Relazione dell attività svolta durante il 1 anno del corso di Dottorato in Neuroscienze. anno accademico XXV Ciclo.

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1 Relazione dell attività svolta durante il 1 anno del corso di Dottorato in Neuroscienze anno accademico XXV Ciclo Laura Buizza

2 PROFILO OSSIDATIVO DI p53 IN LINFOCITI IMMORTALIZZATI DI PAZIENTI ALZHEIMERIANI

3 Introduzione Da circa una decina d anni, il gruppo di ricerca in cui sto svolgendo il corso di Dottorato in Neuroscienze si è focalizzato sulla caratterizzazione delle cellule periferiche di pazienti affetti da Malattia di Alzheimer (AD). Studiare il distretto periferico permette due vantaggi: innanzitutto, consente di ottenere indicazioni su quanto avviene a livello del sistema nervoso centrale, compartimento non di facile accesso; in secondo luogo, le alterazioni biologiche e funzionali delle cellule periferiche possono portare all identificazione di marcatori biologici, data appunto la loro facile accessibilità. Tutto questo potrebbe portare ad individuare nuove molecole che consentano di fare una diagnosi precoce di AD, in quanto la diagnosi definitiva di questa malattia viene tipicamente formulata post-mortem. Numerosi studi si sono concentrati sul liquido cerebrospinale, come fonte di possibili biomarcatori. In pazienti affetti da AD, esaminati rispetto a soggetti di controllo, sono stati identificati aumentati livelli della proteina tau totale o presente nella sua forma fosforilata, nonché una diminuzione di Aβ 1-42; si tratta di molecole entrambe coinvolte nel meccanismo patogenetico della malattia e definite come biomarcatori primari. Nonostante ciò, il liquor rappresenta comunque un tessuto di difficile accesso. Il laboratorio in cui sto svolgendo il Dottorato si è pertanto concentrato su altri tipi di tessuti, come fibroblasti o cellule del sangue ed è stata dimostrata una interessante correlazione tra AD e un fattore di trascrizione denominato p53. Infatti, pazienti affetti da AD sembrano esprimere uno stato conformazionalmente mutato di p53, che permette la loro discriminazione da controlli sani di pari età o soggetti affetti da altre demenze. Tali indicazioni hanno incoraggiato il gruppo di ricerca in cui mi trovo ad investigare ulteriormente il funzionamento biologico di questa proteina, durante questo primo anno di dottorato. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio di linfociti immortalizzati di pazienti con forma famigliare di malattia di Alzheimer (definiti come ADmut) e soggetti con AD sporadico, che hanno sviluppato precocemente la malattia (denominati EOSAD, Early Onset Sporadic Alzheimer s Disease).

4 Risultati Stato conformazionale di p53 nei linfociti di soggetti sani, ADmut e EOSAD Lo stato conformazionale di p53 in linfociti immortalizzati derivanti dai soggetti dei predetti gruppi è stato studiato mediante tecnica di immunoprecipitazione, usando due peculiari anticorpi: PAb1620 e PAb240, che riconoscono rispettivamente la struttura terziaria correttamente foldata di p53 e quella unfolded; gli immunoprecipitati sono stati poi analizzati mediante Western Blot. Dagli esperimenti effettuati si evince che i linfociti dei controlli sani esprimono un intensa banda a livello di p53 wild-type, dimostrata dalla reattività con il PAb1620, mentre mostrano una scarsa positività al PAb240 (unfolded p53) (Fig.1 A-B). Sono state analizzate diverse linee cellulari (EOSAD n=10, ADmut n= 9, controlli sani n=11) e ciò ha reso possibile l identificazione di due profili ben distinti del fenotipo di p53: una forma correttamente foldata presente soprattutto nei controlli e una con struttura terziara unfolded che sembra trovarsi per lo più nei linfociti dei pazienti AD. Questi due patterns sono stati rappresentati mediante il rapporto PAb240/PAb1620, che è risultato essere statisticamente più elevato nei pazienti EOSAD e ADmut rispetto ai soggetti controllo (Fig.1C).

5 Fig.1: Stato conformazionale di p53 nei linfociti di pazienti EOSAD, ADmut e controlli sani. (A-B) Blots rappresentativi dei linfociti analizzati derivanti da campioni ADmut (n=4), EOSAD (n=3) e controlli (n=2). Gli anticorpi usati per immunoprecipitare gli estratti proteici sono stati omessi nel campione denominato bianco. ( C ) Rapporto tra l intensità di PAb240 su PAb1620, ottenuta dai linfociti di soggetti controllo (n=10), EOSAD (n=11) e ADmut (n=9). La barra rappresenta il valore medio di ogni gruppo. I dati sono espressi come media ± SEM. * p<0,001 Profilo ossidativo dei linfociti di pazienti EOSAD e ADmut E noto in letteratura che il cambiamento conformazionale di p53 può avvenire in seguito a modificazioni post-trascrizionali; numerosi studi hanno infatti riportato che l ossidazione del residuo cisteinico all interno della sequenza deputata al legame con il DNA possa influire sullo stato conformazionale di questa proteina. Inoltre, negli ultimi anni è stata postulata per la malattia di Alzheimer una teoria che prevede un aumentato stress ossidativo alla base della patologia. Nel mio gruppo di ricerca abbiamo quindi valutato il profilo ossidativo dei linfociti dei pazienti AD, misurando l espressione di molecole ritenute dei marcatori di stress ossidativo e l attività dei sistemi anti-ossidanti, nonché il loro influsso su p53. I marcatori dello stress ossidativo sono: il 4-idrossi-nonenale (HNE), un prodotto della perossidazione lipidica, che mediante l addizione di Michael è in grado di legarsi alle proteine; la 3-nitrotiroxina (3NT), derivante dalla nitrazione proteica e infine i carbonili proteici (PC), risultanti dall ossidazione delle proteine. Questi sono stati misurati nei linfociti degli individui presi in esame mediante tecnica di Dot Blot. (Fig.2) Dai risultati che abbiamo ottenuto si evince che i livelli di HNE e 3NT sono statisticamente aumentati nei linfociti di pazienti ADmut rispetto ai controlli (media ± SEM 1,12 ±0.49 vs 0,68 ±0,26; 1,8 ± 1,2 vs 0,38 ±0,2 per HNE e 3NT rispettivamente) (Fig.2 A-B), mentre non sono state rilevate differenze significative

6 dal confronto tra i campioni EOSAD e i corrispettivi soggetti sani. Per quanto riguarda, invece, i livelli dei carbonili proteici, non sono state riscontrate diversità significative nelle tre linee cellulari prese in esame (Fig.2.C). E stata studiata infine l attività dell enzima superossidodismutasi (SOD), coinvolto nei processi antiossidanti della cellula. La sua attività risulta statisticamente diminuita nei pazienti ADmut rispetto ai controlli (media ± SEM = 24 ±3,2 vs 39 ± 4,5 rispettivamente per ADmut e cellule di controllo). Anche i linfociti di individui EOSAD presentano un attività inferiore di questo enzima, come si evince dal confronto con i soggetti sani (media ± SEM = 32 ±2,8), anche se tale discrepanza non è significativa dal punto di vista statistico (Fig.2D). D Fig.2: Profilo ossidativo nei linfociti di soggetti EOSAD, ADmut e controlli sani. (A-B-C) Analisi di Dot Blots su estratti proteici derivanti da linfociti di controlli sani (n=10), EOSAD (n=11) e ADmut (n=9) ottenuta usando specifici anticorpi contro marcatori di stress ossidativo: HNE, 3NT e PC. L espressione della tubulina è stata usata per normalizzare i dati. *p<0,05 controlli vs ADmut. (D) L attività dell enzima superossido dismustasi (SOD) è stata misurata in linfociti di soggetti sani (n=10), EOSAD (n=11) e ADmut (n=9). I dati sono stati espressi come % dell attività dell enzima SOD. *p<0,05 controlli vs ADmut.

7 Il profilo ossidativo di p53 è stato valutando immunoprecipitando la proteina con anticorpi specifici per la sua conformazione wild type e mutata e rivelando in seguito la membrana con anticorpi anti-hne e anti-3nt; i dati sono stati infine normalizzati con i livelli di p53 wt e mutato (Fig. 3A). Nelle tre linee cellulari analizzate non sono stati trovati risultati significativi per quanto riguarda i livelli del legame tra il marker di stress ossidativo HNE e p53 (media ± SEM: cellule di controllo:p53-wt 0,60 ± 0,27, p53mut 0,82± 0,31; linfociti ADmut p53 wt 2,7 ± 1,68 p53 mut 2,9 ± 1,81; EOSAD p53wt 1,28 ± 1,00 p53mut 2,8 ± 1,4 ) (Fig. 3B). Fig.3: Livelli del legame di HNE con p53 wt e conformazionalmente mutato in linfociti di soggetti controllo, EOSAD e ADmut. Uguali quantità di estratti proteici di soggetti controllo, EOSAD, e ADmut sono state immunoprecipitate con anticorpi specifici p53 wt e conformazionalmente mutato; gli immunoprecipittai ottenuti sono stati infine analizzati per la loro reattività con HNE mediante Western Blot. (A) Blot rappresentativo del dato ottenuto dai linfociti del paziente PS1P117R mut (n=1), EOSAD (n=1) e rispettivo controllo sano (n=1). (B) Analisi sull intensità delle bande ottenute dai campioni controllo (n=10), EOSAD (n=11) e ADmut (n=9). L espressione di p53 è stata usata per normalizzare l intensità di ogni banda. La barra rappresenta il valore medio di ogni gruppo esaminato. I dati sono espressi come media ± SEM.

8 La misurazione della quantità di tirosina nitrosilata presente su p53 ha mostrato una banda più intensa nei campioni immunoprecipitati con l anticorpo PAb240 rispetto a quelli trattati con Pab1620 (Fig.4 A). Dall analisi dei linfociti esaminati è risultato un aumento statisticamente significativo dell espressione di p53-3nt in entrambi i pazienti EOSAD e ADmut rispetto ai controlli, quando la proteina si trova nella sua struttura conformazionalmente mutata, riconosciuta dall anticorpo Pab240(media ± SEM:celllule di controllo: p53-wt 0,86 ± 0,7, p53mut-like 1,01± 0,5; linfociti ADmut p53 wt 1,28 ± 0,60 p53 mut-like 3,82 ± 0,64; EOSAD p53 wt 0,78 ± 0,35 p53 mutlike 4,00 ± 0,8) (Fig. 4B). Fig.4: Livello di nitrazione di p53 wt e conformazionalmente mutato in linfociti di soggetti controllo, EOSAD e ADmut. Uguali quantità di estratti proteici di soggetti controllo, EOSAD, e ADmut sono state immunoprecipitate con anticorpi specifici p53 wt e conformazionalmente mutato; ; gli immunoprecipittai ottenuti sono stati infine analizzati per la loro reattività con 3NT mediante Western Blot. (A) Blot rappresentativo del dato ottenuto dai linfociti del paziente PS1P117R mut (n=1), EOSAD (n=1) e rispettivo controllo sano (n=1). (B) Analisi sull intensità delle bande ottenute dai campioni controllo (n=10), EOSAD (n=11) e ADmut (n=9). L espressione di p53 è stata usata per normalizzare l intensità di ogni banda. La barra rappresenta il valore medio di ogni gruppo esaminato. I dati sono espressi come media ± SEM. *p<0,01

9 Discussione Nel laboratorio di ricerca in cui sto svolgendo il corso di Dottorato è stato dimostrato come la misurazione dello stato conformazionale di p53 sia in grado di distinguere tra pazienti affetti da malattia di Alzheimer e controlli sani. I risultati ottenuti in precedenza ci hanno incoraggiato a proseguire questo studio, focalizzandoci su cellule del distretto periferico. Abbiamo utilizzato linfociti immortalizzati di controlli sani e di due particolari gruppi di pazienti: il primo include una coorte di individui recanti mutazioni nei geni coinvolti nel meccanismo patogenetico della malattia quali presenilina 1, presenilina 2 e il gene APP (proteina precursore dell amiloide); questo gruppo è stato definito ADmut, in quanto alcuni soggetti portano la mutazione, ma non sono affetti da AD. Il secondo, invece, comprende individui con malattia di Alzheimer sporadico, ma con inizio della malattia precoce, ovvero prima dei 50 anni e per tale motivo questi pazienti sono stati definiti come EOSAD (Early Onset Sporadic Alzheimer s Disease). Anche in questi due peculiari gruppi sono state confermate le osservazioni precedenti riguardo l espressione di p53 unfolded, in grado di discriminare tra individui affetti dalla malattia e soggetti controlli. Di particolare rilevanza è una paziente di nove anni con la mutazione nel gene PS1, PS1S170F, la cui madre, portatrice della stessa mutazione, è affetta dalla malattia. La ragazza, naturalmente, non mostra alcun segno della patologia, anche se i suoi linfociti esprimono un valore di p53 unfolded pari a 0,80 ± 0,6 e sua madre di 1,05 ± 0,8. Da questo caso e dagli altri campioni analizzati possiamo affermare che l alterazione di tale proteina persiste anche nei linfociti immortalizzati derivanti da pazienti EOSAD e ADmut, evidenziando come questo cambiamento conformazionale non sia secondario alla malattia, ma rifletta proprietà intrinseche della patologia stessa. Oltre a ciò, è possibile notare che la mutazione conformazionale di p53 non è correlata a nessun tipo di mutazione in particolare, ma è riscontrabile indistintamente in tutti gli individui ADmut analizzati. E noto in letteratura che gli intermedi reattivi dell ossigeno (ROS) svolgono una funzione importante nell attivazione del pathway di p53. Questi potrebbero quindi avere un ruolo nell induzione del cambiamento conformazionale di p53, influenzando lo stato redox della proteina. Abbiamo quindi studiato il profilo ossidativo dei linfociti di pazienti EOSAD e ADmut e dei rispettivi controlli sani, misurando molecole considerate marcatori di stress ossidativo e l attività di enzimi antiossidanti come l enzima SOD. Dalle analisi effettuate abbiamo riscontrato un significativo aumento dei livelli di HNE e 3NT, entrambi marcatori di stress ossidativo, e una diminuzione dell attività

10 dell enzima SOD; la peculiarità sta nel fatto che le diversità più significative si trovano nei pazienti ADmut rispetto ai controlli sani. Ciò evidenzia una perdita dell equilibrio nel profilo ossidativo di individui ADmut, ma non in soggetti affetti da AD sporadico. Questa discrepanza trova conferme anche in letteratura, dove è stato dimostrato che la capacità antiossidante in linfoblasti di pazienti affetti da AD sporadico risulta essere virtualmente indistinguibile da quella dei rispettivi controlli sani. Ci siamo infine concentrati sul profilo ossidativo di p53, ipotizzando un ruolo delle specie reattive dell ossigeno nel cambiamento conformazionale di questa proteina. Abbiamo pertanto misurato il grado di ossidazione delle isoforme di p53 wild-type e mutata, dimostrando un aumento della nitrazione di questa proteina nella sua forma mutata, sia nei pazienti EOSAD che ADmut, confrontati con i rispettivi controlli sani. Il dato ottenuto è molto importante in quanto dimostra che, anche se nei pazienti EOSAD non è possibile caratterizzare il livello di stress ossidativo nel distretto periferico, ciò è possibile mediante la quantificazione dello stato di nitrazione di p53. Conclusioni I risultati ottenuti durante il primo anno di Dottorato hanno confermato i precedenti studi svolti dal gruppo di ricerca in cui mi trovo, ma aprono anche nuove questioni da approfondire nel prossimo futuro, soprattutto per quanto riguarda il significato da attribuire alle modificazioni conformazionali di p53 nella patogenesi di AD. In letteratura numerosi studi hanno dimostrato che proteine dotate di un cambiamento conformazionale possono assumere nuove funzioni; a questo proposito sembra che p53 nella sua forma mutata sia in grado di attivare nuovi geni. Questa ipotesi va ulteriormente investigata ed è quanto ci proponiamo di fare in avvenire. Durante questo primo anno di Dottorato ho anche partecipato ad un progetto di ricerca sul neuroblastoma, in cui l utilizzo di due inibitori della gamma secretasi utilizzati in combinazione con l acido retinoico sembrano inibire la crescita e il differenziamento di questo tumore maligno.

11 PUBBLICAZIONI Targeting Notch pathway induces growth inhibition and differentiation of neuroblastoma cells. Ferrari-Toninelli G, Bonini SA, Uberti D, Buizza L, Bettinsoli P, Poliani PL, Facchetti F, Memo M. Neuro Oncol Aug 17. Role of oxidative stress in p53 conformational changes: a study on two peculiar cohorts of Alzheimer s disease patients Giovanna Cenini, Cristina Lanni, Giulia Ferrari-Toninelli, Laura Buizza, Stefano Govoni, Marco Racchi, Maria Barcikowska, Maria Styczynska, Aleksandra Szybinska, David Allan Butterfield, Maurizio Memo, Daniela Uberti Submitted for publication 2010