SCREENING PRENATALI PER LA S. DI DOWN

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1 SCREENING PRENATALI PER LA S. DI DOWN CENTRO DI DIAGNOSI PRENATALE PALERMO Le cromosomopatie, o aneuploidie, con una prevalenza alla nascita di circa 1/700, costituiscono una delle principali cause di mortalità perinatali. Ciò spiega lo sforzo effettuato, negli ultimi 15 anni, dalla Comunità Scientifica per mettere a punto una tecnica di screening in grado di individuare i casi a rischio nell ambito della popolazione generale. Vi sono ancora significative controversie sulla necessità e sulla scelta dei metodi di screening durante la gravidanza, in particolare quando questi riguardano la Sindrome di Down. In definitiva comunque in quasi tutti i paesi viene utilizzato un qualche metodo di screening per identificare le gravide a rischio maggiore. L eta materna Sino a poco tempo fa l identificazione dei casi a rischio era basata soltanto sull età materna, sappiamo tutti infatti come la prevalenza delle cromosomopatie, e della S. di Down in particolare, aumenta parallelamente al crescere dell età materna. Questo parametro di screening da solo si è dimostrato alla fine poco efficace. Nella realtà italiana le pazienti di 35 o più anni (over 35) rappresentano più dell 11% circa della popolazione complessiva delle gravide, e quelle di 37 o più anni sono il 5% circa. Dato che solamente il 25% circa dei Down nasce da donne over 37, anche se potessimo, almeno in teoria, sottoporre a diagnosi prenatale tutte le donne over 37 (il 5% del totale), non individueremmo che un quarto circa dei nati Down. Avremmo, quindi, una scarsa efficacia (Detection Efficiency D. E.) ed un elevata percentuale di falsi positivi (False Positive Rate F.P.R.), con costi elevati e perdita di un certo numero di gravidanze per il rischio di aborto insito nella diagnosi prenatale invasiva. Sono stati quindi ricercati altri markers in grado di aumentare la detection efficiency del parametro età materna utilizzato isolatamente. Duo-Test, Tri-Test e Quadruplo-Test L alfa-fetoproteina (AFP) plasmatica materna è elevata in presenza di difetti del tubo neurale del feto e modestamente ridotta nei casi di S. di Down (1). L impiego dell AFP plasmatica come marker della S. di Down, utilizzata unitamente al rischio a priori dell età materna, ha consentito di aumentare del 20% circa la D.E. del solo parametro età, giungendo così ad identificare il 40% circa dei Down (2). L aggiunta di altri markers biochimici, come l HCG intera e l Estriolo non coniugato, ha consentito di migliorare l efficacia del test di screening, così denominato Tri-Test (D.E. del 60% circa), in un periodo compreso fra la quindicesima e ventunesima settimana di gravidanza (3-4). Aggiungendo anche l Inibina si ottiene, invece, il Quadruplo-test che ha una D.E. del 75% circa. L HCG è una glicoproteina prodotta dalla placenta e composta di due subunità, la alfa e la beta. Le due subunità libere (Free-Alfa e Free-Beta) sono anch esse presenti nel circolo materno e la Free-Beta HCG si è dimostrata un marker più efficace, rispetto all HCG intera unita all Estriolo, consentendo di ottenere nel secondo trimestre, se accoppiata all AFP, una D.E. del 70% circa con una F.P.R. del 5% con un test denominabile Duo-Test (5).

2 La Dried Blood Technology Macri (6) ha introdotto una modifica alla raccolta del campione che viene conservato sotto forma di gocce di sangue su speciale carta bibula (dried blood spots tecnology). Il campione viene luito in laboratorio ed il sangue viene processato per il dosaggio degli analiti con metodica ELISA modificata per l uso con dried blood. In tutti i protocolli di screening prenatale l integrità del campione ematico è essenziale per l accuratezza del risultato e ciò è ancora più importante nel caso della Free-Beta, che si altera con grande facilità e rapidità. E stato dimostrato che la quantità misurabile di Free- Beta HCG in un campione di sangue intero aumenta in modo esponenziale in base alla temperatura ed al tempo trascorso fra il prelievo ed il momento del dosaggio. Sancken e Bahner (7) hanno misurato la quantità di Free-Beta HCG in un campione di sangue conservato per 72 ore a 3, 20 e 30 gradi centigradi. Hanno così dimostrato che a 3 gradi non vi sono variazioni significative, mentre a 20 gradi la Free-Beta aumenta del 20% ed a 30 gradi l aumento è superiore al 100%. Il dato che la Free-Beta aumenti in campioni di sangue intero conservati anche per breve tempo è confermato da altri Autori (8-9) ed è legato alla spontanea scissione della molecola di HCG intera nelle due catene che la compongono, Alfa e Beta HCG. Tale osservazione è di primaria importanza per comprendere perché la tecnologia delle dried spots sia essenziale per l attendibilità dello screening. L elevarsi della quantità di Free-Beta HCG, infatti, aumenta in modo sostanziale la percentuale di falsi positivi, dato che maggiore è la concentrazione di Free-Beta maggiore è il rischio statistico per la S. di Down. Se il campione ematico viene invece analizzato subito o conservato su carta bibula non vi è alcuna alterazione nella quantità della Free-Beta. L uso delle dried spots consente appunto una migliore conservazione del campione nel tempo. Il sangue raccolto in tubi di vetro o plastica è, inoltre, soggetto a possibile perdita per la rottura dei contenitori ed è possibile veicolo di contaminazione per il personale. Partendo, quindi, dalla positiva esperienza degli screening neonatali, si è utilizzata questa metodica: ciò consente al prelievo di mantenersi inalterato per più di 10 giorni migliorando la qualità dei risultati di laboratorio. In uno studio su pazienti sottoposte a Duo-Test impiegando la dried spot tecnology (6) è stata ottenuta una D.E. del 75% con una F.P.R. del 2,7%. Questi dati sono quindi qualitativamente superiori a quelli ottenuto con il sangue liquido e già citati in precedenza. In conclusione i vantaggi del dried blood sono molteplici e possono essere così riassunti: 1)facile raccolta del campione, 2) eliminazione della possibile rottura dei tubi di custodia del sangue, 3) ridotto rischio di contaminazione del personale, 4) scomparsa dei problemi di emolisi e deterioramento del sangue con possibilità di spedizione dello stesso anche da zone o paesi molto lontani, 5) maggiore efficacia del test per la riduzione della varianza nei risultati biochimici. Lo Screening Biochimico del Primo Trimestre Lo screening del secondo trimestre ha trovato il suo principale limite nell epoca gestazionale tardiva in cui l iter diagnostico viene completato con l amniocentesi. Diversi studi hanno evidenziato come al terzo mese i livelli di Free-Beta HCG sono due volte la norma nei casi di S. di Down (10). Ciò consente l identificazione del 45% circa dei feti Down nel primo trimestre con un 5% di F.P.R., mentre nel caso di Trisomia 18, invece, la Free-Beta si presenta molto ridotta (0,19 Multipli della Mediana o MoM). L alfa-feto

3 proteina nel primo trimestre non si è dimostrata in grado di individuare i difetti del tubo neurale ed ha scarso significato per le aneuploidie. Più recentemente si è notato come la pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A), un altra glicoproteina prodotta dalla placenta, sia presente in quantità ridotta (0,4 MoM) nel corso del primo trimestre nei casi di S. di Down (11). Lo Screening biochimico del primo trimestre si basa, quindi, sull analisi di questi due marcatori che, avendo fra loro una scarsa correlazione, possono essere utilizzati insieme aumentando la D.E. e riducendo la percentuale di falsi positivi (12). Questi sono, quindi, i presupposti biochimici che hanno avviato negli anni 90 la sperimentazione clinica dello screening biochimico del primo trimestre (Bi-Test). Per ottenere il calcolo finale si moltiplica il rischio biochimico, derivante dalla quantità di Free-Beta e PAPP-A espressa in MOM rispetto alla mediana dell epoca gestazionale, per il rischio a priori relativo all età materna. Viene definito, seppur arbitrariamente, come positivo il test in cui il rischio per S. di Down è superiore a 1/270, che rappresenta la probabilità che una donna di 35 anni, gravida nel corso del terzo mese, partorisca un bambino Down vivo. Abbiamo intrapreso, sin dal 1996, in collaborazione con diversi Centri italiani ed internazionali, uno studio prospettico basato sulla valutazione di Free-Beta HCG e PAPP-A nel primo trimestre di gravidanza con la tecnologia delle dried spots. Tale studio multicentrico si è basato su pazienti esaminate, dal 1995 alla fine del 2003, in epoca gestazionale ecografica compresa fra 9.0 e 13.6 settimane. Tutti i campioni sono stati processati con la metodica sopradescritta presso il Centro di Diagnosi Prenatale di Palermo o presso i Laboratori NTD di New York. Abbiamo osservato una D.E. complessiva, per S. di Down, del 74% sui casi indagati prospetticamente. Visto che il campione comprendeva un numero di donne di età pari o superiore ai 35 anni maggiore rispetto alla attuale situazione delle partorienti in Italia (dati ISTAT), si è operata una correzione statistica per eliminare il bias di osservazione ed il dato, modellato al 5% di falsi positivi, ci ha consentito una D.E. del 63%. Tale dato è sovrapponibile a ciò che si ottiene con lo screening del secondo trimestre, avendo però anticipato di almeno un mese l individuazione delle gravidanze a rischio. Si è comunque rilevato che il test biochimico è tanto più efficace quanto più precocemente viene eseguito il prelievo. A 10 settimane, ad esempio, il test è in grado di individuare il 70% dei feti Down sempre con un 5% di FPR. La Traslucenza Nucale (NT) Nel corso di questi ultimi anni è stato introdotto nella pratica clinica lo screening delle aneuploidie realizzato tramite la misurazione ecografica della Nuchal Translucency (NT), o traslucenza nucale (13-14). Tale metodo si basa, essenzialmente, sulle osservazioni fatte alla fine del 1800 da Down, che notò come la pelle dei soggetti affetti da Trisomia 21 appariva troppo grande per il loro corpo ; questa osservazione trova un riscontro ecografico nel corso del terzo mese di vita intrauterina sotto forma di aumento della NT. La reale patogenesi dell aumento delle dimensioni della falda liquida retronucale (che è comunque presente in tutti i feti in quest epoca gestazionale) non è ancora chiarita. Le ipotesi prevalenti riguardano difetti di funzionamento o di struttura dell apparato cardiovascolare o linfatico, come pure alterazioni della matrice extracellulare documentate dall aumento del collagene VI e dell acido ialuronico nel sottocute dei feti Down. In ogni caso l aumento della NT fra 11 e 14

4 settimane è una espressione fenotipica comune a molte anomalie cromosomiche e muscoloscheletriche, a difetti cardiaci ed a sindromi genetiche. Perché un programma di screening basato sulla misurazione della NT abbia successo,è indispensabile che gli operatori siano adeguatamente istruiti e affinché tale misurazione abbia una reale significatività bisogna attenersi scrupolosamente ad una serie di regole, che sono facilmente applicabili da chi ha esperienza ecografica. In pazienti (118 Down) del nostro studio prospettico sopracitato abbiamo quindi misurato la N.T. secondo i criteri della Fetal Medicine Foundation di Londra, ottenendo una D.E. per il Down, del 79%. Se modelliamo il dato al 5% di falsi positivi la D.E. diviene del 74%. Complessivamente abbiamo ottenuto una D.E. del 74% con la biochimica e dell 79% con la misurazione dell N.T. mentre, modellando il dato al 5% di falsi positivi, la D.E. diviene del 63% per la biochimica e del 74% per la N.T.. L Ultrascreen Dato che però che anche la N.T. ha scarsa correlazione con l età materna e gli analiti biochimici, può essere utilizzata contemporaneamente agli altri parametri per aumentare la D.E. dello screening del primo trimestre, che in questo caso diviene screening combinato (o ULTRA-SCREEN ), che nella nostra esperienza giunge all 89% e riduce la F.P.R. fino al 5% (15-16). Screening del Primo Trimestre per la S. di Down: Detection Efficiancy al 5% Falsi Positivi ( casi) Osservata Modellata (5%FPR) Biochimica 74% 63% Nuchal Trans 79% 74% Biochimica + NT 90% 89% Il progredire del nostro studio multicentrico, che nel frattempo conta più di pazienti, ha confermato questi dati che, vista la significatività del campione studiato, sono ormai stabilizzati, almeno con il nostro protocollo, e molto significativi. Lo screening del I trimestre è, inoltre, particolarmente indicato per le pazienti che si sono sottoposte a tecniche di fertilizzazione assistita. Sappiamo tutti che tali pazienti, seppure spesso di età avanzata, sono in molti casi restie a sottoporsi a tecniche invasive di diagnosi prenatale per timore del rischio di aborto. Lo screening del II trimestre presenta, in queste pazienti, una percentuale più elevata di falsi positivi, mentre il test del I trimestre trova largo impiego in questi casi perché la NT non risulta in nessun modo alterata e solo la PAPP-A si presenta modestamente ridotta, provocando un aumento dei falsi positivi limitato all 1,5% e mantenendo la DE del 90%, come dimostrato dalle esperienze di Liao ed Orlandi (17-18).

5 Il Nucleo di Ossificazione del naso (NB) E nozione comune che in molte anomalie congenite i feti ed i neonati presentino dismorfie facciali. Nei Down la pelle è abbondante e flaccida (vedi NT), la faccia e l occipite piatti, il naso piccolo e tali caratteristiche sono comuni a quasi tutti i soggetti affetti dalla sindrome. Per quanto riguarda l osso nasale (NB), il lavoro pubblicato nel 2001 dalla Fetal Medicine Foundation (21) ha messo in evidenza l associazione della S. di Down con l assenza dell osso nasale; infatti nel 70% circa dei feti affetti dalla S. di Down al controllo ecografico dall 11 alla 14 settimana l osso nasale non era visibile. Studi successivi ( ) e nostri ulteriori dati in corso di pubblicazione, hanno confermato questo dato, seppur riducendone sia la D.E. che la FPR, mentre altri autori hanno criticato l utilizzo di questo marker perché poco significativo e poco attendibile. Se i dati relativi all assenza/ipoplasia dell osso nasale nel I trimestre verranno confermati da studi multicentrici (lo studio di questo marker è sensibilmente più difficile rispetto alla misurazione della NT e richiede ancor di più operatori specificamente addestrati ed ecografi di qualità elevatissima) si passerebbe ad un Quad-Markers Screening (NB + NT + free-beta + PAPP-A) che è stato calcolato consentirebbe di individuare il 95% degli affetti da S. di Down con il 3% di falsi positivi, oppure il 92% con solo l 1% di falsi positivi. Per il momento abbiamo comunque deciso di attendere ulteriori conferme scientifiche prima di inserire il dato relativo al NB nel nostro ben collaudato software di calcolo del rischio. Instant Risk Assessment (IRA) Partendo dall osservazione che la parte biochimica ha una maggiore DE nelle settimane precoci (da 9 a 11) abbiamo messo a punto un nuovo semplice protocollo che offre diversi vantaggi. L IRA richiede che il prelievo di sangue, utilizzando sempre con la tecnologia del dried blood, venga effettuato precocemente, ad esempio fra 9 e 10 settimane di gravidanza, e quindi inviato la laboratorio dove viene analizzato. Quando si è giunti al momento adeguato per misurare la NT la paziente si reca dal ginecologo per l ecografia e trova già pronto l esito della parte biochimica che verrà combinato con l esito dell ecografia. Il medico può collegarsi via internet ad un server dedicato, che contiene già dati e risultato della paziente, o chiamare il laboratorio per telefono ed inserire il valore della NT ricavando in tempo reale il calcolo definitivo del rischio per completare immediatamente il counseling della paziente. Ciò consente di sfruttare a pieno la potenzialità della parte biochimica dello screening ottenendo una maggiore DE (come già evidenziato più precoce è il prelievo maggiore sarà la D.E., e questo dato è confermato anche dallo studio FASTER -20), ed avere il calcolo finale del rischio già a settimane. I vantaggi sono quindi svariati : maggiore DE, maggiore precocità, consulenza ed eventuale prelievo dei villi immediati. Negli Stati Uniti tale protocollo ha incontrato uno straordinario successo, sia presso i medici che presso le pazienti, e pensiamo possa averne altrettanto anche in Italia. Il Test Integrato Negli ultimi anni è stato proposto un differente tipo di screening della S. di Down, detto Test Integrato (19), che si basa sulla integrazione di dati del primo e del secondo trimestre. Nel primo trimestre si dosa la sola PAPP-A e si misura la NT, il risultato non viene comunicato alla paziente e si esegue un quadruplo-test nel secondo trimestre. Ciò

6 consentirebbe di ottenere una elevata D.E., pari o superiore al 90%, riducendo però al 2,5% il numero dei falsi positivi. Tale studio ha ricevuto molte critiche ed è stato in parte superato dallo studio FASTER (20) che ha confermato la validità dello screening combinato del primo trimestre (D.E. dell 87% con un 5% di FPR) ed anche quella del test integrato. Rimane a carico del test integrato il grande svantaggio di fornire il calcolo del rischio almeno un mese più tardi rispetto allo screening del trimestre e tutti sappiamo quanto ciò sia importante sia per la paziente che per la gestione clinica dei casi eventualmente patologici. Il ritardo nella risposta provoca inoltre ansietà, costi maggiori perché la paziente deve tornare due volte per eseguire il test e perché vengono dosate 5 sostanze anziché 2. Rimane, inoltre, da valutare se sia etico non comunicare alla paziente un rischio particolarmente elevato, quale quello derivante da una elevata NT, e rimandare il calcolo del rischio al secondo trimestre di gravidanza. In conclusione : PERCHE ESEGUIRE L ULTRASCREEN? Lo Screening combinato del primo trimestre (Ultrascreen ) ha una D.E. maggiore rispetto ad altri metodi sin qui utilizzati e presenta evidenti e rilevanti vantaggi legati alla precocità della diagnosi. L Ultrascreen è il metodo di screening del I trimestre più sperimentato a livello mondiale, più di pazienti sono già state studiate con questo protocollo. La tecnologia delle dried spots consente la stabilità del campione ematico, non garantita se il dosaggio non viene eseguito immediatamente dopo il prelievo, con evidenti vantaggi per l affidabilità del risultato.

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