Costante catalitica o n di Turnover k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Vmax = k 2 [ES] = k 2 [E] TOT k Vmax 2 = [E] TOT k 2 per una reazione semplice ad uno stadio corrisponde alla k cat (costante catalitica) Indica il numero di eventi catalitici che avvengono nel sito attivo dell enzima nell unità di tempo (le sue unità di misura sono s -1 o min -1 ). Misura quanto velocemente un dato enzima può catalizzare una data reazione. E SPECIFICA per ogni enzima. Problema: Esperimento 1. [S] = saturante [E] = 0.025 mm Esperimento 2. [S] = saturante [E] = 0.05 mm Nei due esperimenti sono diverse Vmax e Km?
v 0 (μm/sec) A [S] saturante la v 0 raggiunge il suo valore massimo (Vmax), non può più variare in funzione della concentrazione di substrato, perché tutto l enzima presente è saturato. Se raddoppio la concentrazione dell enzima raddoppia la Vmax. Vmax = k 2 [E] tot Vmax B = k 2 [E] B [E] B = 0.05 mm LA Km RIMANE INVARIATA Vmax A = k 2 [E] A [E] = 0.025 mm Km [S] mm
EFFICIENZA CATALITICA DI UN ENZIMA Parametro che utilizziamo per confrontare l efficienza catalitica e la specificità di enzimi diversi per uno stesso substrato o di uno stesso enzima per substrati diversi. Costante di specificità: k cat /Km (M -1 sec -1 ) Kcat/Km più alto per la CO 2 = maggiore efficienza catalitica ENZIMA SUBSTRATO kcat (sec -1 ) Km (M) kcat/km (M -1 sec -1 ) Acetilcolinesterasi Acetilcolina 1.4x10 4 9x10-5 1.6x10 8 Anidrasi carbonica CO 2 1x10 6 1.2x10-2 8.3x10 7 Anidrasi carbonica HCO 3-4x10 5 2.6x10-2 1.5x10 7 Catalasi H 2 O 1.4x10 4 9x10-5 1.6x10 8 Fumarasi Fumarato 8x10 2 5x10-6 1.6x10 8 Fumarasi Malato 9x10 2 2.5x10-5 3.6x10 7 Kcat/Km più alto per il fumarato = maggiore specificità
In reazioni più complesse a più stadi: la k cat corrisponderà alla k 2 dello stadio limitante la velocità della reazione complessiva Oppure in situazioni più complesse sarà uguale alla combinazione di molte costanti cinetiche diverse S 2 REAZIONI A DUE SUBSTRATI S 1 Es: reazione multistadio e multisubstrato a PING PONG Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2014 6 38
Il grafico di Micaelis-Menten (se non si conosce l esatto valore di Vmax) non consente di determinare in modo accurato il valore di Km Se l equazione di M-M (iperbole) è convertita nell equazione di una retta è possibile determinare con esattezza sia il valore di Vmax che di Km. I valori sperimentali di v 0 sono trasformati nei loro reciproci: 1/v 0 e i valori sperimentali di [S] nei corrispettivi reciproci 1/[S] L equazione di Micaelis-Menten è trasformata nell eq. di Lineweaver-Burk
1/v 0 min/μm Intercetta sull asse delle y Valore sull asse delle y Pendenza della retta Valore sull asse delle x Eq. di una retta che non passa dallo zero y = a x + b La retta interseca gli assi in punti precisi consentendo di determinare con esattezza Km e Vmax, e quindi anche k cat 1/v 0 = 1/Vmax Pendenza della retta = Km/Vmax -1/Km [S] = 10 mm 0,1 1/[S] mm -1 [S] = 1,0 mm 1,0
v 0 (μm/min) 1/v 0 min/μm 1/Vmax = 0,02-0,5 = -1/Km [S] = 10 mm 0,1 1/[S] mm -1 [S] = 1,0 mm 1,0 Per calcolare la Vmax devo fare il reciproco del reciproco = 1 = 0,02 min/μm Vmax = 1 Vmax 0,02 min/ μm Vmax = 50 μm/min Per calcolare il valore della Km devo fare il reciproco negativo del reciproco = -1/Km = -0,5 mm -1 Km = - 1 = 2mM -0,5 mm -1 Vmax 50 μm/min Vmax 2 2,0 (Km) [S] mm
INIBIZIONE ENZIMATICA REVERSIBILE La reazione enzimatica in vitro o in vivo può essere INIBITA REVERSIBILMENTE. Un inibitore (I) legandosi all enzima interferisce con la sua attività modificando la Vmax, la Km o entrambe. Quando l inibitore si lega all enzima si stabilisce un equilibrio che porta alla formazione del complesso inattivo EI. E + I EI Kdiss = K i = Costante di inibizione [E] [I] [EI] INIBITORI COMPETITIVI INIBITORI NON COMPETITIVI INIBITORI INCOMPETITIVI
INIBITORI COMPETITIVI Competono con il substrato per il sito attivo. Sono in genere analoghi strutturali del substrato. Rimuovono l enzima dal ciclo catalitico naturale. In presenza di Inibitore COMPETITIVO: Aumenta la dissociazione del complesso ES e quindi aumenta la k -1 k 1 k -1 Km = k -1 k 1 Km aumenta (Km app ) CONCENTRAZIONI SATURANTI DI SUBSTRATO v 0 = Vmax [S] Km app + [S] Vmax rimane inalterata, In presenza di [S] saturanti l inibitore è scalzato dal sito attivo.
v 0 (μm/min) Vmax inalterata ½ Vmax In presenza di Inibitore competitivo Km aumenta (Km app ) 1/ Vmax =invariato Km Kmapp 1 mm - 1/Km = diventa meno negativo Assenza di I comp.
Inibizione competitiva: il trattamento con etanolo dell'avvelenamento da metanolo L Etanolo è il più comune substrato dell enzima: Alcool deidrogenasi (ADH), presente nel fegato. Il METANOLO può competere conl EtOH per il sito attivo dell ADH ALCOOL- DEIDROGENASI Intossicazione da metanolo: è trasformato in un prodotto tossico che NON può essere metabolizzato. ALCOOL- DEIDROGENASI Può essere metabolizzata: non è tossica per l organismo e viene convertita in acetato che può essere utilizzato dal fegato Nei casi di intossicazione da metanolo si può usare un eccesso di etanolo, che va a competere per l ADH e rimuove il metanolo dal sito attivo dell enzima, consente quindi la rimozione di METOH attraverso i reni.
INIBIZIONE DA PARTE DEL PRODOTTO DELLA REAZIONE In alcuni casi, in reazioni irreversibili i prodotti della reazione agiscono da INIBITORI COMPETITIVI REVERSIBILI dell enzima che catalizza la loro formazione. (per es.: esochinasi, glucosio-6-fosfato fosfatasi) glucosio ATP esochinasi glucosio-6-fosfato _ glucosio-6-fosfato glucosio glucosio-6-fosfato fosfatasi _ P i
v 0 (μm/min) IN. INCOMPETITIVI Si legano all enzima solo dopo che si è già formato il complesso ES. k 1 k -1 ES viene rimosso dal mezzo e quindi la Vmax diminuisce (Vmax = k 2 [ES] = k 2 [E] tot ) A B Vmax Se diminuisce [ES] tutto l equilibrio si sposta verso la formazione di ES e quindi di ESI. Dunque, diminuisce anche la Km. Apparentemente aumenta l affinità dell enzima per il substrato ½ Vmax Vmax app + In. INCOMP In presenza di In. INCOMP aumenta la k 1 e quindi: Km app Km [S] mm Km = k -1 k 1 Km diminuisce (Km app ) in assenza di Inibitori
½ Vmax v 0 (μm/min) Inibitore assente La Vmax è più bassa in presenza di un inibitore incompetitivo Vmax 1/V 0 1/Vmax = aumenta perché diminuisce Vmax Vmax app 1/Vmax + In. INCOMP - 1/Km app La pendenza della retta è la stessa Km app Km [S] mm - 1/Km La Km è più bassa in presenza di un inibitore incompetitivo