni essenzialmente diverse
20 Gli sirna agiscono principalmente determinando la degradazione del mrna bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(rnai) Molecole di sirna si producono a partire da lunghe molecole di RNA bicatenario prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula,quali trasposoni,virus o transgeni. RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma
21 sirna agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni sirna può avere un unico mrna bersaglio Diversamente,i mirna costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione Ogni mirna,per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mrna bersaglio
22 L espressione temporale e tessutospecifica di mirna suggerisce che i mirna svolgono un importante ruolo in svariati processi biologici,quali sviluppo e differenziamento cellulari. Inoltre alcuni possono avere una funzione oncogena ed altri oncosoppressoria
23 DICER Le ribonucleasi III sono enzimi della classe delle idrolasi, che catalizzano il taglio endonucleolitico di un 5'-fosfomonoestere DICER è coinvolta nella degradazione di lunghe molecole di RNA a doppio filamento (dsrnas) e di pre-microrna (mirna) in filamenti di 21 nucleotidi (gli sirna) durante il processo della RNA interference Ognuno presenta almeno cinque regioni specifiche: una regione amminoterminale dipendente da ATP; una regione a piattaforma carica positivamente (rosso); una regione PAZ (Giallo), che si associa alla proteina Argonaute2; due o più domini RNAsi III (verde); una regione carbossiterminale in grado di legare molecole di dsrna.
24 DICER Si ritiene che la distanza tra la regione PAZ ed i domini RNAsi III sia di 65 angstrom, quanto basta per alloggiare circa 25 nucleotidi. Tale spazio sarebbe costituito proprio dalla regione piattaforma che, carica positivamente, è in grado di instaurare legami elettrostatici con l'rna. Secondo tale analisi, dunque, la struttura di dicer potrebbe essere quella di una specie di righello molecolare, che permetterebbe all'enzima di produrre frammenti di sirna di dimensione estremamente regolare.
25 Ago2 AGO2-contained within the RISC complex-contains two domains: PIWI: The PIWI domain is a conserved domain within the Argonaute family. The C-Terminus of this domain is required for endonuclease activity. PAZ: The PAZ domain is also a conserved domain within the Argonaute family. It is located near the center of the AGO2 protein and provides grooves substrate binding
26 RNA Interference (RNAi) is initiated by DICER an RNase III Enzyme, which uses an RNA endonuclease activity to cleave double stranded RNA into nt fragments known as mirna. This cleavage is important because it provides 3 overhangs on each strand of the mirna. mirna binds to a heterodimer of R2D2 and Dcr-2 proteins. Once bound the R2D2/Dcr- 2 initiator complex is formed. The 5 end of the RNA interacts with Dcr-2 forming the pre- RISC complex, which is the inactive form. TRBP is an integral component of a Dicer-containing complex. TRBP is required to recruit Ago2 protein to interact with the bound mirna. Ago2 protein actives the pre-risc complex, converting it into holo-risc by binding to the double stranded mirna, which is double stranded. Once Ago2 is bound, it degrades one strand from the RNA (the passenger strand), while selectively retaining the guide strand. The holo-risc complex recognizes mrna with sequences complementary to the guide strand and binds to them. Once mrna is bound, it is degraded.
27 Complesso RISC. Il disegno che mostra l'rna antisenso (il filo giallo nel diagramma) legato al dominio PAZ, mentre in arancione si ha l'mrna ad esso complementare
28 microrna as regulators of signal transduction mirna regulation has been described in various physiological and pathological processes, in particular developmental processes and cancer mirna are important regulators of all hallmarks of cancer, including cell growth and cell cycle control, evasion of apoptosis, tissue invasion and metastasis, angiogenesis mirna are key players in signal transduction and partecipate in various stages of the signal transduction process. Signal transduction mediators respond to signals in a dosedependent manner. mirna can serve as mediators of signaling robustness either by amplifying a signal or by buffering and balancing the signal response.
29 Analisi in silico mediante algoritmo TargetScan 5.1 Akt signaling in prostate cancer Akt, also known as Protein Kinase B (PKB), is a serine/threonine protein kinase that plays a key role in multiple cellular processes such as glucose metabolism, cell proliferation, apoptosis, transcription and cell migration. BAD: pro-apoptotica CDKN1A: cyclin-dependent kinase inhibitor 1A mtor: serine/treonine kinase PTEN: phosphatase
30 VHL signaling in renal cell carcinoma EP300: E1A binding protein p300 CBP: CREB binding protein HIF1: Hypoxia inducible factor 1
31 VEGF signaling in renal cell carcinoma
32 Applicazioni: sirna nella ricerca di base RNA a doppio filamento viene sintetizzato con una sequenza complementare al gene d interesse e introdotto in una cellula o organismo, dove è riconosciuto come materiale genetico esogeno e attiva il processo della RNAi. Effetto: drastico calo nell espressione del gene target e studiando gli effetti di questa diminuzione si può ricavare il ruolo fisiologico del gene prodotto. Ovviamente questa tecnica non è applicabile al silenziamento di geni essenziali la cui inattivazione comprometterebbe la vitalità della cellula. Dal momento che RNAi non abolisce totalmente l espressione del gene viene chiamata tecnica knockdown.
33 sirna in biotecnologia sviluppo di piante che producano bassi livelli di tossine naturali così che possano essere introdotte nell alimentazione. 1) i semi di cotone sono ricchi delle proteine che devono essere assunte con la dieta, ma contengono un prodotto tossico, il gossipolo, rendendoli inutilizzabili per il consumo umano. RNAi è stata utilizzata per produrre stock di cotone i cui semi contengono ridotti livelli di delta-cadinene synthase, un enzima chiave nella produzione di gossipolo, senza influenzare la produzione dell enzima in altre parti della pianta dove il gossipolo è importante nella prevenzione di danni da parassiti delle piante. 2) riduzione dei livelli di allergeni nelle piante di pomodoro e la riduzione dei precursori di carcinogeni nelle piante di tabacco. 3) studio recente di un nuovo un anti-zanzare. Si utilizzano nanoparticelle per somministrare RNA a doppio filamento alle larve di zanzara nel momento in cui si cibano. l interferenza RNA è stata utilizzata per silenziare il gene responsabile della produzione della chitina, la principale componente dell esoscheletro negli insetti, nei crostacei e negli aracnidi.. Poiché il dsrna si diluisce velocemente, non può in teoria essere somministrato direttamente e per questo si ricorre all utilizzo delle nanoparticelle. Il gruppo ha
34 l intervento non comporterebbe la sostituzione in blocco del gene malato, ma la distruzione del suo intermedio di RNA, bloccando la produzione della proteina responsabile della disfunzione. Interrompendo il flusso dell informazione malata si interverrebbe pertanto in modo etico e queste terapie farmacologiche sarebbero considerate alla stregua dei medicinali attualmente in commercio. Attualmente si stanno sviluppando diverse terapie basate su RNAi tanto che recentemente sono stati riportati i successi di numerosi esperimenti pilota. Questi sviluppi recenti nelle applicazioni terapeutiche di RNAi sono senza dubbio imputabili al superamento di problematiche correlate con la veicolazione in vivo dei sirna. sirna nella ricerca medica l interferenza dell RNA non si verifica direttamente sul DNA, ma solo sulla sua copia (mrna): potrebbero essere scavalcati tutti i problemi legati all etica
35 Problematiche riguardanti la veicolazione in vivo Un iniezione di nanoparticelle deve: evitare la filtrazione, fagocitosi e degradazione nel flusso sanguigno (a); essere trasportato attraverso l endotelio del vaso sanguigno (b); diffondere nella matrice extracellulare ; essere internalizzato dentro la cellula (d); evitare l endosoma (e); Barriere fisiologiche alla distribuzione sistemica di nanoparticelle di sirna. e rilasciare i sirna (f) [71].
36 Varie strategie di veicolazione in vivo di farmaci basati su sirna sia veicolazione specifica che non specifica. modificazioni chimiche a livello della posizione 2 del ribosio, per esempio mediante metilazione o fluorurazione, in quanto portano ad un aumento della stabilità dei sirna iniezione intravenosa di sirna chimicamente modificati o coniugati con il colesterolo o immagazzinati all interno di particelle liposomiali protettive: uptake cellulare del sirna attraverso il processo di endocitosi mediata recettorialmente incorporare l acido nucleico in una carrier: Attenzione alle caratteristiche di superficie! L aggiunta di PEG può migliorare le interazioni di carica e le dimensioni per prevenire le aggregazioni. accoppiamento dei sirna terapeutici con frammenti di anticorpi e aptameri o impacchettati in nanoparticelle rivestite con ligandi che hanno come bersaglio i recettori: incorporazione dei sirna tramite l endocitosi. È possibile progettare ligandi strutturati di RNA noti come aptameri che possono legarsi con specifici recettori della superficie cellulare e coniugarli covalentemente a sirna per il rilascio cellulo-specifico in vivo. Le molecole di sirna vengono rilasciate dall aptamero durante il processo di ingresso all interno della cellula.
37 Vectors for shrna expression Plasmid vector
38 Lentiviral vector -genomic insertion -permanent The long terminal repeat (LTR) is the control center for gene expression.
39 Adenoviral vector - transient expression - no genomic insertion
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