Prof. Maria Nicola GADALETA E-mail: m.n.gadaleta@biologia.uniba.it Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 3 T ELETTROFORESI
Tecnica separativa che permette di separare molecole cariche, o rese tali, quando vengono fatte migrare in un mezzo fluido, sotto l influsso di un campo elettrico In biochimica è usata per separare: Aminoacidi Peptidi Proteine Nucleotidi DNA, RNA - in fase libera (o frontale): le particelle cariche si muovono attraverso una soluzione (poco attrito, elevata velocità di migrazione) - su supporto (o zonale): le particelle si muovono attraverso un mezzo poroso (agarosio, poliacrilammide, carta)
Fattori che influenzano la migrazione di una particella carica in un campo elettrico 1.Differenza di potenziale applicata agli elettrodi I (intensità di corrente, Ampére) R (resistenza, ohm Ω) V (voltaggio o d.d.p., volt) I= V/R (legge di Ohm) Applicando un determinato voltaggio V, I dipenderà da R E= gradiente di potenziale = V d (distanza tra gli elettrodi in cm) (d.d.p in volt) La velocità con cui la particella si muove è data da questa relazione v = E x z f (cm/sec) E= gradiente di potenziale z= C/M = (carica/massa) densità di carica elettrica della particella f= attrito frizionale f= 6πηr (η= viscosità del mezzo) (r= raggio delle particelle) µ= mobilità elettroforetica = velocità di una particella carica che si muove in un campo elettrico unitario v µ = (cm/sec x cm/volt) (cm E 2 sec -1 volt -1 ) µ è + quando la particella migra verso il CATODO (-) Per convenzione: µ è - quando la particella migra verso l ANODO (+)
2.Il campione Fattori che influenzano la migrazione di una particella carica in un campo elettrico a) CARICA La velocità di migrazione aumenta all aumentare della carica netta (legata al ph) b) DIMENSIONI (r) La velocità di migrazione diminuisce all aumentare del peso molecolare della molecola carica c) FORMA Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (es. proteine fibrose e globulari) hanno differenti velocità di migrazione (effetto forze frizionali ed elettrostatiche) 3.Soluzione tampone a) ph della soluzione Acidi e basi forti Acidi e basi deboli Molecole anfotere Né carica né segno sono influenzati La carica è fortemente influenzata, il segno no Sia la carica che il segno sono influenzati Se ph> pi la carica netta è negativa (anioni) Se ph< pi la carica netta è positiva (cationi) b) viscosità del mezzo (η) 2.b) e 3.b) sono compresi in f (= 6πηr )
Fattori che influenzano la migrazione di una particella carica in un campo elettrico Nell elettroforesi zonale si aggiungono i seguenti fattori: 4. Il decorso delle particelle cariche è tortuoso per cui la distanza apparente percorsa è in realtà minore di quella effettivamente percorsa 5. La forza ionica del tampone forza ionica (µ) = ½ Σ cz 2 c= concentrazione molare dello ione z= valenza o carica dello ione forza ionica migrazione del campione e viceversa 6. Effetto Joule: quando una corrente elettrica passa attraverso una colonna di elettrolita si ha produzione di calore uniforme. La dispersione di calore è maggiore in periferia dove il tampone si concentra, rallentando la velocità di migrazione del campione. 7. Elettroendosmosi (o elettro-osmosi): il fenomeno è dovuto alla presenza di gruppi carichi sulla superfice del mezzo di supporto (carta gruppi carbossilici, agarosio gruppi solfato,capillari di vetro silanoli).quando viene applicato un campo elettrico, i cationi dell elettrolita vicino alla parete migrano verso il catodo trascinando con se la soluzione elettrolita. ACCELERA MOVIMENTO DEI CATIONI (+), RITARDA QUELLO DEGLI ANIONI (-)
Elettroendosmosi
ELETTROFORESI FRONTALE Vantaggi: la mobilità elettroforetica dipende da pochi parametri misurabili Svantaggi: è lenta, da solo due componenti puri; possibili artefatti per la presenza di correnti di diffusione Uso: non viene praticamente più usata se non per determinare il ph isoelettrico di proteine o la mobilità elettroforetica assoluta + - + - Soluz. tampone C A A+B A+B+C Miscela proteica B+C A+B+C Dopo il passaggio di corrente si formano dei fronti (ASCENDENTI E DISCENDENTI) ma non si hanno i componenti singoli separati. Solo il componente di massima e di minima mobilità possono essere isolati puri.questi fronti sono evidenziati tramite misurazione dell indice di rifrazione lungo i bracci del tubo ad U.
ELETTROFORESI ZONALE Vantaggi: rapidità, più alto potere di risoluzione, particelle raccolte in zone di componenti singoli, migliore separazione. Preparativa oltre che analitica Svantaggi: non sono possibili misure di mobilità assoluta per l esistenza di parametri non misurabili Permette la separazione dei componenti di una miscela in ZONE o BANDE poiché: 1) per effetto del supporto solido altri fattori, come un effetto setaccio, esaltano la differenza di mobilità anche tra particelle con densità di carica uguale. Si ha FILTRAZIONE MOLECOLARE fenomeno dovuto al reticolo tridimensionale delle catene che costituiscono i gel (agar, amido, poliacrilamide). Le sostanze ad alto peso molecolare sono ostacolate nella migrazione più di quelle a peso molecolare basso. 2) il campione viene depositato tutto in unica zona del supporto e a partire da quella zona avviene la migrazione. Elettroforesi zonale orizzontale verticale (in genere su gel)
Elettroforesi verticale Elettroforesi orizzontale
Supporti solidi più usati in elettroforesi zonale: CARTA ACETATO DI CELLULOSA GEL Adsorbimento-elettroendosmosi Economico- peptidi, proteine e aminoacidi Sottili, uniformi, a struttura microscopica omogenea. Adsorbimento scarso-immunoelettroforesi. La striscia può essere colorata e resa trasparente con trattamenti particolari. Applicata in chimica clinica per proteine ematiche (glicoproteine, lipoproteine, emoglobina) Colloidi semisolidi, insolubili in acqua, idrofili che si preparano subito prima dell uso a partire da polveri di AMIDO, AGAR, ACRILAMIDE La deposizione del campione viene fatta o al centro (se non si conosce la carica delle molecole da separare) o ad una estremità del supporto si sa che a quel ph ci sono molecole cariche positivamente o negativamente). origine - + ph= 6.5 Lys + Arg + His + (Ala+Ser) Glu - Asp - origine - + ph= 2.1 Lys Arg His Ala Ser Glu Asp
Il setaccio molecolare costituito dal GEL coopera nella separazione dei composti ionici ad alto peso molecolare dotate di carica simile ma diversi per grandezza e forma AMIDO usato soprattutto per l analisi dei quadri isoenzimatici (ZIMOGRAMMI), per la facilità di applicazione di test istochimici dopo l elettroforesi. Si preparano prima scaldando e poi raffreddando una sospensione di amido parzialmente idrolizzato. Le catene ramificate dell amilopectina si intrecciano tra loro formando un gel semirigido. AGAR miscela polverulenta, atossica, di due polimeri del galattosio: agarosio+agaropectina. Ha diametro dei pori abbastanza elevato, presenta notevole elettroendosmosi. E molto adatto alla colorazione dopo la corsa elettroforetica. Per la scarsa resistenza alla diffusione è un ottimo supporto per la separazione e rivelazione di proteine antigeniche da parte di anticorpi (immunoelettroforesi). AGAROSIO purificato. Molto usato per la separazione di proteine ad alto peso molecolare e di acidi nucleici. Non presenta elettroendosmosi.
POLIACRILAMIDE Polimero sintetico dovuto alla reazione di polimerizzazione tra acrilamide e bisacrilamide in presenza di catalizzatore e iniziatore H _ H _ H 2 C=C-C-NH 2 = O + H 2 C=C-C-N-CH 2 -N-C-C=CH 2 H_ H_ H_ acrilamide Tetrametilendiamina (TEMED) catalizzatore = O = O S 2 O 2-8 (persolfato) Iniziatore 2SO 4 - (radicale solfato libero) Metilen bisacrilamide catene lineari (acrilamide) ponti crociati (bisacrilamide) (reticolo tridimensionale)
GEL DI POLIACRILAMIDE La porosità del gel di poliacrilamide dipende dalla quantità totale e dal rapporto acrilamide/bisacrilamide, che può essere variato a piacere I gel di poliacrilamide sono molto versatili, altamente riproducibili e la loro porosità può essere esattamente prevista e scelta in base ai pesi molecolari delle molecole da separare così da aumentare il potere di risoluzione della tecnica elettroforetica(potere di risoluzione=capacità di separare molecole con la più piccola differenza di peso molecolare). Si usano per proteine ed acidi nucleici I gel di poliacrilamide hanno trascurabile tendenza all adsorbimento Mancanza di elettroendosmosi Facilità nell analisi dei risultati sia direttamente (non assorbono nell U.V.), sia dopo colorazione (Comassie, Nitrato d argento)
GEL ELETTROFORESI SU POLIACRILAMIDE molto importante per la determinazione del peso molecolare (P.M.) di proteine ed acidi nucleici. è importante che le molecole abbiano tutte esattamente lo stesso rapporto carica/massa migrazione in base al solo P.M. ciò è normale per i frammenti di acidi nucleici in cui il numero di cariche negative dovute ai gruppi fosfato è esattamente proporzionale alla lunghezza Le proteine, invece, devono essere trattate con: 1) urea - dissocia le subunità; SDS - PAGE 2) mercaptoetanolo - rompe i ponti di S-S, separando le catene 3) SDS (sodio dodecil solfato, detergente). Denatura completamente le proteine inserendosi con la porzione apolare verso l interno e con la porzione carica negativamente all esterno.
Le proteine risultano avvolte in un guscio di cariche negative uniforme. Poiché la quantità di SDS legato è in un rapporto 1:2 (1 SDS/2AA) la mobilità della stessa dipenderà dalla lunghezza della catena polipeptidica e quindi dal peso molecolare mentre il rapporto carica/massa sarà uguale per tutte.
La mobilità elettroforetica m=k/r K=Z/6peLa discriminante tra le particelle da separare sarà soltanto r
In queste condizioni esiste una correlazione inversamente proporzionale tra la migrazione (cm) e il logaritmo del peso molecolare della proteina (o acido nucleico) Si può determinare il P.M. delle proteine esaminate tramite una retta di taratura che si costruisce facendo migrare sullo stesso gel una miscela di molecole a P.M. noto (MARKER). da: Nelson & Cox (II ed.)
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE Utilizzata ogni qualvolta è importante conservare l attività funzionale delle Proteine (l SDS-PAGE è un elettroforesi in condizioni denaturanti!) Es: separazione degli isoenzimi della lattico deidrogenasi LDH del siero umano Esistono 5 isoenzimi le cui differenze nella struttura delle subunità produce una diversa carica elettrica (stesso peso molecolare) Questa differenza di carica consente la separazione dei 5 isoenzimi della LDH quando si esegue l elettroforesi Dopo la corsa elettroforetica gli isoenzimi presenti nel gel sono evidenziati per mezzo delle reazioni sotto riportate: Lattato + NAD + LDH Piruvato + NADH NADH + NBT PMS NAD + + NB-Formazano Il colore Blue di Formazano si sviluppa per ogni banda di isoenzimi e può essere interpretato visivamente o quantizzato con densitometro.
da: Baynes
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE ELETTROFORESI a fronte mobile, usata nella separazione di composti anfoteri, separati in un campo elettrico lungo il quale c è un E e un ph. Regione anodica acida, regione catodica basica, il ph è mantenuto stabile. Gli estremi di ph sono scelti in modo da comprendere i pi di tutti i campioni da separare. I composti anfoteri vengono focalizzati in sottili bande stazionarie. ELEVATO POTERE RISOLUTIVO. Applicazione: Separazione isoenzimi ( pi 0.01U ph). Anodo (acido) polo + Campione applicato ad un ph< pi Componenti migranti come cationi Componenti focalizzati come ioni dipolari al ph= al loro pi Componenti migranti come anioni Campione applicato ad un ph> pi A B C A+ B+ C+ A+ B+ C+ A- B- C- A- B- C- Cationi + Ioni dipolari Anioni - Catodo (alcalino) polo -
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE da: Nelson & Cox (II ed.)
POTERE RISOLUTIVO DEI DIFFERENTI TIPI DI ELETTROFORESI Es. Separazione componenti proteici del sangue N componenti separabili 5-6 ~ 15 ~ 40 > 100 Tipo di elettroforesi in fase libera zonale isoelettrofocalizzazione bidimensionale