Analisi citofluorimetrica dei leucociti residui negli emocomponenti leucodepleti: requisiti tecnici per l'ottimizzazione della metodica Bruno Brando, Barbara Scarpati, Claudia Fazi, Valeria Cantarelli, Luca Santoleri, Domenico Angeloro, Moreno Bauli, Mauro Casiraghi, Colombo Cattalani, Giovanni Inghilleri, Francesco Mercuriali Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale SIMT, Azienda Ospedaliera Ospedale Niguarda-Ca'Granda, Milano Responsabile dello studio: Dott. Bruno Brando Universal leucoreduction is now mandatory in many countries. The wide application of leucoreduction now requires the use of validated and robust low-level leucocyte counting (LLLC) assays. Microbead-based flow cytometric counting methods have proved to be more sensitive, accurate and linear than any other conventional assay, but a number of technical issues which are critical for residual WBC (rwbc) counting are still under testing. Methods. LLLC by single-platform, microbeadbased flow cytometry requires a clearcut positive identification of the very rare rwbc events. This can be best accomplished by a propidium iodide staining buffer containing RNAse and detergent. Instrument cleaning is crucial, and every effort should be made to avoid the undesired acquisition of non-specific Stray Events in the rwbc window. Since leucoreduced products may show a virtual zero rwbc count, the customary acquisition of 100 positive events cannot be usually obtained. A substitute criterion is therefore the acquisition of at least 15 or 20 µl of raw blood product, which can be obtained by monitoring the number of counting beads. The acceptance of cell fragments into the count window is guided by their relative size, as estimated by the rationing between the main rwbc DNA mode and the cell fragment fluorescence intensity. The inclusion of the Time parameter allows the control of the fluidic status throughout the cell run. This method can be safely used as an universal procedure on every existing flow cytometer. With the usage of such guidelines this method can be credited of an interlaboratory CV around 14% at about 3 rwbc/µl, using stabilized leucoreduced blood produced by NIBSC. Results and conclusions. The application of strict but easy to follow laboratory guidelines allows the Ricevuto: 20 giugno 2002 - Accettato: 31 luglio 2002 Corrispondenza: Dott. Bruno Brando Servizio Immunoematologia e Medicina Trasfusionale - SIMT Ospedale Niguarda-Ca'Granda Piazza Ospedale Maggiore 3 20162 Milano precise and accurate detection of rwbc down to the critical range around 0 to 3 rwbc/µl. Parole Chiave: leucodeplezione, leucociti residui, citometria, conta assoluta, emocomponenti Key Words: leucoreduction, residual leucocytes, flow cytometry, absolute count, blood product Introduzione In un recente workshop internazionale tenutosi ad Anversa (Belgio) a cura del consorzio olandese Sanquin 1 si è evidenziata con chiarezza la superiorità in termini di sensibilità, accuratezza e riproducibilità dei metodi citofluorimetrici nel conteggio dei leucociti residui (rwbc) negli emocomponenti leucodepleti 2. In particolare, tra i cinque diversi metodi valutati, i sistemi di identificazione e conteggio dei rwbc impieganti fluorescenza nucleare con Ioduro di Propidio e conta assoluta in singola piattaforma con microsfere mostravano le migliori prestazioni. A partire da queste premesse abbiamo cercato di chiarire i principali fattori di variabilità tecnici e strumentali della metodologia citometrica di identificazione dei rwbc, per renderne universale l'applicabilità e ottimizzarne i punti più critici. La crescente domanda di procedure di controllo della leucodeplezione degli emocomponenti richiede infatti l'applicazione estensiva di metodi di conteggio affidabili, riproducibili e soprattutto economici 3. La procedura da noi sviluppata permette la misura accurata di valori di rwbc estremamente bassi, fino al virtuale "zero citometrico", e l'efficace discrimine tra valori di 0, 2 e 4 rwbc/µl, cioè nel range più critico dal punto di vista decisionale, in tutti i tipi di emocomponenti e su tutti i tipi di piattaforme citometriche. LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 47 - num. 3 maggio-giugno 2002 (389-393) 389
B Brando et al. Metodi La colorazione del DNA nucleare leucocitario si ottiene con un tampone citrato ipotonico, contenente Propidio Ioduro a bassa concentrazione, RNAsi bovina e tensioattivi. Il medium va filtrato con filtri da 0,22 µm e si mantiene stabile per 6 settimane a 4 C in vetro scuro. Per l'uso, 50 o 100 µl di campione vengono aggiunti a 250 o 500 µl di medium, con pipettamento inverso di precisione 4. Uno stesso volume di microsfere di conteggio ben risospese (Beckman Coulter, Miami, FL, USA) viene aggiunto con analoghe modalità. Come controllo positivo si utilizzano i leucociti presenti in 5µL di un qualsiasi plasma spontaneamente sedimentato in 250-500 µl di medium, con o senza l'aggiunta di microsfere. Come controllo negativo si impiega il solo medium. Piattaforme citometriche utilizzate: FACSCalibur (BD Biosciences, San José, CA, USA), EPICS XL-ADC (Beckman-Coulter), PARTEC PAS (Partec GmbH, Muenster, Germania). Indipendentemente dalla piattaforma utilizzata, la configurazione strumentale era così concepita: Acquisizione di FL1 Log, FL2 Log e Tempo; Soglia su FL2 (Propidio Ioduro) con valore impostato attorno a 10-20 Unità; Amplificazione FL2 in modo da ottenere il cluster dei rwbc a 100 Unità; Amplificazione FL1 in modo da ottenere il cluster dei rwbc a 5-10 Unità; Diagramma Tempo verso FL2, con finestra di cattura delle singolette di microsfere (Figura 1). Standard biologici di riferimento costituiti da sangue umano leucodepleto stabilizzato a livello di circa 4 rwbc/µl (Lotto 01/436) sono stati ottenuti dal National Institute for Biological Standards and Controls NIBSC (Potters Bar, UK, www.nibsc.ac.uk). Valutazioni esterne di qualità (VEQ) sono state eseguite con l'adesione al programma pilota "Low-Level Leucocyte Count LLLC" di UK-NEQAS (www.ukneqas.org.uk). Risultati 1- Il Problema degli Eventi Aspecifici (Stray Events) In ogni analisi di emocomponenti leucodepleti si riscontra una disturbante popolazione di eventi aspecifici di fondo (stray events). Questi eventi sono generati da materiale corpuscolato proveniente, nell'ordine, da campione, medium e fluidica strumentale. Una quota minoritaria è di provenienza elettronica od ottica. Gli stray events sono ineliminabili, ma possono essere minimizzati dall' accurata pulizia dello strumento e dalla filtrazione del medium. È essenziale verificare che la finestra di acquisizione dei rwbc sia comunque priva di stray events durante almeno due minuti di corsa del preparato di controllo. La natura aspecifica e casuale degli stray events è testimoniata dal loro pattern "a ipotenusa" nel diagramma FL1 vs FL2. Gli eventi rilevanti (rwbc) sono invece polarizzati lungo l'asse verticale (Figura 2) e sono ben discriminabili dagli stray events. Allo stesso modo, le microsfere Flow-Count presentano un forte segnale di fluorescenza sia su FL1 che su FL2 e sono sempre perfettamente distinguibili sia dai rwbc che dagli stray events. 2- Configurazione della Finestra di Acquisizione Negli emocomponenti si possono ritrovare rwbc sostanzialmente integri e/o frammenti cellulari di varie dimensioni, in funzione dell'età del campione, della modalità di preparazione e della tempistica di filtrazione rispetto al prelievo. Il medium permeabilizzante qui impiegato non distingue tra cellule vive o morte, ma colora il DNA cellulare in modo stechiometrico. Impostato su 100 Unità, il picco di fluorescenza del DNA relativo ai rwbc integri, un frammento cellulare pari al 50% di una cellula integra, genera un segnale di fluorescenza di 50 Unità. Al disotto di tale valore, non è più possibile attribuire univocamente un evento citometrico ad un singolo rwbc (eventi "cometa"). Si è quindi convenuto in modo conservativo di accettare nella finestra di acquisizione solo gli eventi con contenuto di DNA nucleare dal 50% del normale in su. 3- Configurazione del Protocollo di Analisi e Quantificazione del Campione Analizzato Viene configurato un diagramma FL1 vs FL2 senza gate, contenente la finestra di acquisizione dei rwbc. Viene, quindi, impostato un diagramma Tempo vs FL2, contenente la finestra di cattura delle singolette di microsfere (BEADS). Un terzo display a istogrammi su FL2, filtrato da un gate logico "rwbc OR BEADS" permette di raffigurare contemporaneamente i rwbc accettati e le singolette di microsfere (vedi figura 1). Il display "Tempo" è di fondamentale importanza perché permette di monitorare la regolarità dell'acquisizione, lunga anche 4 5 minuti, mentre il numero di microsfere accumulato rende conto della quantità di campione effettivamente processato. Il numero di microsfere aggiunto ad ogni microlitro di campione è sempre attorno a 1.000, per cui l'acquisizione di 1.000 sferette sottende il processamento di circa 1 µl del campione originario. L'acquisizione dei rwbc segue la statistica degli eventi ultra-rari, che vengono caratteristicamente in clusters. Il coefficiente di variazione longitudinale incomprimibile della misura, per valori di rwbc attorno 390
Analisi citometrica della leucodeplezione Figura 1 - Schermata di Acquisizione / Analisi con esempio di calcolo del livello assoluto di rwbc Figura 2 - Rappresentazione degli eventi aspecifici di fondo (Stray Events). Soglia su FL2 volutamente abbassata per mostrare l entità e la morfologia degli stray events ed il loro discrimine con la finestra di acquisizione dei rwbc e le microsfere 391
B Brando et al. Figura 3 - Valutazione multicentrica del metodo di conteggio con preparati stabilizzati (NIBSC 01/436). Otto repliche per centro in due giorni successivi. Eccellente riproducibilità del metodo attorno al valore di 4 rwbc/µl ai 3/µL e acquisizione di 20µL di campione, è circa del 12%. 4- Validazione Multicentrica del Sistema con Preparati Stabilizzati NIBSC Il NIBSC è una istituzione della Organizzazione Mondiale della Sanità che ha recentemente sviluppato preparati leucodepleti stabilizzati, utilizzabili come standard biologici di riferimento. L'uso di questi prodotti consente analisi multicentriche per la validazione delle metodologie di conteggio. La figura 3 mostra i risultati di un trial collaborativo europeo tra 7 centri utilizzanti il nostro sistema. Otto diverse repliche in due tornate analitiche sono state effettuate in modo cieco con tre lotti di NIBSC 01/436. Il CV interlaboratorio è = 14% su un valore di rwbc atteso di 3,9/µL. Lo stesso campione, analizzato con il sistema commerciale ProCOUNT secondo quanto raccomandato dal fabbricante, dava un CV interlaboratorio del 30,7% (dati non mostrati). Discussione La tecnologia di identificazione e conteggio assoluto dei rwbc negli emocomponenti leucodepleti basata su citofluorimetria, colorazione nucleare con Propidio Ioduro e microsfere è oggi in grado di enumerare con grande affidabilità valori estremamente bassi di rwbc. Questo ha importanti conseguenze pratiche, poiché l'attuale limite di accettabilità di un emocomponente leucodepleto (< 1 milione rwbc/sacca) richiede la massima precisione e accuratezza di conteggio tra 2 e 4 rwbc/µl nel campione originario. Il conteggio in camera di Nageotte in ormai diversi studi controllati si è dimostrato del tutto inadeguato prestazionalmente in questo ambito di valori e va pertanto definitivamente abbandonato 1. Curiosamente, il limite di sicurezza ad 1 milione rwbc/sacca è stato deciso sulla base di conteggi in camera di Nageotte. Oggi sappiamo che, con gli scadenti limiti di confidenza di questo metodo, un valore medio di 3 rwbc/µl in camera di conta può significare indifferentemente da 0 a 20 rwbc/µl, con le immaginabili conseguenze biologiche e cliniche. Abbiamo sviluppato una metodologia di conteggio di applicabilità universale a tutte le piattaforme citometriche oggi in circolazione, di grande affidabilità ed economia e validata da uno studio collaborativo multinazionale. I prerequisiti di tale metodologia richiedono una particolare attenzione ad alcuni fattori tecnici di cruciale importanza, di seguito elencati. 1) L'estrema pulizia della parte fluidica dello strumento, non sempre facile da ottenere per ragioni strutturali in tutti i tipi di piattaforme. 2) L'uso di un medium a bassa concentrazione di propidio, estensivamente filtrato per minimizzare gli stray events. 3) Il dimensionamento della finestra di acquisizione in modo 392
Analisi citometrica della leucodeplezione da accettare gli eventi cellulari ancora riconducibili ad almeno il 50% dell'originario materiale nucleare. 4) L'uso del parametro "Tempo" che permette di rigettare con sicurezza eventuali conteggi alterati da occasionali irregolarità fluidiche. 5) La valutazione della quantità di campione processato calcolata sulla base del numero di microsfere acquisite (ad esesmpio, 1.000 microsfere = 1 µl di campione) e l'acquisizione di non meno di 15 µl di campione originario. Quest'ultimo punto merita una precisazione. Nell'analisi citometrica degli eventi rari o ultrarari è raccomandata l'acquisizione di almeno 100 eventi "positivi" per rendere il conteggio sufficientemente rappresentativo e statisticamente robusto 4. Con le attuali efficienti metodologie di leucodeplezione viene spesso ottenuta una condizione di virtuale livello "zero rwbc/µl". Questo significa che anche passando al citometro tutto l'emocomponente non si potrebbero in teoria mai raccogliere i necessari "100 eventi positivi". Ne consegue la necessità di una differente strategia di acquisizione, che preveda il processamento di una quota prefissata e rappresentativa di campione, stimata attorno a 15 µl. Le microsfere di conta assoluta svolgono qui un triplice ruolo (conteggio, controllo della regolarità della corsa, stima della quantità di campione processato). Poiché per ragioni statistiche gli eventi ultra-rari si presentano irregolarmente e a piccoli gruppi, il CV longitudinale della misura, in media attorno al 12%, risulta tanto maggiore quanto più basso è il volume di campione acquisito. È soprattutto sulla base di questo dato che abbiamo stabilito a 15 µl il minimo volume necessario per una conta di sufficiente accuratezza. La disponibilità di preparati stabilizzati di riferimento (NIBSC) permette un efficace controllo interno della intera procedura, mentre l'adesione a programmi di VEQ (UK NEQAS) mette il laboratorio trasfusionale impegnato nel controllo qualitativo della leucodeplezione in una posizione di eccellenza e di assoluta affidabilità nel delicato campo della conta dei rwbc negli emocomponenti. Riassunto Premessa. L' identificazione e il conteggio citometrico (FCM) dei leucociti residui (rwbc) negli emocomponenti leucodepleti rientrano nel capitolo dell'analisi degli eventi rari. Tipicamente, si vanno a contare cellule nel range di 0 5/µL nelle condizioni più restrittive per la qualità delle sacche leucodeplete. Nessuno dei metodi convenzionali non-fcm si è dimostrato sufficientemente sensibile, preciso e accurato in questo ambito di valori. I requisiti della metodologia FCM di conta dei rwbc, basata su fluorescenza nucleare con Propidio Ioduro e conta assoluta con microsfere in singola piattaforma, sono stati studiati e validati, con lo scopo di standardizzare e ottimizzare la procedura di conteggio. Metodi. Campioni di concentrati eritrocitari e di concentrati piastrinici leucodepleti (50-100 µl) sono marcati con Propidio Ioduro in un tampone ipotonico contenente tensioattivi e RNAsi. Un uguale volume di microsfere di conteggio Flow-Count (Beckman-Coulter) viene aggiunto al momento della lettura. L'analisi viene eseguita con uno stesso tipo di protocollo indifferentemente su FACSCalibur (Becton-Dickinson) o EpicsXL (Beckman-Coulter). Controllo positivo: 5 µl di buffy-coat spontaneamente sedimentato. Controllo negativo: solo medium. Risultati. 1) Necessità di operare in condizioni di massima pulizia fluidica per ottenere l'acquisizione di Zero rwbc' nel controllo negativo. Un passaggio di detergente per 30-60 sec. è necessario prima di ciascuna analisi. 2) Ottimizzazione del discrimine tra il segnale dei rwbc e degli eventi indesiderati, ottenibile con un diagramma FL1/FL2. 3) Inclusione del parametro Tempo' per monitorare la regolarità dell'analisi, che può durare fino a 4-5 minuti. 4) Valutazione della quantità di campione iniziale processato in base al numero di microsfere acquisite (1.000 microsfere = circa 1 µl di campione iniziale) e acquisizione di almeno 15 µl di campione. 5) Misura del CV intrinseco longitudinale (ottimalmente <15%). Discussione. Questa metodologia riesce a definire con elevatissima affidabilità le condizioni di Zero rwbc (frequenti nei preparati piastrinici) e a discriminare emoderivati con 2 rwbc/µl da preparati con 4 rwbc/µl, permettendo quindi un'accurata valutazione prestazionale di filtri e sistemi di leucodeplezione nel range di valori più critici dal punto di vista decisionale. Bibliografia 1) PF van der Meer, JW Gratama, CJ van Delden et al. for the Dutch Working Party "Universal Leukoreduction Leukocyte Counting": Comparison of five platforms for enumeration of residual leucocytes in leucoreduced blood components.br J Haematol, 115, 953, 2001. 2) Mandy F, Brando B: Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. In: Robinson JP, Darzynkiewicz Z, Dean PN, Dressler LG, Rabinovitch PS, Stewart CC, Tanke HJ, Wheeless LL (Eds), Current Protocols in Cytometry, Supplement 13 edition, p 6.8.1 6.8.26, John Wiley & Sons, New York, 2000. 3) Masse M: Universal leukoreduction of cellular and plasma components: process control and performance of the leukoreduction process.transfus Clin Biol, 8, 297, 2001. 4) Brando B, Barnett D, Janossy G et al.: Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. Cytometry, 42, 327, 2000. 393