La biologia molecolare come utile ausilio nella gestione delle infezioni correlate all assistenza

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1 La biologia molecolare come utile ausilio nella gestione delle infezioni correlate all assistenza Andrea Orsi Dipartimento di Scienze della Salute (DiSSal) Università degli Studi di Genova

2 INFEZIONE RILEVAMENTO MICRORGANISMO/I RESPONSABILE/I DIAGNOSI

3 Rilevamento di microrganismi infettivi in era pre-molecolare Cosiddette metodiche convenzionali : Microscopia, colorazione di Gram Isolamento in adeguati terreni di coltura Colture cellulari Rilevamento di antigeni (immunocromatografia) Sierologia e immunosierologia (emagglutinazione, EIA, fissazione del complemento, immunofluorescenza) Limiti: Time-consuming Intensa attività di laboratorio Potenziali rischi per gli operatori Scarse sensibilità e specificità Non sempre applicabili Non utili in pz immunocompromessi Operatore dipendente

4 PCR 1983, Kary B. Mullis (1993 Nobel)

5 Il futuro? High-throughput sequencing technologies (so-called next-generation sequencing, NGS) New single-molecule sequencing technologies able to eliminate template amplification steps, avoiding errors in the DNA polymerization chemistry and reaching multikilobase reads (thirdgeneration sequencing technologies) Whole Genome Sequencing (WGS) Array-based and mass spectrometry -based approaches Proteomics and Proteogenomics era Integration of novel biomarkers identified by means of genomics and proteomics into dedicated Point-Of-Care diagnostic tools

6 Lo strumento molecolare per il controllo e la prevenzione delle malattie infettive Rilevamento di microrganismi Identificare l agente causale di una sindrome... ricadute epidemiologiche e terapeutiche Anticipare la diagnosi nel periodo finestra Valutare la risposta alla terapia Identificare la contaminazione ambientale o alimentare Caratterizzazione di microrganismi Studiare l ecologia, i determinanti di patogenicità e virulenza,... Studiare il pattern antigenico: update, valutazione dell efficacia di un vaccino,... Valutare la comparsa di resistenze... ricadute epidemiologiche e terapeutiche Stimare l incidenza, quindi il dato atteso, quindi la soglia epidemica,... Gestire un epidemia: origine, tracing,... Valutare l efficacia di un intervento Disegno e produzione di vaccini I vaccini ricombinanti e a DNA

7 Pros & Cons delle metodiche molecolari (I) Rapidità Sensibilità (possibilità di amplificare target multipli e di identificare più microrganismi o anche una frazione di un singolo microrganismo) Specificità (uso di protocolli specie-specifici) Applicabile virtualmente ad ogni microrganismo Applicabile negli stadi precoci dell infezione Massima flessibilità (bassa quantità microrganismo) Quantificazione del microrganismo Utile in pz che hanno risposta anticorpale bassa o nulla (immunosoppressi)

8 Costi Falsi positivi Falsi negativi Pros & Cons delle metodiche molecolari (II) Significato clinico delle positività Contaminazione verticale Contaminazione orizzontale (tra campioni diversi) Contaminazioni al momento del campionamento DNA esogeno nei reagenti Primers non specifici Condizioni di amplificazione non adeguate Mutazioni nei geni target Presenza di inibitori della polimerasi (ad es. sali biliari, complessi polisaccaridici delle feci, gruppo eme, proteinasi del latte, urea, nucleasi dei fluidi biologici) Fasi di lisi e digestione non adeguate = non si libera sufficiente acido nucleico Materiale di partenza scarso Conservazione del campione o dell estratto non corretta Protocollo poco sensibile

9 Perché Impiegare Tecniche Molecolari nella Diagnostica e nella Sorveglianza delle Malattie Trasmissibili in Ospedale e sul Territorio Rilevamento Caratterizzazione dei microrganismi Analisi della loro distribuzione Rapporti con ambiente e ospite Elevata sensibilità Capacità discriminatoria Rapidità

10 Perché Impiegare Tecniche Molecolari nella Diagnostica e nella Sorveglianza delle Malattie Trasmissibili in Ospedale e sul Territorio Management del pz Rilevamento Caratterizzazione dei microrganismi Analisi della loro distribuzione Rapporti con ambiente e ospite Stimare l incidenza delle infezioni da microrganismi alert Individuare i fattori di rischio Stimare, il cut-off epidemico, superato il quale, avviare l indagine epidemiologica Implementare l analisi molecolare per la conferma Elevata sensibilità Capacità discriminatoria Rapidità diagnostica e la caratterizzazione degli isolati al fine di - individuare la fonte di infezione - distinguere tra relapse e re-infezione - definire il percorso del microrganismo (tracing), consentendo di individuare punti critici e di migliorare le procedure di controllo Stimare l incidenza Stimare il cut-off epidemico Early warning Tracing Herd Immunity Individuazione dei fattori di rischio Valutazione delle misure di controllo

11 Rapidità dei Test Molecolari Studio sperimentale: introduzione di screening con real time PCR (<1 giorno) per rilevamento di MRSA versus coltura (3 giorni) Popolazione dello studio: 1305 pz (612 es. colturale e 693 PCR) Setting: 1 ICU (19 letti) in un ospedale universitario inglese Intervento: se screening pos muporicina/triclosan, rafforzamento misure STD Cunningham R et al. J Hosp Infect 2007

12 Microbiologia tradizionale: 3/5 gg settimane WGS: 0/2 gg

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14 Outbreak of carbapenem-resistant K. pneumoniae at the U.S. National Institutes of Health (NIH) Clinical Center [a 243-bed clinical research hospital] that colonized 18 patients, with 6 deaths attributable to K. pneumoniae infection (10 total deaths).

15 The outbreak was monoclonal, despite a 3-week interval between the index case and the identification of subsequent cases, transmission likely occurred from at least two different sites of the index patient, at least three independent transmission events from the index patient led to two major clusters of colonized patients, one patient could be linked to a contaminated ventilator.

16 Main Points Approccio molecolare strumento insostituibile per il controllo delle infezioni nosocomiali early warning inizio dell indagine epidemiologica Individuare la fonte dell infezione management del pz tracing miglioramento delle procedure

17 L approccio molecolare è indubbiamente utile. È anche cost-effective e cost-save? SI, in numerosissime esperienze, sia in situazioni di endemia che di evento epidemico (Peterson LR et al. 1993; Bodbar et al. 1996; Scheckler et al. 1998; Hacek et al. 1999; Peterson et al. 2001; Peterson et al. 2002; Dikema et al. 2004; Singh et al. 2006) La valutazione dell introduzione delle tecniche molecolari di tipizzazione batterica al Northwestern Memorial Hospital di Chicago, durata 7 anni, ha messo in luce la diminuzione dell incidenza di infezioni nosocomiali e del numero di pazienti infetti rispettivamente del 13% e 23%, con un risparmio annuale di $ e di $ 5 per ogni dollaro investito nel programma (Peterson LR et al. 1993; Peterson et al. 2001; Peterson et al. 2002).

18 DIAGNOSTICA RAPIDA ATTIVITÀ DI CONTROLLO RAPIDA? MAGGIORI RISORSE PER DIAGNOSTICA MAGGIORI RISORSE PER ATTIVITÀ DI CONTROLLO

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