BIOTECNOLOGIE pag 1 di Redatto: U.Marchesi Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.amaddeo
BIOTECNOLOGIE pag di 1. Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità operative per la rilevazione e determinazione quantitativa di soia Roundup Ready (evento di trasformazione GTS 40/3/) rispetto alla soia totale, in matrici agro-alimentari, mediante PCR real time.. Campo di applicazione La presente procedura viene applicata a DNA estratto da matrici agro-alimentari contenenti, costituite o derivate da soia. Il campo di misura è compreso all interno del range definito dai punti estremi di calibrazione, ossia tra lo 0,1% ed il 5% (o 10%). Come indicato nel UNI EN ISO 1570: 006 (Annex C, paragrafo C.1.7), il metodo è in grado di determinare un contenuto di soia Roundup Ready pari all 1%, se la percentuale dell ingrediente soia nella matrice in esame supera il 5%. omissis Qualora il DNA di soia venga rimosso o altamente degradato durante il processo produttivo della matrice alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili. 3. Definizioni ed abbreviazioni - OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. - PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA polimerasi DNA dipendenti, che determina l amplificazione del DNA bersaglio. - qpcr: PCR quantitativa - Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire ciclo dopo ciclo l andamento della reazione. - Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio, utilizzato per innescare la reazione di PCR. - Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio rivelandone la presenza. - DNA bersaglio endogeno: tratto di DNA caratteristico della specie vegetale analizzata, presente in un numero di copie costante e conservato nelle diverse varietà appartenenti a quella specie. - DNA bersaglio ricombinante o transgenico: tratto di DNA caratteristico della modificazione genetica oggetto della prova - Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore soglia e si distingue dal rumore di fondo. - NTC (no template control): controllo negativo di PCR - LOD (limit of detection): limite di rivelazione - LOQ (limit of quantitation): limite di quantificazione - bp (base pairs): coppie di basi
BIOTECNOLOGIE pag 3 di 4. Riferimenti DO VIR Documento Organizzativo PG QUA 005 Gestione dei documenti PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati per la ricerca di organismi geneticamente modificati (OGM) PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Maxi Kit POS VIR 05 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit IGR VIR 001 Istruzioni gestione reagenti UNI EN ISO 1570: 006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Metodi quantitativi basati sull'analisi dell'acido nucleico (Annex C, paragrafo C.1.7) Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing - European Network of GMO Laboratories (ENGL) Version 13-10-008 (http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/doc/min_perf_requir_analyt_methods_131008.pdf) The fitness for purpose of analitical methods, EURACHEM Guide, 1998. Westgard J.O. (003) Ann. Clin. Biochem., 40, 593-611. J. N. Miller, J. C. Miller Statistics and chemometrics for analytical chemistry, 000, Pearson Ed., Harlow (GB). A. Foti, C. Gianino Elementi di analisi dei dati sperimentali, 1999, Liguori Ed., Napoli. J. R. Taylor Introduzione all analisi degli errori, 000, II ed., Zanichelli Ed., Bologna Guida all espressione dell incertezza di misura, UNI CEI ENV 13005, luglio 000. Guida per la valutazione e la espressione dell incertezza nelle misurazioni, DT-000 Sinal. Avvertenze per la valutazione dell incertezza nel campo dell analisi chimica, DT-000/3 Sinal. Quantifying uncertainty in analytical measurement, EURACHEM/CITAC Guide, QUAM:000.P1. ABI PRISM 7700 SDS User s Manual, User Bullettin #, dicembre 1997. Hubner P., Waiblinger H.U., Pietsch K., Brodmann P. (001) J. AOAC Int. 84 (6), 1855-1864 Brodmann P.D., Ilg E.C., Berthoud H., Herrmann A. (00) J. AOAC Int. 85 (3), 646-653 Schwarz G., Baumler S., Block A., Felsenstein F.G., Wenzel G. (004) Nucleic Acid Research 3 (3), e4, 1-7 Wiseman G. (00) Journal of AOAC International, 85 (3), 79-796. UNI EN ISO 476 :006 Prodotti alimentari - Metodi di Analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Requisiti generali e definizioni 5. Moduli allegati Modulo POS VIR 061 INT/1: foglio di lavoro per Organismi Geneticamente Modificati (OGM): Soia Roundup Ready/Lectina. 6. Principio
BIOTECNOLOGIE pag 4 di Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente e rilevato mediante l impiego, in parallelo, di una coppia di primer ed una sonda specifici per il DNA bersaglio endogeno caratteristico della soia (regione del gene lectina), e di un altra coppia di primer ed un altra sonda specifici per il DNA bersaglio ricombinante caratteristico della modificazione genetica ricercata. L amplificazione del DNA bersaglio endogeno genera un amplificato di 81 bp, mentre quella del bersaglio ricombinante genera un amplificato di 83 bp. L eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde marcate con due fluorocromi, cosiddetti reporter (legato al 5 della sonda) e quencher (legato al 3 ); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher e viene osservata la fluorescenza solo di quest ultimo; a seguito di amplificazione, l attività 5 esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente emissione di fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente proporzionale alla velocità di amplificazione. La fluorescenza misurata viene normalizzata rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione. Le determinazioni quantitative derivano dal raffronto tra le curve di amplificazione del campione e le curve di amplificazione di materiali di riferimento certificati. 7. Apparecchiature, materiali, reagenti omissis, materiali di riferimento e dispositivi di protezione individuale 7.1 Apparecchiature Omissis ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Cappa a flusso laminare verticale sterile Congelatore -0 C ± 5 Frigorifero +4 C ± Microcentrifuga Pipette monocanale volumi da a 1000 µl Produttore di ghiaccio Vortex 7. Materiali Bicchieri di plastica Forbici Ghiaccio Griglia per microprovette Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp Pinzette Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml Provette tipo Eppendorf da,0 ml
BIOTECNOLOGIE pag 5 di Puntali con filtro volumi da a 1000 µl Secchielli per ghiaccio Soluzione decontaminante (IPR VIR 081) Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050) Strumento per l installazione dei tappi MicroAmp Supporto della griglia per microprovette o della micropiastra Supporti speciali per provette da 1,5 ml Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva 7.3 Reagenti Master Mix PCR Lectina (IPR VIR 15) Master Mix PCR Soia Roundup Ready (IPR VIR 16) H O grado reagente sterile (IPR VIR 096) 7.4 Materiali di riferimento Soia Roundup Ready set 0,1, 0,5, 1,, 5 (o 10)% GM 7.5 Dispositivi di protezione individuale Guanti in lattice o vinile senza polvere Camice 8. Responsabilità Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla preparazione dei reagenti, all esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei risultati sono riportate sui moduli PG QUA 005/1: Tabella responsabilità personale a tempo indeterminato (TRPI) e Modulo PG QUA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo determinato, collaboratori e consulenti (TRPD). 9. Modalità operative 9.1 Norme di igiene e sicurezza Per l esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003 specificando che tali disposizioni, vista l innocuità della prova per l operatore, sono esclusivamente a tutela dell esito della prova stessa. 9. Preparazione dei campioni, dei controlli e dei calibratori Da eseguire nell area di prova 0 omissis o 1A, sotto cappa a flusso laminare verticale sterile.
BIOTECNOLOGIE pag 6 di Dai campioni/controlli/calibratori, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti procedure di supporto: POS VIR 05 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura spettrofotometrica. Se possibile, eseguire una monitor run lectina sul DNA estratto, come descritto nella POS VIR 017 INT. Omissis Per l esecuzione della prova quantitativa omissis usare: come calibratori, 100 ng di DNA estratto da ciascun componente del set di soia Roundup Ready 0.1, 0.5, 1,, 5 (o 10)% GM, di cui lo 0,1% viene anche utilizzato come riferimento nella carta di controllo come controllo negativo, il controllo negativo PCR (H O a grado reagente sterile) Omissis 9.3 Prova quantitativa La prova quantitativa viene effettuata su 4 replicati sia per i calibratori (materiali di riferimento), sia per i campioni ed il controllo negativo. I materiali di riferimento vengono sottoposti a prova alla concentrazione di 0 ng/µl, i campioni alla concentrazione determinata in base ai risultati della monitor run lectina. Durante l esecuzione della prova quantitativa, compilare le seguenti pagine del foglio di lavoro POS VIR 061 INT/1: pag.1- elenco campioni e controlli (file excel POS VIR 061 INT qpcr.macro ) pag.- allestimento piastra Omissis pag.3- esiti qpcr (file excel POS VIR 061 INT qpcr.macro ) pag.4- calcolo Ct LOD e Ct LOQ RR (file excel POS VIR 061 INT qpcr.macro ) Accendere omissis l ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o l ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30 prima della prova per far scaldare il laser all interno dello strumento. Impostare l apparecchio (come descritto dal manuale d uso dello strumento) per l analisi da effettuare omissis. Selezionare VIC come fluorocromo reporter per la metà della piastra sottoposta ad amplificazione del gene endogeno, FAM come fluorocromo reporter per la metà della piastra sottoposta ad amplificazione del transgene, TAMRA come fluorocromo quencher e ROX come fluorocromo di riferimento passivo. Definire quindi la collocazione di materiali di riferimento, controlli e/o campioni nella micropiastra di reazione da 96 pozzetti in cui avverranno le reazioni e riportare il tutto a pagina b del modello POS VIR 061 INT/1 dove vi è una rappresentazione schematica della suddetta micropiastra di reazione. Sotto cappa a flusso laminare verticale sterile nell area di prova 0, 0 o 1A predisporre il seguente materiale: Tre supporti speciali per provette da 1,5 ml. Provette da 1,5 ml autoclavate. Due bicchieri di plastica inseriti uno nell altro e contenenti qualche ml di soluzione decontaminante, dove sono eliminati i puntali dopo l uso.
BIOTECNOLOGIE pag 7 di Durante l esecuzione della prima fase di seguito descritta, mantenere i campioni di DNA in esame in ghiaccio. Prima fase Da eseguire nell area di prova 05 sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Preparare due miscele di reazione, una utilizzata per l amplificazione del DNA bersaglio endogeno, l altra per l amplificazione del DNA bersaglio ricombinante. Nella seguente tabella la prima delle due miscele di reazione viene definita miscela di tipo A mentre la seconda viene definita miscela di tipo B. Tipo di determinazione qpcr soia Roundup Ready Tipo di miscela di reazione A B Denominazione della miscela di reazione Master Mix PCR Lectina Master Mix PCR Soia Roundup Ready IPR di riferimento IPR VIR 15 IPR VIR 16 Omissis Considerando che, per una singola reazione, il volume finale è 5 µl di cui 5 sono costituiti dalla sospensione di DNA da analizzare, ed applicando un fattore di correzione del 15%, calcolare il volume di ognuna delle due miscele di reazione (MR tot. A e MR tot. B) mediante la seguente formula: volume MR tot. A = volume MR tot. B = 9 µl n campioni Tali volumi sono in ogni caso già segnalati automaticamente a pagina 1 del foglio di lavoro, una volta compilati i campi destinati alla descrizione dei calibratori e dei campioni. Preparare in provette tipo eppendorf le due miscele di reazione, sulla base dei calcoli effettuati, compilando per ognuna la scheda preparazione miscele di RT/PCR (SPMR) riportata nella IGR VIR 001. Trasferire le provette contenenti le miscele di reazione MR tot. A e MR tot. B nell area di prova 0, 0 o 1A. Seconda fase Da eseguire nell area di prova 0, 0 o 1A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Prendere due dei tre supporti speciali preparati in precedenza e disporre in ognuno di essi un numero di provette da 1,5 ml pari al numero di materiali di riferimento + campioni + controlli da esaminare. Distribuire in ogni provetta del primo supporto speciale (supporto A) una quantità di MR tot. A pari a 8,8 µl.
BIOTECNOLOGIE pag 8 di Distribuire in ogni provetta del secondo supporto speciale (supporto B) una quantità di MR tot. B pari a 8,8 µl. Prelevare dal ghiaccio le provette contenenti le sospensioni di DNA dei materiali di riferimento, dei campioni da analizzare e dei controlli e trasferirle sul terzo supporto speciale (supporto C). Disporre in parallelo i tre supporti (A, B e C) e trasferire da ogni provetta del supporto C alle corrispondenti provette dei supporti A e B, un quantitativo di sospensione di DNA pari a 0,7 µl. In questo modo, ogni provetta dei supporti A e B conterrà un volume di miscela di reazione completa di DNA stampo pari a 103,5 µl. Riporre le provette del supporto C in ghiaccio. Disporre, sempre sotto cappa, il supporto con la micropiastra ottica di reazione, la pellicola ottica adesiva, oppure la bustina contenente i tappi ottici MicroAmp, le pinzette e lo strumento per l installazione dei tappi. Dopo circa 10 secondi di agitazione vigorosa al vortex, trasferire dalle provette dei supporti A e B 5 µl di miscela di reazione completa di DNA stampo nei pozzetti della micropiastra secondo lo schema precedentemente definito e riportato a pagina b del POS VIR 061 INT/1. Sigillare i pozzetti della piastra con la pellicola ottica adesiva o con i tappi ottici utilizzando l estremità a rotella dello strumento per l installazione dei tappi per ribadire la chiusura dei pozzetti. Estrarre la micropiastra di reazione dal supporto e trasferirla nell area di prova in cui è installato lo strumento da utilizzare per l esecuzione della prova (omissis ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o l ABI Prism 7900HT Fast Real- Time PCR System). Terza fase Da eseguire nell area di prova in cui è installato lo strumento da utilizzare per l esecuzione della prova (omissis ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System). Disporre la micropiastra di reazione nell apposito vano dello strumento e procedere all avviamento della reazione come descritto dal manuale d uso dello strumento. Per tutte le determinazioni il protocollo di amplificazione è così costituito: Step Stage T ( C) Tempo (sec.) Acquisizione 1 Attivazione UNG (Uracil-Nglicosilasi) Denaturazione e attivazione della polimerasi 3a Denaturazione 95 C 15 NO 3b Annealing e sintesi 60 C 60 SI n. cicli 50 C 10 NO 1x 95 C 600 NO 1x 50x
BIOTECNOLOGIE pag 9 di Al termine dell amplificazione procedere all analisi, dopo aver preventivamente salvato la corsa, come di seguito descritto. Lettura ed analisi dei risultati La lettura dei risultati viene effettuata, dall operatore opportunamente addestrato, attraverso l analisi dei dati immagazzinati ed elaborati dallo strumento (come descritto dal manuale d uso dello strumento). Impostare la linea di soglia: Impostare la modalità logaritmica per la rappresentazione delle curve di amplificazione relative al sistema FAM. Impostare la linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli, cioè nella fase esponenziale di PCR. omissis Passare alla modalità lineare e verificare che la linea di soglia precedentemente impostata si trovi nella fase geometrica di amplificazione. Ripetere la procedura per VIC. Impostare la linea di base: Nella modalità lineare di rappresentazione delle curve di amplificazione relative al sistema FAM, impostare la linea di base 3 cicli prima del ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 5, impostare la linea di base a ). omissis Ripetere la procedura per VIC. Esportare i dati in un file txt. Copiare tutto il testo contenuto nel file txt ed incollarlo nel foglio pasted data del file Excel denominato POS VIR 061 INT qpcr.macro. Analizzare i risultati: o Verificare che il controllo negativo presenti un Ct 40 sia per il sistema VIC che per FAM. In caso contrario la prova quantitativa deve essere ripetuta. o Costruire una retta di taratura, Ct FAM contro logaritmo del numero di copie del bersaglio transgenico, con i relativi valori dei cinque materiali di riferimento certificati, tenendo conto che il numero di copie del bersaglio transgenico nella quantità di DNA (100 ng) dei materiali di riferimento soia Roundup Ready 0.1, 0.5, 1, e 5 (o 10)% GM sottoposta a prova è pari rispettivamente a circa 41, 05, 410, 80 e 050 (o 4100). Verificare che il coefficiente R della retta di taratura sia 0,98, in caso contrario provare a costruire una retta di taratura con quattro punti anziché cinque e verificare nuovamente il valore di R. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore di R < 0,98, ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai materiali di riferimento. o Verificare che il coefficiente angolare della retta di taratura sia compreso, in valore assoluto, tra 3,0 e 3,7. Anche in questo caso, se questo requisito non è soddisfatto, provare a costruire un altra retta di taratura con quattro punti, anziché cinque, e verificare il relativo valore del coefficiente angolare. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore del coefficiente angolare, in valore assoluto, esterno all intervallo 3,0 3,7, ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai materiali di riferimento.
BIOTECNOLOGIE pag 10 di o Inserire nella carta di controllo (file excel POS VIR 061 INT carta controllo) il risultato ottenuto per il campione di controllo e verificare che rispetti i requisiti descritti al paragrafo 11.3 o Dalla retta di taratura estrapolare o interpolare i valori di Ct FAM corrispondenti al LOD ed al LOQ per il sistema di amplificazione del bersaglio transgenico e confrontare con essi i Ct FAM ottenuti per ciascun campione. o Per i campioni che presentano un Ct transgenico superiore al Ct transgenico corrispondente al LOD o al LOQ, l esito viene espresso con la rispettiva dicitura riportata nel paragrafo Espressione dei risultati (esiti 1 e ). o Per i campioni che presentano un Ct transgenico inferiore al Ct transgenico corrispondente al LOQ, si procede come segue: Calcolare, per ciascun campione/materiale di riferimento esaminato, la differenza tra i Ct medi ( Ct) ottenuti nel sistema di amplificazione del bersaglio endogeno (VIC) e nel sistema di amplificazione del bersaglio ricombinante (FAM). Costruire una retta di taratura, Ct contro logaritmo della percentuale di soia Roundup Ready, con i relativi valori dei cinque materiali di riferimento certificati. Verificare che il coefficiente R sia 0,98, in caso contrario provare a costruire una retta di taratura con quattro punti anziché cinque e verificare nuovamente il valore di R. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore di R < 0,98, ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai materiali di riferimento. Verificare che il coefficiente angolare della retta di taratura sia compreso, in valore assoluto, tra 3,0 e 3,7. Anche in questo caso, se questo requisito non è soddisfatto, provare a costruire un altra retta di taratura con quattro punti, anziché cinque, e verificare il relativo valore del coefficiente angolare. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore del coefficiente angolare, in valore assoluto, esterno all intervallo 3,0 3,7, ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere effettuato una nuova estrazione di DNA dai materiali di riferimento. Sulla retta di taratura interpolare o estrapolare, per ciascun campione, il valore della concentrazione di soia Roundup Ready dai valori dei Ct sperimentali ed esprimere il risultato come indicato nel paragrafo Espressione dei risultati (esito 3). In ogni caso, tutti i valori medi calcolati, saranno considerati accettabili solo con una deviazione standard relativa (RSD) non superiore a 1,5%. Riportare il valore percentuale ottenuto per il materiale di riferimento 0,1% GM (campione di controllo) sulla carta di controllo (file excel POS VIR 061 INT carta controllo ) e valutare il risultato secondo i criteri descritti nel paragrafo 11.3. Per l esecuzione delle operazioni necessarie all analisi dei risultati, l operatore, opportunamente addestrato, potrà avvalersi di un apposito foglio di calcolo excel denominato
BIOTECNOLOGIE pag 11 di POS VIR 061 qpcr.macro la cui affidabilità sarà verificata come descritto nel paragrafo 9.4. 9.4 Verifica fogli di calcolo Con cadenza semestrale l affidabilità dei fogli di calcolo excel utilizzati nella presente procedura viene verificata mediante l analisi di una corsa test standard ad esito noto denominata omissis POS VIR qpcr test omissis. Tutta la documentazione relativa a tali verifiche è conservata nell area di lavoro 00 in un apposito raccoglitore denominato OGM - Verifica dei fogli di calcolo. 10. Espressione dei risultati Esito 1 Ct lectina inferiore al Ct lectina corrispondente al rispettivo LOD, ma Ct transgenico superiore al Ct transgenico corrispondente al rispettivo LOD Ct lectina e Ct transgenico inferiori ai Ct corrispondenti ai rispettivi LOD, ma uno o entrambi i Ct superiore/i al Ct corrispondente al rispettivo LOQ 3 Ct lectina e Ct transgenico inferiori ai Ct corrispondenti ai rispettivi LOQ Espressione del risultato ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): SOIA ROUNDUP READY / LECTINA: non rilevata soia RR ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): SOIA ROUNDUP READY / LECTINA: soia RR non quantificabile ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): SOIA ROUNDUP READY / LECTINA: soia RR X % (tra X min % e X max %) espressa come incertezza estesa con fattore di copertura,6 relativo a 9 gradi di libertà ad un livello di confidenza del 95%. Nel caso 1 omissis deve essere indicato il LOD omissis. Nel caso deve essere indicato il LOQ. Nel caso 3, le concentrazioni di soia Roundup Ready estrapolate al di sotto o al di sopra della curva di calibrazione vengono espresse rispettivamente come < 0.1% e > 5 (o 10)%. Nel caso 3, le caratteristiche dell incertezza di misura, quali il fattore di copertura utilizzato, il corrispondente livello di probabilità ed il numero dei gradi di libertà effettivi (formula di Welch-Satterhwaite) potranno essere riportate in nota in calce al rapporto di prova.
BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11. Validazione del metodo e stima dell incertezza di misura 11.1 Validazione I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di lavoro per la validazione/verifica della capacità del laboratorio nell applicazione dei metodi e stima dell incertezza di misura (VMSI POS VIR 061 INT) Determinazione del LOD (limite di rivelazione) Per la determinazione del LOD non è possibile utilizzare il metodo IUPAC basato sul segnale del bianco + 3σ (Codex Alimentarius Commission CX/MAS 01/4; Eurachem guide: The fitness for purpose of Analytical Methods), in quanto, relativamente alle prove per la determinazione di OGM, non risulta disponibile un bianco con uno scarto tipo diverso da zero. Si procede invece seguendo le linee guida UNI EN ISO 476:006 Foodstuffs Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products general requirements and definition, cioè determinando il più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è 33%. Nel nostro caso vengono utilizzati dati di ripetibilità intermedia (Eurachem Guide, 1998). Si opera come segue: Il DNA di soia RR (DNA bersaglio) estratto da materiali di riferimento viene diluito in acqua o in DNA di mais (DNA non bersaglio) Ciascuna diluizione viene esaminata in PCR real time per il sistema endogeno (lectina) e per quello transgenico (soia RR), in un numero di replicati maggiore o uguale a 5 Dai Ct medi ottenuti per ciascun gruppo di replicati si costruisce una retta di taratura Ct contro log (n copie genomiche): Ct = a log(numero di copie genomiche) + b dove a è la pendenza e b l intercetta della retta di taratura. Dalla retta di taratura si ricava, per ciascun replicato, il numero di copie genomiche corrispondente al valore del Ct Dal numero di copie genomiche di ciascun replicato si calcola il valor medio per gruppo di replicati ed il corrispondente scarto tipo; quindi si calcola lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ): x m = Σ x i /n i i σ = [Σ (x i x m ) /(n - 1)] 0.5 RSD r = σ/x m 100 dove x m = numero di copie genomiche medio
BIOTECNOLOGIE pag 13 di x i = numero di copie genomiche per il replicato i n = numero di replicati σ = scarto tipo RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione Tramite un modello di regressione si cerca la migliore funzione (coefficiente di regressione R 0,94) che descriva la relazione tra le RSD r ricavate e il numero di copie genomiche. Mediante interpolazione dalla curva ottenuta, si determina il valore del numero di copie corrispondente ad una RSD r pari al 33% La procedura viene ripetuta integralmente almeno un altra volta. Il LOD viene calcolato come media dei valori ottenuti. Come riportato nel VMSI POS VIR 061 INT, il LOD risulta pari a 0 copie genomiche (C) per il sistema lectina, e pari a 15 copie genomiche (C) per il sistema Roundup Ready. Determinazione del LOQ (limite di quantificazione) Per la determinazione del LOQ non è possibile utilizzare il metodo IUPAC basato sul segnale del bianco + 5σ (ο 6σ ο 10σ) (Codex Alimentarius Commission CX/MAS 01/4; Eurachem guide: The fitness for purpose of Analytical Methods), in quanto, relativamente alle prove per la determinazione di OGM, non risulta disponibile un bianco con uno scarto tipo diverso da zero. Si procede invece seguendo le linee guida Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing - European Network of GMO Laboratories (ENGL), cioè determinando il più basso livello di analita (DNA bersaglio della reazione di PCR real time) in corrispondenza del quale lo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSD r ) è al 5%. Nel nostro caso vengono utilizzati dati di ripetibilità intermedia (Eurachem Guide, 1998). Si opera come descritto per la determinazione del LOD, determinando però il valore del numero di copie corrispondente ad una RSD r pari al 5%. Come riportato nel VMSI POS VIR 061 INT, il LOQ risulta pari a 38 copie genomiche (C) per il sistema lectina, e pari a 8 copie genomiche (C) per il sistema Roundup Ready. Precisione La precisione viene valutata in condizioni di ripetibilità intermedia (prove effettuate nello stesso laboratorio da operatori diversi in momenti diversi) su materiali di riferimento e/o su campioni. Ogni materiale di riferimento/campione viene estratto in almeno due sessioni differenti; ciascun estratto viene esaminato in almeno 3 sessioni di PCR; si calcola il valor medio della percentuale di OGM e lo scarto tipo; quindi si determina lo scarto tipo relativo: σ = [Σ (x i x m ) /(n - 1)] 0.5 i
BIOTECNOLOGIE pag 14 di RSD r = σ/x m 100 dove x m = percentuale di OGM media x i = percentuale di OGM ottenuta nella sessione di prova i n = numero di sessioni di prova σ = scarto tipo RSD r = scarto tipo relativo di ripetibilità o coefficiente di variazione Esattezza L esattezza viene valutata mediante prove interlaboratorio effettuate con metodi analitici differenti su campioni a cui viene attribuito un valore di consenso sulla base dei risultati forniti dai singoli partecipanti. Ai risultati forniti da ciascun laboratorio viene assegnato uno z score pari a: z = x - X σ dove: x è il risultato fornito dal laboratorio; X è il valore di consenso σ è lo scarto tipo, che può essere calcolato come stima della effettiva variazione riscontrata nella relativa prova interlaboratorio, oppure sulla base di dati relativi ad un numero di prove precedenti. Considerato che: z ; risultato soddisfacente; si verifica nel 95% circa dei risultati prodotti da un sistema affidabile. < z 3; risultato discutibile; si verifica nel 5% circa dei risultati prodotti da un sistema affidabile. z > 3; risultato insoddisfacente; si verifica nello 0,7% circa dei risultati prodotti da un sistema affidabile. l esattezza si può esprimere nel modo seguente: n prove con esito soddisfacente n prove totali Specificità La specificità non è stata determinata presso i nostri laboratori su materiali di riferimento, in quanto gli stessi materiali di riferimento certificati IRMM (Institute for Reference Material
BIOTECNOLOGIE pag 15 di and Measurement) sono attualmente dichiarati 0% solo nominalmente, cioè non escludono la presenza accidentale e tecnicamente inevitabile di soia RR. La specificità è stata valutata come descritto nell annex C del UNI EN ISO 1570:005, paragrafo C.1..3: mediante una ricerca di omologia di primer e sonde nei database GenBank/EMBL/DDBJ con il programma BLASTN..3. per via sperimentale su materiali di riferimento certificati (IRMM-410), non più disponibili, contenenti soia Roundup Ready a concentrazioni comprese tra 0 e 5% e su matrici alimentari commerciali costituite o contenenti farina di soia o proteine di soia. Linearità La linearità di risposta viene valutata per: la relazione tra il Ct ed il log(% di transgenico rispetto all endogeno) la relazione tra il Ct ed il log(numero di copie del bersaglio), separatamente per il sistema di amplificazione del bersaglio endogeno e per quello del bersaglio transgenico. Nel primo caso viene esaminato il coefficiente R di un numero (>10) di curve di taratura ottenute da materiali di riferimento certificati a percentuali di soia RR comprese tra 0,1% e 5%. Nel secondo caso per ciascun sistema (endogeno e transgenico) vengono effettuate diluizioni di DNA bersaglio in H O o in DNA di mais (o altro DNA non bersaglio), utilizzando materiali di riferimento a diverse percentuali di soia RR e verificando la linearità di risposta, attraverso l esame del coefficiente R, per l endogeno (lectina) tra circa 41000 e 0 copie genomiche, per il transgenico (soia RR) tra circa 050 e 0 copie genomiche. Un valore di R 0,98 viene considerato molto soddisfacente. Robustezza In considerazione della complessità del metodo e dei numerosi fattori fisico-chimici che influiscono sull esito della prova, la robustezza non può essere valutata mediante l analisi degli effetti della variazione deliberata di ciascuno di questi fattori. La robustezza viene, invece, valutata mediante confronto, attraverso il test t di Student, di gruppi di prove effettuate sugli stessi campioni da operatori diversi in momenti diversi. Al fine di utilizzare, per l esecuzione delle prove, una strumentazione differente dall ABI Prism 7700, con cui sono state effettuate le prove di validazione, è sufficiente eseguire un confronto, attraverso un test t di Student, di gruppi di prove effettuate sugli stessi campioni con le diverse strumentazioni. 11. Stima dell incertezza di misura L equazione che descrive l andamento esponenziale di amplificazione/duplicazione in PCR è: (a) K n =K 0 (1+ E x ) n K 0 = numero iniziale di molecole di DNA bersaglio K n = numero di molecole di DNA bersaglio al ciclo n E x = efficienza di amplificazione (compresa tra 0 e 1)
BIOTECNOLOGIE pag 16 di Assumendo che l efficienza di amplificazione sia massima e pressoché costante durante la piena fase esponenziale (User Bullettin #: ABI PRISM 7700 SDS) e che il numero di cicli considerato sia il Ct, ovvero coincida con il punto soglia in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza associato agli eventi di replicazione supera significativamente il rumore di fondo, si può passare alla semplificazione: K CT =K 0 Ct Il procedimento di quantificazione impiegato è di tipo relativo, in esso i sistemi di amplificazione (coppie di primers, probes e fluorocromi associati) e le connesse curve esponenziali sono due ed indipendenti, riferiti rispettivamente l uno al bersaglio endogeno (En), rivelato dal fluorocromo VIC, l altro al bersaglio transgenico (Tr), rivelato dal fluorocromo FAM. Tr Ct = Tr 0 (1+ E Tr ) Ct,Tr En Ct = En 0 (1+ E En ) Ct,En Assumendo che l efficienza di amplificazione sia massima e pressoché costante durante la piena fase esponenziale per entrambi i sistemi si ha che: e si ottiene: E Tr = E En = 1 (b 1 ) Tr Ct = Tr 0 Ct,Tr (b ) En Ct = En 0 Ct,En Si vuole trovare a questo punto una relazione funzionale tra il rapporto delle concentrazioni iniziali di transgenico ed endogeno e la differenza ( Ct) tra i rispettivi valori di cicli soglia, Ct Tr e Ct En : Tr0 (c ) Ct Tr - Ct En = ƒ En0 Dalla combinazione delle equazioni (b 1, ) e (c) si ha: Tr Ct /En Ct = (Tr 0 Ct,Tr )/(En 0 Ct,En (Ct,Tr Ct,En) ) = (Tr 0 /En 0 ) = (Tr 0 /En 0 ) ( Ct) Passando poi dal logaritmo in base al logaritmo in base dieci, risulta: Ct = log (Tr Ct /En Ct ) - log (Tr 0 /En 0 ) Ct = log 10 log 10 (Tr Ct /En Ct ) - log 10 log 10 (Tr 0 /En 0 );
BIOTECNOLOGIE pag 17 di (d) Ct = 3.3 log 10 (Tr Ct /En Ct ) - 3.3 log 10 (Tr 0 /En 0 ) che si può anche leggere nella forma: y = b + ax Proprio su questa equazione, ovvero sulla relazione lineare tra il Ct ed il logaritmo in base dieci della percentuale di DNA transgenico nel campione, si fonda il principio di quantificazione impiegato in PCR Real Time e, per tale motivo, in ogni corsa vengono sottoposti alle medesime condizioni di analisi 5 materiali di riferimento a differente contenuto di soia Roundup Ready: RR 0.1%, 0.5%, 1%, %, 5%. Con essi si costruisce la curva di taratura che servirà alla determinazione della percentuale incognita di soia RR nei campioni. Nel valutare l incertezza associata alla misurazione della percentuale di DNA transgenico, si è scelto di considerare: - i contributi relativi alle grandezze misurate Ct FAM e Ct VIC : la differenza dei valori medi di Ct FAM e Ct VIC conduce ai Ct, le y della nostra relazione, a cui è possibile associare un incertezza tipo di ripetibilità data come: σ Ct = σct Tr m σct + m En con m = numero di replicati, identico per il sistema endogeno e per quello transgenico; - i contributi legati all utilizzo di un modello di regressione lineare per la curva di taratura. Sono state invece reputate trascurabili altre fonti di incertezza connesse con il sistema, come: - le fonti legate alla purezza ed all incertezza dei materiali di riferimento impiegati per costruire la retta di taratura (Wiseman, 00); - le fonti relative ai processi di preparazione della miscela di reazione e di trasferimento nella micropiastra di reazione; - le fonti connesse con la determinazione spettrofotometrica del contenuto di DNA sottoposto ad analisi e con eventuali processi di diluizione del DNA, in considerazione del fatto che il sistema di quantificazione impiegato non è di tipo assoluto bensì relativo, per cui tale fonte d incertezza non dovrebbe risultare rilevante a meno di problemi di inibizione da eccesso di bersaglio (che comunque dovrebbero aver luogo
BIOTECNOLOGIE pag 18 di ben oltre la concentrazione di DNA normalmente impiegata e che sono evidenziabili nella monitor run ) o, viceversa, di una sua insufficiente presenza, eventualità da cui ci si pone al riparo operando determinazioni solo dopo aver verificato il rispetto dei limiti di quantificazione e di rivelazione del sistema Roundup Ready/Lectina. Assumendo perciò, come anticipato, che la vera relazione funzionale tra le due variabili, Ct e log 10 (Tr 0 /En 0 ), sia una retta: y = b+ax e che gli errori sperimentali presenti sulla variabile y siano molto più grandi di quelli presenti sulla variabile x, la stima ai minimi quadrati di a e b si ricava minimizzando la somma dei quadrati dei residui: [ ( )] y i ax i +b a [ ( )] y i ax i +b b = 0 = 0 La soluzione di queste equazioni fornisce la stima dei parametri della relazione lineare: x a = ( i x )( y i y ) ( x i x ) x x i y i x i x b = y x i ( ) Alla valutazione dei parametri di regressione è associato un particolare livello di indeterminazione legato alla presenza dell errore sperimentale; tale incertezza produce un intervallo di confidenza per ciascun parametro stimato dal modello, la cui ampiezza è in relazione con il grado di indeterminazione scelto e con la qualità del modello adottato. Si considerino quindi le deviazioni standard di a e b ottenute dalla legge di propagazione degli errori: σ a σ b = = n i= 1 n i= 1 a y i σ i b y i σ i Sostituendo σ i con σ max Ct, cioè con il quadrato del più grande degli errori standard associati a ciascun punto della curva di taratura, si ottiene:
BIOTECNOLOGIE pag 19 di σ a = σ max Ct n i= 1 a yi n b σ = b σ max Ct i= 1 yi Posto che le variazioni delle osservazioni rispetto alla retta di regressione appartengano tutte alla medesima distribuzione normale, gli intervalli di confidenza al 95% relativi alle stime di a e b saranno: b ± b b ± t σ b ; a ± a a ± t σ a in cui t è il valore relativo al 95% (livello di rischio accettato del 5%) di una distribuzione t di Student con n- gradi di libertà (n = punti della retta di regressione). L errore commesso su y, ossia su Ct, come visto prima è: σ Ct = σct Tr m σct + m En Nel fissare l intervallo di confidenza per Ct, che conduce all errore massimo y, occorre considerare che il numero dei gradi di libertà (n l ), di cui tenere conto nella scelta della costante per la quale moltiplicare σ Ct, è dato da: n l = (m En + m Tr ) ove con m En ed m Tr si intende il numero di misurazioni fatte per Ct En e Ct Tr da cui si è ottenuto il valore di Ct in esame. Qualora la retta di regressione sia impiegata allo scopo di determinare un valore x *, se è noto in quanto misurato il valore y * (come nel caso in questione in cui si conoscono i valori di C t ), si parla di regressione inversa ed x * può essere calcolata come x * = * ( y b) Conseguentemente l errore massimo su x *, x *, si ricava applicando la legge di propagazione degli errori assoluti massimi a priori nelle misure indirette (Elementi di analisi dei dati sperimentali, Foti & Giannino, p.98) ottenendo: a
BIOTECNOLOGIE pag 0 di * x = x y y * x + b b x + a a = = 1 y a * + 1 b a + * ( y b) a a = 1 a ( y * + b + * y b a a) * 1 * * (e) x = ( y + b + a x ) a Infine, una volta calcolato x *, il logaritmo della percentuale di bersaglio transgenico contenuto nel campione sottoposto ad esame sarà compreso, con il 95% di confidenza, nell intervallo: x * ± x * = log(%) ± log(%) Procedendo quindi all estrazione dei logaritmi si avrà: x * + x * = log(%) Max % Max = 10^ (x* + x*) 11.3 Carta di controllo x * - x * = log(%) Min % Min = 10^ (x* - x*) Allo scopo di verificare costantemente lo stato di controllo statistico della prova quantitativa si costruisce una carta di controllo di Shewhart (Miller et al) nel seguente modo. Si prepara, quindi, un grafico di tipo cartesiano, recante in ascisse il numero progressivo delle prove effettuate, ed in ordinate il valore percentuale ottenuto nelle prove. A partire dai valori ottenuti, in almeno 0 prove, dal materiale di riferimento RR 0.1% (campione di controllo), si calcola la media (x m = Σ x i /n) e lo scarto tipo (σ = [Σ (x i x m ) /(n - 1)] 0.5 ). Nel grafico si evidenziano: la media calcolata x m le soglie, inferiore e superiore, di attenzione (x m ± σ) le soglie, inferiore e superiore, di allarme (x m ± 3σ) Al termine di ogni prova quantitativa si assegna un numero d ordine alla prova e si introduce nel grafico il valore percentuale ottenuto per il materiale di riferimento RR 0.1% (campione di
BIOTECNOLOGIE pag 1 di controllo). La collocazione di tale valore percentuale rispetto ai valori soglia evidenziati nel grafico consente di stabilire se il sistema di quantificazione è sotto controllo statistico, attraverso un percorso interpretativo fondato sulle cosiddette regole di Westgard (Westgard, 003). Il seguente diagramma di flusso descrive sommariamente le tappe di questo percorso. Controllo dati 1 s NO Sotto controllo: prova accettata SI NO NO NO NO 1 3s s 4 1s 10 x SI SI SI SI Fuori controllo: prova rifiutata Dove: 1 s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di attenzione superiore o inferiore alla soglia di attenzione inferiore. 1 3s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di allarme superiore o inferiore alla soglia di allarme inferiore. s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di attenzione superiore o inferiore alla soglia di attenzione inferiore e l evento si è già verificato nella prova precedente. 4 1s = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per quattro prove consecutive, o superiore alla media più 1σ o inferiore alla media meno 1σ. 10 x = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per dieci prove consecutive, o sempre superiore alla media o sempre inferiore alla media. La prova rifiutata viene ripetuta alle medesime condizioni. Se il problema persiste, sarà necessario controllare uno o più dei seguenti fattori: DNA di riferimento Taratura delle pipette Fogli di calcolo, sia in fase di allestimento sia in fase di analisi della prova
BIOTECNOLOGIE pag di Fogli di lavoro relativi all intera prova Nel caso in cui tali misure risultino insufficienti, si richiede l intervento esterno di un tecnico specializzato per il controllo omissis dell ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o dell ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System).