Replicazione del DNA la replicazione del DNA viene effettuata da ENZIMI: DNA-polimerasi (catalizza la formazione del legame fosfodiestere) ogni filamento fa da stampo (enzima diretto dallo stampo) le DNA-polimerasi possono allungare la catena solo aggiungendo nuovi nucleotidi al gruppo -OH 3 libero della catena molte DNA-polimerasi hanno attività nucleasica per correggere gli errori
Replicazione Forcelle di replicazione e appaiamento delle basi
Replicazione stampo replica Aggiunta di un nucleotide e formazione del legame fosfodiestere 3-5 Primer di RNA con gruppo 3 -OH libero
replicazione DNA idrolisi di (PPi) favorisce la polimerizzazione
Le polimerasi allungano il filamento solo in direzione 5 3 Avanzamento della forcella di replicazione: catena leader Replicazione semidiscontinua catena ritardata i frammenti sono poi legati dall enzima DNA-ligasi Mutazioni puntiformi, ricombinazioni e trasposizioni sono alla base dell evoluzione biologica
Varie proteine concorrono a determinare l attività di replicazione, di correzione e riparazione Frammento della DNA-polimerasi di E.coli dominio polimerasico: catalizza la formazione del legane fosfodiestere domino esonucleasico: idrolizza i legami con basi errate Mutazioni puntiformi, ricombinazioni e trasposizioni sono alla base dell evoluzione biologica
INTERAZIONI DNA-PROTEINE Impacchettamento del DNA (istoni) Regolazione della replicazione ed espressione (repressori e attivatori specifici, riparatori etc) Metilazione e taglio di DNA estraneo Ex. EcoRI Endonucleasi di restrizione riconosce un segmento autocomplementare (palindromo): TCGCGAATTCGGCG ruolo delle scanalature!
Tecnologia del DNA ricombinante: si basa sull enzimologia degli acidi nucleici e sulla capacità di appaiamento delle basi Sequenziamento e manipolazione Endonucleasi di restrizione di tipo II nei batteri, un utile strumento di laboratorio: forbici molecolari Riconoscimento di sequenze specifiche del DNA duplex
Mappe di restrizione: ricostruzione delle sequenze Digestione di un ipotetica sequenza di DNA mediante endonucleasi di restrizione. Determinazione delle dimensioni dei frammenti e posizionamento dei siti bersaglio Mappe di restrizione
ddntp (Di-deossi-nucleoside Trifosfato)
Sequenziamento a terminazione di catena 1. Separazione dei due filamenti (eventuale frammentazione con endonucleasi) 2. DNA polimerasi I di E.coli + 2-3 dideossi nucleotidi 4 miscele di reazione: Interruzione controllata della replicazione primer+marcatori fluorescenti rendono possibile il sequenziamento automatico
Sanger Dideoxy Method of DNA Sequencing
Automated DNA Sequencing
PCR: reazione a catena della polimerasi. Amplificazione del DNA (95 C) (Presenti un grande eccesso) Riscaldamento a 72 C per l azione ottimale della polimerasi Taq termostabiel
La PCR è una tecnica estremamente sensibile (è possibile amplificare una singola molecola di DNA da caratterizzare e/o manipolare e/o un singolo gene) utile per la diagnostica medica (identificazone di virus e batteri) e malattie genetiche per la medicina forense (paternità, violenza carnale, omicidi..) per gli studi di evoluzione molecolare (DNA stabile, recuperato anche di specie estinte)
Il dogma centrale della Biologia Molecolare trascrizione DNA mrna traduzione Sintesi proteica Proteina
ribosoma
Trascrizione mrna: viene sintetizzato con sintesi diretta dal DNA, dalla RNA-polimerasi promotori della trascrizione: negli eucarioti i geni sono mosaici di introni e esoni sequenze di DNA che dirigono la RNA-polimerasi verso i siti della trascrizione Efficacia dei promotori e proteine regolatrici regolano la frequenza di trascrizione
Bolla di trascrizione (catena)n + nucleoside trifosfato (catena)n+1 + PPi
Traduzione e codice genetico la sequenza di basi del DNA codifica la sequenza di amminoacidi nella proteina 4 basi: A T C G 20 amminoacidi codoni triplette di basi: 43= 64 combinazioni il codice genetico è: non sovrapposto senza punteggiatura degenerato
aa2 aa4 aa6 codice sovrapposto: UCCGGAAACUCCUUU aa1 aa3 aa5 aa7 mutazioni puntuali (una lettera ) produrrebbero la modifica di due residui codice punteggiato: UCCGGAAAACUCCUUU aa1 aa2 aa3 Delezioni di 4 lettere dovrebbero mantenere la fase di lettura
codice degenerato: un AA è codificato da più triplette le prime due lettere sono costanti alcuni codoni non codificano per AA: segnali di inizio segnali di stop
Sintesi proteica I codoni che codificano per amminoacidi solo letti da trna I segnali di inizio sono complessi I codoni di stop sono letti dalle proteine fattori di rilascio
Ad ogni amminoacido corrisponde una molecola di trna che lo riconosce e lo utilizza secondo le istruzioni di mrna Sintesi veloce : 40AA/sec in E.Coli ed accurata: freq.errore 10-4
Aspetti generali della struttura trna struttura secondaria a trifoglio tutti contengono 70-80 nucleotidi alto contenuto di basi modificate struttura generale simile
Y R pirimidine e purine CCA sempre presente * basi variabili basi con appaiamenti insoliti 7 bp appaiate nello stelo accettore TψC sequenza comune In sequenza e in lunghezza complementare a un codone in
La struttura terziaria La struttura terziaria è conservata più della struttura primaria trnaphe da lievito 60Å struttura compatta conformazione a L un braccio composto dallo stelo accettore e dallo stelo T un braccio composto dallo stelo D e dallo stelo dell anticodone 42 basi su 76 sono in doppia elica 71 basi coinvolte in interazioni di impilamento 25Å anticodone
La struttura terziaria è resa stabile da 9 interazioni
Il legame peptidico La polimerizzazione di AA viene raggiunta per eliminazione di una molecola d acqua tra il gruppo carbossilico di un AA e il gruppo amminico del successivo. Nelle cellule il legame viene creato nei ribosomi, catalizzato da enzimi. La catena ha una direzione!!
I POLIPEPTIDI SONO MOLECOLE METASTABILI L idrolisi del legame peptidico è termodinamicamente favorita rispetto alla formazione del legame (condensazione G0=+10kJmol-1) La formazione del legame avviene con l utilizzo di ATP, per azione di aminoacil-trna-sintetasi che attivano gli AA nel legame con trna 1. AA+ATP Amminoacil-AMP + PPi 2. Amminoacil-AMP +trna trna Amminoacil-tRNA + AMP Il legame peptidico a partire dagli amminoacil-trna è termodinamicamente favorito
Gli aminoacidi sono uniti al gruppo ossidrilico del ribosio in posizione 2 o 3 dell adenosina invariante 3 terminale attivazione AA +ATP+tRNA amminoacil-trna+amp+ PPi l accoppiamento tra trna e aminoacido è realizzato dagli enzimi aminoacil-trna sintetasi diverse specifiche aminoacil-trna sintetasi riconoscono i diversi aminoacidi
il corretto trna viene riconosciuto dall enzima in zone specifiche, e diverse, del trna. treonil-trna sintetasi
Due classi di trna sintetasi Riconoscono siti diversi in t RNA Il braccio terminale CCA adotta diverse conformazioni Le sintetasi di classe I legano l AA in posizione 2 quelle di calsse II in posizione 3
I ribosomi sono le macchine molecolari che coordinano l attività dei trna di mrna e delle proteine e del rrna che partecipano al processo di sintesi proteica sono RIBONUCLEOPROTEINE Sono composti di subunità. In una cellula batterica sono presenti circa 20000 ribosomi
A = amminoacilico P = peptidico E = exit (uscita)
Il legame peptidico si forma mediante attacco nucleofilico del gruppo NH2 nel sito successivo. G0 < 0
Si possono determinare i livelli di espressione genica in termini di quantità di mrna corrispondente mediante l utilizzo di: DNA microarray o gene chip della mammella Il principio su cui si basa la tecnica è quello di ibridizzare il mrna con oligonucleotidi complementari e di rivelarne la presenza e quantità mediante fluorescenza.