Coagulazione del sangue

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1 Coagulazione del sangue

2 Emostasi e il processo che mantiene l integrita del sistema circolatorio, sistema chiuso ad alta pressione, a seguito di lesione vascolare caratteristiche - rapidità - localizzazione - reversibilità

3 EMOSTASI = arresto della perdita di sangue

4 MECCANISMI EMOSTATICI Componenti costituenti della parete vascolare componenti cellulari del sangue proteine plasmatiche

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6 Endothelium and vessel injury Vessel injury Antithrombogenic (Favors fluid blood) Thrombogenic (Favors clotting)

7 Anticoagulant Properties of the Endothelium Anti-platelet properties Covers highly thrombogenic basement membrane Uninjured endothelium does not bind platelets PGI2 (prostacyclin) and NO from uninjured endothelium inhibit platelet binding ADPase counters the platelet aggregating effects of ADP

8 Anticoagulant properties of the endothelium * HEPARIN-LIKE MOLECULES: activate Anti-thrombin III (inactivates active proteases) * THROMBOMODULIN: changes specificity of thrombin (activates protein C, which inactivates factors Va and VIIIa * Endothelial cells produce t- PA which activates fibrinolysis via plasminogen to plasmin

9 Prothrombotic Properties of the Endothelium Synthesis of von Willebrand factor Release of tissue factor, TF Production of plasminogen activator inhibitors (PAI) Membrane phospholipids bind and facilitate activation of clotting factors via Ca++ bridges

10 Response to vascular injury Furie B, Furie B. N Engl J Med 2008;359:

11 Emostasi Fase vascolare riduzione del lume vascolare riduzione del flusso Fase piastrinica formazione del tappo piastrinico Fase coagulativa formazione del coagulo di fibrina Fase fibrinolitica dissoluzione del coagulo

12 Fase vascolare riduzione del lume vascolare

13 Emostasi Fase vascolare riduzione del lume vascolare: Contrazione della muscolatura vasale Vasocostrizione periferica Fase piastrinica formazione del tappo piastrinico: Adesione Cambiamento di forma Degranulazione Aggregazione

14 Fase piastrinica formazione del tappo piastrinico

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16 ADESIONE-AGGREGAZIONE PIASTRINICA Resting platelets N Engl J Med 2011;364:

17 Sindromi emorragiche correlate alle piastrine

18 Emostasi Fase vascolare riduzione del lume vascolare: Contrazione della muscolatura vasale Vasocostrizione periferica Fase piastrinica formazione del tappo piastrinico: Adesione Cambiamento di forma Degranulazione Aggregazione Fase coagulativa formazione del coagulo di fibrina: Cascata di reazioni enzimatiche Fase fibrinolitica dissoluzione del coagulo: Attivazione del sistema fibrinolitico

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20 Coagulation Cascade Enzymatic cascade (amplification) Several serine-proteases Produced by liver (most) Synthesis requires Vitamin K (several) 3 protein cofactors (not enzymes) Requires Ca 2+ Localized to site of injury Reversible (via production of plasmin)

21 Proteine della coagulazione Proteine plasmatiche, complessivamente: 3 mg/ml Sintetizzate per la maggior parte nel fegato Molte sono serina-proteasi e circolano come zimogeni

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23 VIA INTRINSECA Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

24 Via intrinseca: attivazione da contatto

25 FATTORE TISSUTALE rincipale trigger fisiologico della cascata coagulativa Proteina transmembrana che serve come recettore di superficie e cofattore essenziale per il FVIIa Si lega al FVIIa, il complesso TF-FVIIa acquista attività catalica e attiva i fattori X e IX Presente sulle membrane dei fibroblasti (adventitia), cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) e periciti. In condizioni normali non presente sulla membrana di monociti e cellule endoteliali, nelle quali però può essere espresso a seguito di diversi stimoli. Espresso anche da cellule tumorali.

26 Agenti in grado di indurre l espressione di TF sulle cellule endoteliali, monociti, VSMCs e piastrine Virus, batteri Endotossine Complessi immuni Proteina C reattiva Interleuchine (IL-1, TNF) Trombina

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30 Prothrombin Activation Complex

31 Modificazione post-traduzionale: γ carbossilazione Dominio GLA nella regione ammino- terminale della Protrombina (Factor II) contenente residui di acido γ carbossiglutammico (Gla)

32 VITAMIN K Group of related, fat soluble compounds, which differ in the number of side-chain isoprenoid units Plant derived (vitamin K 1 ) and synthesized by intestinal bacteria (vitamin K 2 ) The reduced form of vitamin K (vitamin KH 2 ) is required for the post-translational, gammacarboxylation of several proteins involved in blood clotting

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34 γ - carbossilazione e ciclo della vitamina K

35 Vitamin K antagonists

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37 ATTIVITA PROCOAGULANTI della TROMBINA IXa Prothrombin VIII VIIIa Xa Va V Fibrinogen Thrombin Fibrin Soft clot XIIIa Hard clot Fibrin

38 Danno tissutale CASCATA COAGULATIVA TF trombina VIA INTRINSECA (PROPAGAZIONE) TF/FVIIa FXIa FXI TF/FVII FVIIa, FIXa, FXa FIX FIXa FIX TF/FVIIa FVIIIa FXa, trombina FVIII VIA ESTRINSECA (INIZIO) FX FXa FX FVa FXa, trombina FV PT TROMBINA Fibrinogeno Fibrina

39 La trombina attiva due cofattori della coagulazione VIII V Thrombin (IIa) VIIIa Va

40 Specificità enzimatica TRIPSINA TROMBINA

41 Fibrinogeno

42 Fibrinogeno Fibrina 3 g/l in plasma, sintetizzato nel fegato, ( ) 2 La trombina converte il fibrinogeno solubile in fibrina insolubile Stabilizzazione con fattore XIII

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45 STABILIZZAZIONE DELLA FIBRINA

46 Fibrin clot

47 Coagulazione: cascata enzimatica Un segnale iniziale innesca una serie di tappe, ciascuna delle quali è catalizzata da un enzima. Il segnale viene amplificato in ciascuna tappa. La coagulazione del sangue è effettuata da una cascata di attivazione di zimogeni: la forma attiva di un fattore di coagulazione catalizza l attivazione di quello successivo FVIIa 10 4 FX FXa 10 6 Protrombina Trombina 10 8 Fibrinogeno Fibrina

48 DOMINII PROTEICI NEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE

49 CONCETTO DI DOMINIO PROTEICO Un dominio può quindi essere definito come un unità strutturale, con ripiegamenti tridimensionali, che costituisce una unità funzionale autonoma rispetto al resto della proteina, di solito è evolutivamente conservata I domini proteici vengono di solito identificati e classificati rispetto alle loro caratteristiche strutturali, funzionali ed evolutive.

50 Dominii proteici nei fattori della coagulazione

51 FVII FIX IA IB II II I IV V VI VI I VI II I II II I IV V VI VI I VI II pep tide segnale dom ini o Gla arom atic stack FX PC I I II II II I II I IV IV V V VI VI VI I VI I VI II VI II EGF at tivazion e dom ini o cata litico do minio Krin gle repeat Protrom bi na II I II II I II I IV IV V V VI VI VI I VI I VI II IX VI II X IX XI X XI I XI XI II XI I XI V XI II XV XI V regione om ologa alla fibron ectina I regione om ologa alla fibron ectina II FXI I II II I IV V VI VI I VI II IX X XI XI I XI II XI V FXII Struttura genica e pro teica di serina proteasi della coagulazio ne

52 Meccanismi di inibizione del processo coagulativo Inibizione aspecifica diluizione rimozione epatica adsorbimento della trombina sulla fibrina Inibizione specifica TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) Antitrombina Proteina C

53 SISTEMI ANTICOAGULANTI ENDOGENI Inibitore del fattore tissutale (TFPI): FVIIa-FT Sistema Antitrombina-eparina: XIIa, XIa, IXa, Xa, IIa, VIIa Sistema della Proteina C: Cofattori VIIIa, Va

54 REGOLAZIONE DELLA CASCATA COAGULATIVA Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) Tissue Factor Inibitori delle Serin Proteasi (Serpine) VII IX VIII X V Protrombina Proteina C attivata (APC) Proteina S (PS) Trombina

55 Tissue Factor Pathway Inhibitor IXa IX Prothrombin (II) VIIa Xa TF Thrombin (IIa) TFI TFPI NB: Inhibition of Xa and VIIa

56 CARATTERISTICHE ANTITROMBINA (AT) Glicoproteina plasmatica, che agisce da inibitore delle serina proteasi formando un complesso in rapporto 1:1 con l enzima. Ne rende inaccessibile il sito catalitico al substrato fisiologico. Processo irreversibile: COSTOSO!

57 SISTEMA ANTITROMBINA-EPARINA Antitrombina (AT) Anticoagulante plasmatico Appartiene alla famiglia delle SERPINE (inibitori delle serin proteasi) Inibisce trombina, FXa e altre serin proteasi della coagulazione (FIXa, FXIa, FXIIa) L attività inibitoria viene potenziata dall interazione con il proprio cofattore (eparina) Eparina Glicosaminoglicano (GAG) altamente solforato. Prodotta e rilasciata dai mastociti associati all endotelio. Azione anticoagulante indiretta: cofattore dell AT.

58 INIBIZIONE IRREVERSIBILE DELLE SERIN PROTEASI In assenza di eparina l ATIII è un inibitore lento Il legame ATIII-eparina induce cambiamenti conformazionali che convertono ATIII in un rapido inibitore L eparina si dissocia dal complesso per essere riutilizzata.

59 INIBIZIONE DELLA TROMBINA Complesso ternario: eparina fa da ponte tra ATIII e trombina ABD: ATIII binding domain (pentasaccaride) TBD: thrombin binding domain Petitou et al, 2004 Eparina > 18 unità saccaridiche catalizza inibizione trombina Eparina < 18 unità saccaridiche catalizza inibizione FXa

60 ANTITROMBINA-EPARINA L eparina si lega (mediante il pentasaccaride) ad alcuni residui dell ATIII, i più importanti dei quali sono: Lys114 - Lys125 - Arg129 Costituiscono il core del gruppo di aminoacidi che interagiscono cooperativamente per legare l eparina mediante interazioni ioniche e non. EPARINA : il polisaccaride più acido del corpo umano, per tale motivo interagisce con molte specie cationiche

61 Fibrinogeno Fibrina Procoagulante TROMBINA Anticoagulante Proteina C APC

62 Dual role of Thrombin

63 ATTIVAZIONE DELLA PC Circola nel plasma come zimogeno, finchè non si lega all EPCR (Recettore Endoteliale della PC), proteina trasmembrana. Per esser attivata necessita della Trombina! Ma non Trombina in soluzione. TM = Trombomodulina, anch essa proteina trasmembrana, espressa costitutivamente dalle cellule endoteliali T M T PC EPC R APC La trombina complessata alla TM attiva la PC La PC attivata (APC) si stacca dall EPCR

64 FUNZIONI ANTICOAGULANTI DEL SISTEMA DELLA PC FVa FVi PS APC FVa T M T PC EPC R FV FVIIIa FVIIIi PS APC FVIIIa

65 La proteina C attivata: Neutralizza le forme attivate dei fattori V e VIII (attivita anticoagulante) Forma complessi circolanti con il PAI-1 (attivita profibrinolitica)

66 Non-physiologic inhibitors of coagulation Vitamin K antagonists (in vivo only) Ca++ chelators (in vitro only) EDTA Citrate Oxalate * Heparin (in vivo and in vitro)

67 Emostasi Fase vascolare riduzione del lume vascolare: Contrazione della muscolatura vasale Vasocostrizione periferica Fase piastrinica formazione del tappo piastrinico: Adesione Cambiamento di forma Degranulazione Aggregazione Fase coagulativa formazione del coagulo di fibrina: Cascata di reazioni enzimatiche Fase fibrinolitica dissoluzione del coagulo: Attivazione del sistema fibrinolitico

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69 FIBRINOLYSIS Plasminogen tpa Fibrin Plasmin fibrin degradation products Endothelial cells produce tpa

70 FIBRINOLYSIS and restoration of vessel wall integrity

71 Dissoluzione del coagulo (fibrinolisi) Nel coagulo di fibrina è presente il plasminogeno Plasminogeno plasmina Enzimi attivatori: Tissue Plasminogen Activator (tpa) e urokinasi Inibito da PAI-1 e 2 -antiplasmina Plasmina (serina proteasi) degrada la fibrina (proteolisi)

72 FIBRINOLYSIS

73 Stimolazione della Fibrinolisi nel trattamento dell infarto del miocardio Farmaci fibrinolitici (cura dell infarto del miocardio) tpa ricombinante Streptokinasi Urokinasi Dopo infusione di TPA dissoluzione del coagulo Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

74 Trombofilia predisposizione alla trombosi ereditaria trombofilia familiare acquisita