METODICHE ELETTROFISIOLOGICHE per lo STUDIO dei FARMACI IN VITRO : VOLTAGE-CLAMP di HILLE e CAMPBELL Dott.ssa De Bellis M
CANALI AL SODIO VOLTAGGIO DIPENDENTI (NA v Chs) sono importanti per la genesi e la propagazione dei segnali elettrici nei tessuti eccitabili come: - muscolo - cuore - nervi - cellule endocrine (George et al., J. Clin. Invest., 2005) NavCh esiste in tre stati conformazionali che dipendono dal potenziale di membrana
Nei mammiferi sono state identificate 9 diverse isoforme di canale al sodio che presentano un omologia di sequenza fra loro superiore al 50% Na: simbolo chimico del principale ione permeabile Nav: principale regolatore Nav1: tipo di subunità codificata dal gene Nav1.1: specifica isoforma del canale
GENI CODIFICANTI PER LA SUBUNITA a DEL CANALE AL SODIO DI MAMMIFERO (Catteral et al., Pharmacological Reviews, 2005) SCN1A SCN2A SCN3A SCN7A SCN5A SCN4A
SUBUNITA a DEL CANALE AL SODIO The a subunit alone is capable of forming a functional ion-selective channel S5 and S6 loops and S6 transmembrane segments form the ion-selective pore the S4 segments contain positively charged residues that confer voltage dependence to the protein the idrophobic residues IFM between DIII-IV block the inner pore during fast inactivation (Meisler et al., The J. Of Clinical Investigation, 2008)
SUBUNITA a FUNZIONALE - In ogni dominio S1, S2, S3 costituiscono la parte esterna del canale; S5, S6 quella interna - I loops extracitoplasmatici leganti S5-S6 di ogni dominio costituiscono il FILTRO DI SELETTIVITA - I segmenti S4 di ogni dominio costituiscono i SENSORI DEL VOLTAGGIO coinvolti nei processi cinetici di apertura del canale - Il loop intracitoplasmatico che unisce DIII e DIV è coinvolto nel processo di inattivazione
SUBUNITA AUSILIARIE RUOLO DELLA SUBUNITA : - trasporto e localizzazione della subunità a sulla membrana plasmatica - cinetica del canale (voltaggio dipendenza dell attivazione e dell inattivazione) - molecole di adesione (interazione con la matrice extracellulare) - regolazione della migrazione delle cellule; aggregazione cellulare e legame con citoscheletro
LE TOSSINE RAPPRESENTANO IMPORTANTI TOOLS PER SAGGI DI LEGAME E PER LA DETERMINAZIONE DELLE RELAZIONI STRUTTURA-ATTIVITA Isoforme TTX-s sensibili (concentrazioni nanomolari) Isoforme TTX- resistenti (concentrazioni micromolari)
FARMACOLOGIA DEI CANALI AL SODIO VOLTAGGIO-DIPENDENTI I farmaci che esplicano la loro attività interagendo con i canali al sodio sono classificati in base al loro prevalente uso terapeutico: ANESTETICI LOCALI: lidocaina, benzocaina, bupivacaina ANTIARITMICI: class IA: chinidina, procainamide, disopiramide class IB: mexiletina, tocainide class IC: encainide, flecainide, propafenone ANTIEPILETTICI: fenitoina, carbamazepina, valproato, lamotrigina Molti di questi farmaci sono chimicamente correlati e sono denominati con il termine generico di anestetici locali (LA), poiché sono stati sviluppati in passato come alternativi alla cocaina per ottenere anestesia ed analgesia (Ruetsch et al., 2001)
(Saul et al., Arch. Neurol., 2009) MUTAZIONI MISSENSO IN NAV1.4 (Simkin et al., Front in Pharmac., 2011) Le sindrome miotoniche e le paralisi periodiche sono rare malattie autosomiche dominanti del muscolo scheletrico caratterizzate da alterazioni delle proprietà elettriche del sarcolemma
DIFETTI FUNZIONALI DEL CANALE AL SODIO MUTATO PROCESSO DI INATTIVAZIONE - lenta velocità di inattivazione - recupero veloce dalla inattivazione - la voltaggio dipendenza della inattivazione è spostata verso potenziali depolarizzati PROCESSO DI ATTIVAZIONE - la voltaggio dipendenza della attivazione è spostata verso potenziali iperpolarizzati (Kass, J. Clin. Invest., 2005) IL TIPO DI DIFETTO DELLA CINETICA GIOCA UN RUOLO IMPORTANTE NELLA DETERMINAZIONE DEL FENOTIPO CLINICO
CANALOPATIE DEL MUSCOLO SCHELETRICO sono malattie ereditarie del muscolo scheletrico muscolo in cui il difetto primario è un'alterazione dell eccitabilità elettrica delle fibre muscolari (Ashcroft, Nature, 2006)
SPETTRO CLINICO DELLE MIOTONIE NON DISTROFICHE E PARALISI PERIODICHE MIOTONIA È caratterizzata da ritardo di rilassamento muscolare a seguito di una improvvisa forte contrazione È associata a generazione di potenziali ripetitivi, una manifestazione della ipereccitabilità del sarcolemma PARALISI PERIODICA Rappresenta uno stato transiente di ipoeccitabilità o ineccitabilità in cui un potenziale d azione non può essere generato o propagato (paralisi che si evidenzia con astenia e debolezza muscolare)
TERAPIA FARMACOLOGICA DELLE MIOTONIE E DELLE PARALISI PERIODICHE La terapia farmacologica è puramente sintomatologica ed è mirata a ridurre l ipereccitabilità di membrana tipica delle miotonie Nonostante la classificazione genotipica delle sindromi miotoniche riporti una differenza specifica tra miotonie da sodio e miotonie da cloro, l approccio terapeutico rimane identico avvalendosi dell uso di antiaritmici della classe IB L impiego terapeutico di tali farmaci è legato alla loro proprietà di ridurre l eccitabilità di membrana, attraverso il blocco dei canali al sodio voltaggio-dipendenti: - riducendo la sintomatologia miotonica, - migliorando i fenomeni di spasmo, rigidità e dolori muscolari
EFFETTI DEI FARMACI ANESTETICI LOCALI SUI CANALI AL SODIO DEL MUSCOLO SCHELETRICO MEXILETINE TOCAINIDE O NH 2 H N O NH 2 Deprimono la corrente al sodio e riducono l eccitabilità cellulare fisiologica (blocco tonico) Sono molto attivi su tessuti caratterizzati da eccessiva frequenza di scarica e/o depolarizzazioni prolungate, agendo in maniera voltaggio e frequenza dipendente (blocco uso dipendente) Il profilo terapeutico degli anestetici locali è definito da: POTENZA che è un indice di affinità verso il recettore del canale al sodio USO-DIPENDNEZA che indirizza l attività del farmaco verso una ipereccitabilità patologica
REQUISITI MOLECOLARI DELLA STRUTTURA DEGLI ANESTETICI LOCALI Amino-Amidi 1 2 3 4 gruppo 1 - anello aromatico (gruppo idrofobico generalmente un benzene) gruppo 2 - estere o amide LINKAGE gruppo 3 - catena idrocarburica gruppo 4 - gruppo amino terziario ( gruppo idrofilico, generalmente un amina terziaria) Amino-Esteri
PROPRIETA GENERALI DEGLI ANESTETICI LOCALI L accesso degli anestetici locali al canale è possibile per due vie: - una via idrofobica lenta presente in tutti gli stati del canale - una via idrofilica rapida presente nello stato aperto logp= potenza pka= uso-dipendenza
STUDI DI MUTAGENESI DEL SITO DI LEGAME DEGLI ANESTETICI LOCALI (De Luca et al., Naunyn-Schmiedeberg s Arch Pharmacol, 2000) (Ragsdale et al, 1994; 1996) (Wright et al., 1998) (Yarov Yarovoy et al., 2001; 2002)
STUDI DI MODELING DEL SITO DI LEGAME DEGLI ANESTETICI LOCALI (Ahern et al., Circulation Research, 2008) (Lipkind et al., Mol. Pharmacol., 2005) (Ahern et al., Channels, 2008) chinidina lidocaina flecainide (De Luca et al., Mol. Pharmacol., 2000)
LARGO SCREENING DI ANALOGHI DI NUOVA SINTESI DI MEXILETINA E TOCANIDE Identificazione requisiti strutturali per una migliore interazione a livello del sito recettoriale
VOLTAGE-CLAMP secondo HILLE E CAMPBELL
WE SHOWED THAT. O NH 2 Mex O NH 2 O NH 2 Me2 Me4 The increased distance between the chiral carbon atom and the amino terminal group The presence of a phenyl group on the chiral centre Potency Potency Use-Dependent Behaviour ~ Use-Dependent Behaviour (De Luca et al., JPET, 1997) (De Luca et al., Naunyn-Schmiedeberg s Arch Pharmacol, 1997, 2000) (De Luca et al., Mol. Pharmacol., 2000) (Duranti et al., Eur. J. Med. Chem., 2000)
HOMOLOGUES DERIVATIVES OF MEXILETINE O NH 2 Me9 O NH 2 Mex O NH 2 Me2 O Me4 NH 2 O NH 2 O NH2 O NH 2 Me10 Me11 Me12
Effects of the shift of the chiral centre on the TB and BUD-10Hz of NAV1.4 O NH 2 100 μμ R-Mex O NH 2 100 μμ R-Me9 1 μa 1 ms TB = 63.8 ± 9.2 % UDB-10Hz = 85.8± 7.3 % TB = 48.3 ± 4.5 % UDB -10Hz= 87.4± 3.4 %
O NH 2 10 M S-Me2 1 μa 1 ms TB = 4.35 ± 7.5% UDB -10Hz= 23.3± 4.1 % O NH 2 O NH 2 10 μm R-Me10 10 μm S-Me11 TB = 17.8 ± 3.9 % UDB-10Hz = 59.3± 0.6 % TB = 20.3± 4.9% UDB -10Hz = 57.7± % 1.2
Effects of the combination of homologation of the alkyl chain and the presence of a phenyl group, on the TB and BUD-10Hz of NAV1.4 O NH 2 10 μm S-Me4 O NH 2 10 μm S-Me12 1 μa 1 ms TB = 40.8 ± 3.1 % UDB-10Hz= 74.8 ± 5.8% TB = 45.3 ± 8.5 % UDB-10Hz= 93.7 ± 3.7 %
Voltage-Dependence Block of NAvChs by Homologues Derivatives of Mex HP= -140mV all channels are in the resting activatable state HP= -70mV a considerable amount of closed-state inactivation is present O NH 2 O NH 2 R-Me9 R-Me10 O NH 2 O NH 2 S-Me11 S-Me12 Alls compounds are voltage dependent channel blockers
Voltage-Dependence Block and Effect of the Homologues Derivatives on steady-state inactivation of NAvChs All the derivatives shift the h curves towards more negative potential The shift of h curves is clearly concentration-dependent S-Me12 > R-Me10 > S-Me11 > R-Me9