JOURNAL CLUB Maria Elena Conidi
MITOCONDRI «organelli citoplasmatici presenti nelle cellule eucariotiche» Molteplici funzioni: 1) metabolismo energetico con la produzione di ATP (ciclo di Krebs e Fosforilazione ossidativa (OXPHOS)) Gli altri processi in cui il mitocondrio interviene sono: 2) Bilancio redox (specie reattive dell ossigeno (ROS)) 3) Regolazione del ciclo cellulare 4) Omeostasi del calcio 5) Termogenesi Danno mitocondriale: Dismetabolismo energetico (necrosi) Stress ossidativo Apoptosi Alterazioni metabolismo del calcio
MITOCONDRI Il numero di mitocondri varia ampiamente da un tipo cellulare all altro. cristae matrix intermembrane space La modulazione della numerosità avviene attraverso biogenesi mitocondriale, mitofagia, inner membrane mitochondrion outer membrane fissione e fusione!! La regolazione di questi processi è differente sia dentro le cellule che tra tipi cellulari diversi, «variabilità di numero, dimensioni e forme» della popolazione mitocondriale!! «Variabilità di numero» si ha in base al tipo di popolazione cellulare ed alle esigenze energetiche del tessuto: - alcuni tipi cellulari hanno da pochi a 4 mitocondri «come piccoli organelli isolati», mentre - popolazioni cellulari con alto bisogno energetico «oltre un centinaio di mitocondri» che agiscono come un network dinamico. Il cervello, organo ad alta attività energetica, è fortemente dipendente dal metabolismo ossidativo (OXPHOS) - I mitocondri sono necessari per una corretta attività neuronale - Nei neuroni «elevato numero di mitocondri» + «alto contenuto di mtdna»
Mitocondri & Radicali liberi I mitocondri sono il principale sito responsabile della produzione del 90% di radicali liberi. Vengono prodotti quando gli elettroni fuoriescono dalla «catena di trasporto degli elettroni (ETC)» e reagiscono con l ossigeno. Circa 1 e 5% di tutto l ossigeno si liberano come radicali superossidi (ROS). In condizioni fisiologiche, i radicali liberi sono prodotti continuamente nelle cellule devono essere bilanciati dalle «difese antiossidanti» «equilibrio di ossidoriduzione» Sbilanciamento tra i ROS / difese antiossidanti «stress ossidativo» danno ossidativo
Mitocondri & Radicali liberi La progressiva alterazione delle funzioni mitocondriali è coinvolta nei normali processi di invecchiamento ma anche in malattie neurodegenerative (es. Alzheimer). Significativa riduzione del contenuto proteico del complesso OXPHOS, della sua attività e della produzione di energia sono segni caratteristici della riduzione del metabolismo energetico (aumento di ROS + disfunzione mitocondriale) associati alla malattia di Alzheimer e sono stati osservati nel cervello post-mortem di pazienti con Alzheimer ad esordio tardivo (LOAD). «ipotesi della cascata mitocondriale»: Alterazioni mitocondriali aumento dei livelli di ROS danno su componenti cellulari e mitocondriali Stress ossidativo cellulare
(1) Dinamica mitocondriale & Stress ossidativo Due importanti meccanismi: 1) FUSIONE_ consente ai mitocondri di combinarsi ed interagire tra loro _ mantenimento di organelli funzionali. 2) FISSIONE_ facilita il riarrangiamento, rimodellamento e proliferazione mitocondriale. _ gioca un importante ruolo nel corretto assemblaggio dei complessi di trasporto degli elettroni transmembrana (ETCs).
(1) Dinamica mitocondriale & Stress ossidativo & malattia di Alzheimer Alterazioni nell espressione delle proteine di fissione-fusione possono risultare in una distribuzione mitocondriale alterata. Cambiamenti nella dinamica mitocondriale ha un impatto significativo sulla funzionalità mitocondriale. Nei cervelli post-mortem con AD è stata osservata un eccessiva frammentazione in associazione ad una riduzione di proteine di fusione ed aumento di proteine di fissione ( sbilanciamento fissione/fusione) mitocondri mal funzionanti nei neuroni danneggiati. Le dinamiche mitocondriali sono critiche per l integrità mitocondriale e suoi cambiamenti hanno un impatto negativo su tutte le funzioni mitocondriali: - metabolismo energetico - omeostasi del Ca++ - generazione di ROS - regolazione dell apoptosi Una eccessiva frammentazione, mediata da una eccessiva fissione e sbilanciamento dell equilibrio fusione/fissione, può essere dovuta a stress ossidativo ed eccessiva produzione di ROS, anche perché la fissione gioca un ruolo importante nell assemblaggio dei complessi ETC.
(1) Dinamica mitocondriale & Alzheimer Evidenze sperimentali: Saggi di immunoblotting hanno evidenziato che la presenza di APP altera il rapporto fusione/fissione, con riduzione di Mfn1 e 2, DRP1 e OPA1 e aumento di hfis1. Studi su fibroblasti umani da pazienti con AD sporadici hanno messo in luce un alterata distribuzione dei mitocondri e dimostrato che elevato stress ossidativo ed elevata produzione di Aβ sono fattori che causano riduzione di Drp1. ptau e Aβ stimolano la nitrosilazione di Drp1 con conseguente aumento della fissione e neurodegenerazione. Cellule con deficit di fusione mitocondriale mostrano riduzione del potenziale di membrana mitocondriale e ridotta respirazione. Infatti la diminuzione di OPA1 induce il rilascio di cyt c e lo accelera tramite stimoli apoptotici. Aumento del processo di fissione + riduzione della fusione + aumento delle interazioni di ptau e Aβ con Drp1 eccessiva frammentazione mitocondriale + alterato trasporto assonale dei mitocondri + conseguente degenerazione sinaptica nei neuroni affetti da AD. Distruzione delle dinamiche mitocondriali può essere considerato evento iniziale della morte cellulare ROS-mediata!!
(2) ROS mit + Apoptosi & malattia di Alzheimer Sbilanciamento radicali liberi / meccanismi di difese antiossidanti «stress ossidativo» danno ossidativo necrosi cellulare ed apoptosi. Stress Ossidativo è legato al processo di invecchiamento e neurodegenerazione. Nel cervello, alterata respirazione mitocondriale + aumento di ROS = cambiamenti funzionali e danno cellulare. Mitocondri difettosi rilasciano grandi quantità di ROS Declino dell attività degli enzimi antiossidanti (es nella senilità) incrementano la formazione degli stessi con conseguente danno alla catena respiratoria, in particolare dei complessi I e III e COX. Nella malattia di Alzheimer Alterazioni della OXPHOS (per inibizione da parte di Aβ) Modificazione del metabolismo energetico + riduzione di ATP + aumento di ROS. Sono stati osservati: - stress ossidativo associato alla membrane (riduzione della dpm)+ aumentata produzione di ROS + perturbazione dell omeostasi del Ca++. - aumentata permeabilità di membrana e rilascio di cyt c e fattori proapoptotici, indotti da oligomerizzazione e polimerizzazione di Aβ, portano all apertura dei pori MPTP con conseguente apoptosi. Inoltre l attività della citocromo ossidasi (COX) è ridotta e i neuroni mostrano danno mitocondriale ed apoptosi!!
(3) Complesso di trasporto degli Elettroni (ETC) + stress ossidativo & Alzheimer Alterazioni a livello dei complessi ETC culminano nello stress ossidativo con sovrapproduzione di ROS, alterazione dell energia, omeostasi aberrante del Ca++, riduzione del dpm, alterazione della permeabilità dei pori MPTP morte cellulare per necrosi o apoptosi. La riduzione del trasferimento di elettroni = meccanismo di disfunzione mitocondriale caratteristico dell invecchiamento. I complessi I COX sono ridotti nell invecchiamento Riduzione significativa dell attività della citocromo ossidasi (cyt c e complesso IV) è stata osservata nelle piastrine, nella corteccia ed ippocampo di pazienti con Alzheimer. Nelle piastrine è stato osservato un deficit mitocondriale che sta ad indicare una alterazione dell attività del complesso III e COX.
(4) DNA mitocondriale (mtdna) Struttura circolare a doppio filamento; circa 16,6kb 13 geni codificanti proteine del complrsso OXPHOS: 7subunità del complesso I; 1 del complesso III; 3 del complesso IV; 2 del complesso V; 22 geni per i trnas; 2 geni per rrnas; una regione di controllo non codificante (CR)
(4) Caratteristiche del mtdna POLIPLASMIA: ogni cellula presenta molti mitocondri ed ogni mitocondrio contiene multiple copia del suo genoma (eccetto piastrine e ovulo non fertilizzato) migliaia di copie mtdna / cell. Durante la divisione cellulare i mitocondri vengono distribuiti casualmente alle cellule figlie e quindi la genetica mitocondriale è più simile alla genetica di popolazione che alla genetica mendeliana. ETEROPLASMIA: Nel caso di una mutazione del mtdna questa può colpire tutte le copie, poiché può essere ereditata a livello della linea germinale oppure essere presente solo in una percentuale di genomi come mutazione de novo a livello delle cellule somatiche.
(4) Caratteristiche del mtdna EFFETTO SOGLIA: espressione clinica delle mutazioni del mtdna è determinata dalla relativa proporzione wild type/mutato in un determinato tessuto; E necessario un numero minimo di copie per danneggiare il metabolismo energetico di un determinato organo o tessuto (valore relativo e non assoluto) (SNC, cuore, muscolo, rene e ghiandole esocrine) (bilancio energetico). EREDITA MATERNA: tutti i mitocondri dello zigote derivano dall oocita e perciò la modalità di trasmissione delle mutazioni mtdna differisce dalla trasmissione mendeliana classica: madre portatrice trasmissione a tutta la progenie, ma solo le figlie femmine possono trasmettere la mutazione ai loro figli. Eteroplasmia + effetto dose eccezioni fenotipiche all eredità matrilineare.
DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer Le mutazioni a livello del mtdna si possono propagare per espansione clonale Mutazioni somatiche nel mtdna possono così influenzare il fenotipo (effetto soglia) Accumulo graduale di mutazioni somatiche del mtdna possono implementare il loro effetto deleterio nel tempo Difetti nel mtdna sono stati trovati anche in soggetti anziani non affetti da demenza Numerosi studi hanno dimostrato che mutazioni nel mtdna si accumulano progressivamente con l età in vari tessuti, in particolare nei tessuti ad elevata attività metabolica (cervello) si accumulano livelli più elevati di mtdna mutato durante il processo di invecchiamento!!
DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer L età è da considerare il principale fattore di rischio per l Alzheimer e altre malattie neurodegenerative L ipotesi della cascata mitocondriale ha dato il via a numerosi studi sulle alterazione del DNA mitocondriale associate ad eccessivo stress ossidativo Vulnerabilità del mtdna al danno ossidativo: È localizzato in regioni prossime ad alte concentrazioni di ROS; Assenza di efficienti meccanismi di riparazione del DNA; Assenza di istoni protettivi della struttura del DNA; Nella CR: T414G, T414C,T477C 5-kb mtdna
DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer Nel cervello post-mortem di pazienti AD è stato osservato un maggior danno ossidativo a livello del mtdna, rispetto all età, che porta ad un maggior numero di mutazioni/delezioni e problemi post genomici di regolazione dell espressione. Cambiamenti dell'espressione di geni mitocondriali e nucleari, codificanti le proteine dei complessi OXPHOS contribuiscono ad alterare il Dati sperimentali: metabolismo ossidativo nell Alzheimer!! Comunque il mtdna non gioca un ruolo primario nella patogenesi dell Alzheimer ma è coinvolto successivamente!! ridotta attività del complesso I, in particolare della subunità ND4 nella corteccia temporale; Espressione differente dei geni mitocondriali codificanti il complesso I, COX e complesso V; Lo studio dell espressione dei geni mitocondriali e nucleari in aree differenti del cervello ha altresì mostrato una diversa proporzione tra i vari componenti, contribuendo così a perturbazioni del metabolismo ossidativo. morte cellulare Accumulo mutazioni mtdna accumulo mutazioni mtdna ANELLO A FEEDBACK POSITIVO Riduzione ATP + aumento di ROS riduzione dell efficienza dell ETC
CONCLUSIONI (1) 1) La patologia mitocondriale può essere considerata un importante fattore nella manifestazione dei sintomi clinici delle neurodegenerative; 2) Alterazioni mitocondriali, coinvolte nella patofisiologia di diverse malattie neurodegenerative, includono: - alterazioni del OXPHOS; - aumento del numero di mutazioni, delezioni o polimorfismi, -alterazioni dell omeostasi del calcio, - alterazione del metabolismo energetico così come l interazione con proteine malattia-specifiche (Aβ amiloide) 3) Approcci terapeutici finalizzati al rafforzamento delle funzioni mitocondriali potrebbero avere un significato per la cura o il contenimento delle malattie neurodegenerative!!
CONCLUSIONI (2) 1) Nella malattia di Alzheimer abbiamo visto che l alterazione della dinamica mitocondriale (shift verso la fissione) impatta negativamente su tutta l attività mitocondriale dell Alzheimer. punto critico nella patogenesi 2) Strategie in grado di modificare l anormale dinamica mitocondriale potrebbero essere un interessante intervento terapeutico per l Alzheimer. 3) Farmaci mirati a ridurre l espressione delle proteine di fissione mitocondriale (Drp1, Aβ e ptau) potrebbero proteggere i neuroni dall effetto tossico di questi fattori e dalle loro interazioni.