FATTORI DI REGOLAZIONE E POPOLAZIONI CELLULARI COINVOLTE NELLA RIGENERAZIONE MUSCOLARE

FATTORI DI REGOLAZIONE E POPOLAZIONI CELLULARI COINVOLTE NELLA RIGENERAZIONE MUSCOLARE Il muscolo scheletrico è il più grande tessuto del corpo umano costituendo il 40-50% della massa totale del corpo. Le funzioni del tessuto muscolare includono il movimento, la respirazione e il mantenimento della postura. I muscoli scheletrici sono costituiti da cellule muscolari, network di nervi e vasi sanguigni e tessuto connettivo che connette le singole fibre in fasci che formano il muscolo. L epimisio è lo strato fibroso esterno che circonda l intero muscolo, il perimisio circonda i fasci di miofibre e l endomisio (anche chiamato membrana basale) circonda le singole miofibre. Le miofibre sono le strutture basali del muscolo scheletrico e sono composte di mioblasti multipli fusi. Le fibre multinucleate di nuova formazione esibiscono una nucleazione centrale e una volta che i nuclei si portano nella posizione subsarcolemmale esse sono chiamate miofibre. All interno una miofibra contiene i sarcomeri che rappresentano le unità funzionali del muscolo scheletrico. Il sarcomero consiste di filamenti spessi che si intedigitano con i filamenti di actina ed è specializzato a rispondere a segnali neuromuscolari. Come risposta a questi segnali la cellula si depolarizza ciò si traduce in un rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. Il calcio rilasciato induce l interazione, guidata dall ATP, tra la miosina e l actina portando all accorciamento del sarcomero e alla contrazione muscolare. La maggior parte dei muscoli contiene una miscela di tre differenti tipi di fibre. Le fibre di tipo I sono fibre lente e resistenti alla fatica, le miofibre di tipo 2A sono veloci e moderatamente resistenti alla fatica, le miofibre di tipo 2B sono veloci e non resistenti alla fatica. Questi diversi tipi di fibre possono contenere la catena pesante della miosina lenta oppure rapida. Queste due isoforme hanno la stessa struttura ma differiscono nella attività dell ATPasi. La composizione di miofibre nel muscolo scheletrico è dinamica e può cambiare nell arco della vita. Inoltre i muscoli scheletrici contengono cellule staminali, che sono note col nome di cellule satellite. Le cellule satellite sono localizzate tra il sarcolemma della miofibra e la membrana basale. Queste cellule sono normalmente quiescenti e possono essere attivate dopo miotraumi, proliferano, si auto-rigenerano e infine differenziano in miofibre multinucleate. In generale il programma di attivazione e differenziamento delle cellule satellite ripercorre lo sviluppo embriologico del muscolo con pattern simili di espressione genica che avvengono durante il differenziamento dei mioblasti embrionali e delle cellule satellite durante la rigenerazione muscolare. Nonostante i meccanismi regolatori che influenzano la rigenerazione muscolare siano paralleli a quelli che avvengono durante lo sviluppo del muscolo, i microambienti in cui la 1

miogenesi avviene variano profondamente tra la miogenesi embrionale e la rigenerazione muscolare. Mentre le cellule immunitarie sono relativamente scarse nel muscolo in sviluppo, esse possono essere presenti nel muscolo in rigenerazione alla concentrazione di oltre 100.000 cellule infiammatorie /mm 3 di tessuto muscolare. Queste cellule immunitarie sono principalmente cellule mieloidi che una volta attivate sono in grado di secernere numerose molecole solubili, specialmente citochine, che possono influenzare la vitalità e le attività trascrizionali delle cellule target. I meccanismi attraverso i quali esse possono modulare la rigenerazione hanno cominciato ad essere compresi solo di recente. Rigenerazione del muscolo scheletrico Il riparo/guarigione di un muscolo scheletrico in risposta a un trauma dipende dal tipo di ingiuria (contusione, strappo e lacerazione) e dalla severità. Comunque in generale il processo di riparazione consiste di tre fasi: la fase distruttiva, la fase di riparo e la fase di rimodellamento. La fase di distruzione è caratterizzata da necrosi, formazione dell ematoma, invasione di cellule infiammatorie. Durante la fase di riparo, i detriti derivanti dalla necrosi sono fagocitati e la rigenerazione delle miofibre avviene attraverso l azione delle cellule satellite. In primo luogo, le cellule quiescenti, che esprimono Pax-7, migrano al sito dell ingiuria, up-regolano i fattori di regolazione miogenici (MRFs) MyoD e Myf 5 e diventano proliferative. Da questo momento le cellule satellite sono anche note come mioblasti. Il successivo differenziamento dei mioblasti è caratterizzato dalla down-regolazione di Pax-7 e dalla up-regolazione di Mrf-4 e miogenina. Al termine questi mioblasti differenziati formano miofibre multinucleate o fondono con le miofibre danneggiate per la rigenerazione. Comunque, alcune delle cellule satellite attivate non proliferano e non differenziano, ma si auto-rigenerano e rimpiazzano il pool di cellule satellite. 2

Due differenti meccanismi sono stati proposti per l auto rinnovamento: la divisione simmetrica e quella asimmetrica. La divisione asimmetrica consiste in due cellule figlie, una destinata a differenziare mentre l altra rimane quiescente e si auto rinnova. Ricerche recenti hanno dimostrato che l auto-rinnovamento asimmetrico delle cellule satellite avviene nel muscolo scheletrico. Lo studio di Kuang et al suggerisce anche che il 10% delle cellule satellite non hanno mai espresso Myf5 suggerendo che esse non hanno mai proliferato e non si sono mai auto rinnovate usando la divisione asimmetrica. Al contrario per l attivazione e proliferazione di tutte le cellule figlie è invece usata la divisione simmetrica. Una minoranza di queste cellule si autorinnoverà mantenendo l espressione di Pax-7 e down-regolando l espressione di MyoD. Comunque molte di queste cellule attivate e proliferanti, down-regolano l espressione di Pax-7 e poi differenziano. Durante l ultima fase, la fase di rimodellamento, le miofibre rigenerate maturano e si contraggono. Comunque in alcuni casi si verifica la riorganizzazione e la contrazione di tessuto connettivo non strutturato e si ha come risultato un tessuto cicatriziale e una conseguente incompleta rigenerazione muscolare. 3

REGOLAZIONE DELLA RIGENERAZIONE DEL MUSCOLO SCHELETRICO Come menzionato prima, le cellule satellite sono normalmente quiescenti ma diventano attivate in risposta ad ingiuria, proliferano, differenziano e si fondono per rimpiazzare o riparare le miofibre danneggiate. In questi processi la nicchia delle cellule satellite, i fattori di crescita, le citochine e i fattori neurotrofici giocano un ruolo di rilievo. La nicchia delle cellule satellite Oltre ai fattori solubili, la funzionalità delle cellule satelliti è governata dalla loro specifica nicchia. La più comune definizione della nicchia delle cellule satellite è uno specifico sito di un tessuto dove le cellule staminali possono risiedere per un periodo indefinito di tempo e producono una progenie di cellule mentre si autorinnovano. La più evidente differenza tra la nicchia della cellula satellite e altre nicchie è che le cellule satellite (SC) sono tenute quiescenti la maggior parte del tempo. Nella nicchia della cellula satellite molti fattori influenzano il comportamento delle SC. Elementi strutturali della nicchia sono la membrana basale e la miofibra. Il comportamento delle SC è anche influenzato da prodotti secreti dalle cellule locali, quali le cellule interstiziali, la microvascolatura, la giunzione neuromuscolare e le cellule immunitarie. La nicchia delle SC è direttamente circondata dalla membrana 4

basale e dalla miofibra adiacente. E stato dimostrato che segnali meccanici, elettrici e chimici dalle miofibre adiacenti e dalla membrana basale, che è un componente della matrice extracellulare, sono coinvolti nella regolazione delle CS. Anche la microvascolatura sembra giocare un ruolo importante. Negli umani e nel topo, rispettivamente il 68% e l 82% delle cellule satellite sono localizzate nel raggio di 5 µm da capillari o dalle cellule endoteliali. Inoltre c è una correlazione tra il numero di capillari per fibra muscolare e il numero di cellule satellite. Questo fatto suggerisce con forza una correlazione tra CS e cellule endoteliali durante la miogenesi. Inoltre recenti studi hanno mostrato che i macrofagi, i quali sono attratti in seguito all ingiuria, giocano un ruolo cruciale nella rigenerazione muscolare. In vivo, la soppressione dei macrofagi porta all incompleta rigenerazione del muscolo scheletrico. Inoltre la prevenzione del reclutamento dei monociti al sito dell ingiuria, inibisce completamente la rigenerazione. Malerba e Segawa suggeriscono che i macrofagi influenzano direttamente le cellule satellite mediante due differenti meccanismi. Primo, i macrofagi possono secernere fattori solubili che influenzano le cellule satelliti e secondo, i macrofagi possono interagire con le CS mediante il contatto cellula-cellula e forse proteggerle dall apoptosi. Comunque i macrofagi giocano un ruolo duplice a seconda della loro attività. I macrofagi pro-infiammatori, inducono la proliferazione dei precursori miogenici, mentre i macrofagi antiinfiammatori inducono il differenziamento e la fusione di queste cellule. Lo switch tra macrofagi pro-infiammatori e macrofagi anti-infiammatori è stato osservato in vivo dopo l ingiuria. La deplezione dei macrofagi anti-infiammatori riduce il diametro delle fibre rigeneranti. Inoltre una combinazione di fattori autocrini, fattori prodotti dalle cellule immunitarie infiltranti e in minor misura i fattori derivanti dai motoneuroni innervanti, sembrano governare il comportamento delle cellule satellite. La base per la regolazione del comportamento delle cellule satellite è l adesione all interno della loro specifica nicchia che è determinata dall interazione cellulamembrana basale e cellula-cellula. Il lato basale delle cellule satellite esprime l integrina α7ß1 che lega il citoscheletro con la laminina della membrana basale. In caso di strappo, tale integrina gioca un ruolo importante nella traduzione delle forze meccaniche in segnali chimici che sono coinvolti nella regolazione della miogenesi. Il lato apicale esprime M-caderina che attacca la cellula satellite alla miofibra adiacente. Entrambe i siti di attracco sono essenziali per la trasduzione del segnale tra le SC e le due strutture adiacenti. Inoltre è stato suggerito che la M-caderina gioca un ruolo significativo nell adesione e nella fusione dei mioblasti a formare nuovi miotubi e per rigenerare quelli danneggiati. I principali costituenti della membrana basale sono il collagene di tipo IV, la laminina, i proteoglicani eparansolfato. La laminina connette il collagene attraverso la proteina legante entactina 1 con le 5

integrine sulle SC che, a loro volta, ancorano la membrana basale con il citoscheletro intracellulare.l espressione differenziale delle integrine e la laminina tessutospecifica regolano l homing e l attivazione delle cellule staminali. Un recente studio ha mostrato che l integrina α7ß1 è richiesta per la migrazione delle SC e che il fattore di crescita degli epatociti (HGF) gioca un ruolo cruciale nel guidare le CS. Fattori di crescita Fattori di crescita sono cruciali nella regolazione delle cellule satellite. A causa dei pathway di segnalazione attivati dai fattori di crescita (es. IGF-1), avviene la downregolazione e la up-regolazione di geni muscolo-specifici. I fattori di crescita sono principalmente secreti dalle cellule immunitarie e dalle cellule muscolari dopo l ingiuria. Inoltre la vascolatura, le cellule satellite stesse e i motoneuroni sono anche responsabili per la produzione di fattori di crescita. I fattori di crescita indiretti sono conservati nella matrice extracellulare (ECM) mediante il legame ai proteoglicani e sono rilasciati dall ECM dopo l ingiuria della cellula muscolare. Per consentire il rilascio dei fattori di crescita dall ECM, le cellule satellite aumentano il rilascio di metalloproteinasi 2 e 9 (MMP2-MMP9) dopo l ingiuria. Queste MMP sono coinvolte nella degradazione della ECM che libera fattori di crescita e citochine. In questo modo le SC possono attivare esse stesse indirettamente. Inoltre le MMP sono coinvolte nella migrazione dei mioblasti durante la rigenerazione. In particolare i 6

neutrofili e i macrofagi attivi, che infiltrano l area necrotica, sono responsabili per la secrezione di fattori di crescita, ma anche le cellule T e le piastrine sono coinvolte. Questi fattori di crescita secreti, insieme con i fattori di crescita rilasciati dall ECM, attraggono, attivano e inducono il differenziamento delle CS. Le cellule immunitarie attivate producono anche molecole di adesione come selectine e citochine quali IL-6 e TNF-α. Il secondo influenza il flusso di sangue locale e la permeabilità vascolare, che accelera la risposta infiammatoria. Fattori di crescita stimolatori Molti fattori di crescita come HGF, FGF-2 e 6, VEGF, PDGF-AA e BB, il fattore di crescita stromale 1 e IGF-I e 2 giocano un ruolo importante nella proliferazione miogenica e nel differenziamento. In particolare IGF-1 è critico per la crescita muscolare scheletrica. In vitro, IGF-I, e nella fase finale IGF-2, sono entrambi in grado di modulare l espressione dei fattori regolatori miogenici e promuovere la proliferazione e il differenziamento dei mioblasti derivati dalla SC. La somministrazione sistemica di IGF-I determina l incremento di DNA e del contenuto proteico nel muscolo. Questo è stato confermato usando topi transgenici dimostrando che l overespressione dell IGF-I umana induce ipertrofia muscolare. Inoltre l iniezione diretta di IGF-I migliora la rigenerazione muscolare. Studi in vitro hanno mostrato che questo è regolato principalmente attraverso il pathway del fosfatidilinositolo 3 chinasi e dalla successiva attivazione antiapoptotica di Akt. PI3K è anche coinvolta nell aumento dipendente da IGF-I della produzione di proteine. Oltre IGF-I anche HGF e VEGF sono coinvolti. HGF è il principale fattore in grado di indurre la proliferazione delle SC legandosi a c-met. In relazione a questa proprietà, l espressione di HGF è aumentata, in proporzione con il grado di ingiuria, durante la fase iniziale di proliferazione nella rigenerazione muscolare. In correlazione con queste caratteristiche la diretta iniezione di HGF negli stadi più tardivi della rigenerazione non promuove il riparo del muscolo scheletrico. Inoltre, HGF gioca un ruolo nella migrazione delle SC al sito dell ingiuria. In contrasto con questi effetti stimolatori, l effetto inibitorio di HGF sulla formazione dei miotubi multinucleati, indica gli effetti pleiotropici di questo fattore di crescita. Infine è stato dimostrato che il muscolo in allungamento secerne HGF in una maniera NOdipendente, il quale potrebbe avere anche un ruolo nell attivazione delle SC. VEGF può migliorare la guarigione del muscolo aumentando la fornitura di ossigeno e di nutrienti che sono essenziali per la guarigione. VEGF agisce insieme a PDGF che è anch esso coinvolto nella regolazione delle SC. Ci sono alcune indicazioni che suggeriscono un ruolo anche per gli FGF. L espressione di FGF-6, per esempio, è muscolo-specifica ed è up-regolata durante la rigenerazione muscolare. Comunque lo 7

specifico ruolo di questi fattori di crescita rimane sconosciuto. Lo stromal derived factor-1 (SDF-1) che è secreto dalle miofibre adiacenti così come dal midollo osseo, funziona principalmente come un agente chemiotattico. Una recente ricerca suggerisce che dopo l ingiuria, il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) e l interferone gamma, aumentano la proliferazione delle cellule muscolari. Infine, è importante sapere che alcune combinazioni di fattori di crescita, per esempio HGF e FGF-2 o FGF-6 hanno effetti sinergici sulla proliferazione delle CS. Complessivamente, l altamente mitogenico IGF-I sembra essere il principale fattore di crescita nella rigenerazione muscolare. Anche HGF, che è il principale fattore che induce la proliferazione delle SC quiescenti e VEGF, che stimola l angiogenesi, esercitano un ruolo importante. Fattori di crescita inibitori I principali fattori di crescita ad azione inibitoria nella rigenerazione muscolare sono la miostatina, il fattore trasformante α e β I e le proteine morfogenetiche dell osso (BMP) che sono tutti membri della superfamiglia TGFβ. Questa famiglia contiene molti fattori di regolazione che a seconda del tessuto, influenzano il comportamento cellulare. Nel muscolo scheletrico i membri della superfamiglia TGF-β hanno potenti effetti inibitori sia sullo sviluppo muscolare sia sulla rigenerazione post-natale del muscolo scheletrico. Il pathway di segnalazione dei TGF-β, consiste di tre principali componenti: il ligando, il recettore e i mediatori intracellulari. Dopo il legame del ligando, il recettore dimerizza e ciò avviene tra i recettori di tipo I e II, che trans fosforilano il recettore di tipo I. Questo attiva l attività chinasica latente del complesso recettoriale che poi fosforila una proteina Smad regolata dal recettore che oligomerizza con una co-smad chiamata Smad-4. Questo oligomero trasloca nel nucleo dove interagisce con elementi leganti Smad e regola la trascrizione di geni target in una maniera cellulo-specifica. La miostatina è espressa nelle CS e nei mioblasti. Il rilascio di miostatina determina una down-regolazione di Pax-3 e Myf-5 e previene l espressione di MyoD. I topi Knock-out che mancano di miostatina hanno una estesa ipertrofia muscolare. La miostatina può mantenere le cellule satelliti quiescenti e reprimere l autorinnovamento attraverso l induzione di p21 CIP che è un inibitore universale della chinasi ciclina-dipendente e quindi un inibitore del ciclo cellulare. Inoltre la miostatina e il TGF-βI possono ridurre il reclutamento dei mioblasti e il differenziamento. TGF-βI induce anche il rimodellamento e il riparo dell ECM e della membrana basale stimolando i fibroblasti, ciò si traduce nella 8

produzione di collagene e fibronectina. Questo può determinare la formazione di tessuto cicatriziale. E stato dimostrato che la decorina, che è un inibitore del TGF-β previene la fibrosi del muscolo ed aumenta la rigenerazione muscolare. Le BMPs prevengono la proliferazione delle cellule staminali in un certo numero di nicchie di cellule staminali, ciò può essere contrastato dalla up-regolazione di Noggin. In conclusione, TGF-βI ha l effetto inibitorio più evidente sulla proliferazione e sul differenziamento delle cellule satellite e sembra essere il maggiore inibitore della rigenerazione del muscolo scheletrico. Inoltre altri fattori di crescita sono coinvolti nello sviluppo del muscolo scheletrico e nella rigenerazione ma sono necessarie ulteriori ricerche per definire con esattezza i loro meccanismi. Rilevante il ruolo delle cellule dell immunità innata nella produzione dei fattori di crescita sopra descritti, come può essere osservato dalla tabella 1. RUOLO DEI MACROFAGI NELLA RIGENERAZIONE DEL MUSCOLO SCHELETRICO Ingiurie acute a carico del muscolo danno l avvio a una prevedibile serie di risposte da parte di specifiche popolazioni cellulari mieloidi. Come in altri tessuti, i neutrofili sono i primi a rispondere e cominciano a diventare elevati in numero entro 2 h dal danno muscolare, raggiungendo il picco di concentrazione tra 6 e 24 h dopo l insulto e poi rapidamente declinano in numero. Successivamente all invasione dei neutrofili, cominciano ad affluire i macrofagi, raggiungendo concentrazioni significative circa 9

24 ore dopo l insulto e continuano ad aumentare fino circa due giorni dopo l insulto, per poi declinare nettamente. La loro invasione precede l aumento di una popolazione di macrofagi non fagociti che raggiungono il picco di concentrazione nel muscolo circa quattro giorni dopo l insulto e rimangono significativamente alti per molti giorni. In concomitanza con l afflusso di cellule mieloidi nel muscolo in seguito all insulto, le cellule miogeniche esibiscono uno stereotipato pattern di espressione di fattori di trascrizione e altri geni che riflettono il riparo e la rigenerazione muscolare. Il muscolo, come altri tessuti, inizialmente risponde alle ingiurie con una risposta immune innata giudata dalle citochine Th1. Le citochine espresse durante la risposta infiammatoria guidata dalle citochine Th1, specialmente IFN-γ e TNF-α, guidano l attivazione classica dei macrofagi verso il fenotipo M1 che consiste in una popolazione pro-infiammatoria capace di perpetrare la risposta infiammatoria. I macrofagi M1 possono promuovere danno muscolare in vitro e in vivo mediante la produzione di livelli citotossici di ossido nitrico generato dall ossido nitrico sintasi. I neutrofili, che invadono il muscolo danneggiato prima degli M1, inducono il danno alla membrana muscolare mediante rilascio di mieloperossidasi (MPO). Questo può essere una delle varie interazioni regolatrici che avvengono tra i neutrofili e i macrofagi M1 durante i primi stadi di infiammazione muscolare. Per esempio i neutrofili possono anche promuovere l'attività citolitica dei macrofagi per lisare le cellule muscolari. Questa elevata lisi delle cellule muscolari può poi fornire un feedback positivo per promuovere ulteriormente l'attività fagocitica dei macrofagi che è stimolata dalla lisi dei mioblasti. Dopo che i macrofagi M1 raggiungono la loro concentrazione di picco nel muscolo ingiuriato in rigenerazione, essi vengono rimpiazzati da una popolazione di M2 che possono invece attenuare la risposta infiammatoria e promuovere il riparo tessutale. I macrofagi M2 sono attivati dalle citochine Th2; IL-4, IL-10 e IL-13 hanno ruoli particolamente ben caratterizzati nella attivazione degli M2. I macrofagi M2 presentano un fenotipo complesso che può farli dividere in tre sottoclassi che riflettono specilizzazioni funzionali e molecolari. M2a sono attivati da IL-4 e IL-13 e possono promuovere guarizione e riparo tessutale. M2b sono attivati dagli immunocomplessi o dai recettori Toll-like e rilasciano citochine Th2 anti-infiammatorie, M2c sono attivati da IL-10 e rilasciano citochine che disattivano il fenotipo M1 e possono promuovere la proliferazione delle cellule non mieloidi. La presenza sia di M2a che M2c è stata dimostrata nei muscoli ingiuriati e in rigenerazione. 10

Che cosa innesca la risposta infiammatoriath1 nei muscoli danneggiati? La velocità con cui inizia la risposta infiammatoria Th1 in seguito ad un danno acuto al muscolo è troppo elevata per ipotizzare che ci sia la trascrizione de novo di molecole segnale che attivano il processo. Dal momento che ogni modello di ingiuria che produce la risposta infiammatoria stereotipata coinvolge danni alla membrana della cellula muscolare, probabilmente il rilascio passivo di un fattore chemiotattico immagazzinato dà inizio alla risposta infiammatoria. La desmina, una proteina 11

intermedia muscolo-specifica, è un candidato per la segnalazione perché è rilasciata rapidamente dalle fibre muscolari in seguito all ingiuria ed è capace di attivare il sistema del complemento che costituisce un meccanismo estremamente rapido per iniziare la risposta immunitaria innata. Studi più recenti indicano che perturbazioni dirette, fisiologiche, applicate alle cellule muscolari possono promuovere la rapida espressione di chemochine che contribuiscono all attivazione delle risposte Th1 nelle cellule ingiuriate. I macrofagi M2 possono promuovere la rigenerazione muscolare? Lo shift del fenotipo macrofagico da M1 a M2 rappresenta l evento spartiacque nella rigenerazione muscolare dove c è un cambiamento dallo stadio proliferativo alla precoce fase di differenziamento miogenico. Dal momento che i cambiamenti nel fenotipo macrofagico coincidono con i cambiamenti dello stadio rigenerativo e dal momento che i macrofagi M2 sono collocati in prossimità delle fibre muscolari rigenerative, la probabilità che i macrofagi M2 regolino la rigenerazione è stata riconosciuta e supportata da tempo. Vari modelli sostengono un ruolo per i macrofagi M2 nella promozione della rigenerazione. Normalmente i macrofagi M2 aumentano considerevolmente di numero, parallelamente i macrofagi M1 declinano di numero durante il periodo dai 2 ai 4 giorni di ricarico muscolare. La deplezione dei macrofagi durante questo periodo previene l aumento di diametro delle fibre che normalmente avviene durante il carico, prevenendo il riparo della membrana muscolare che avviene nei controlli non depleti e eliminando la comparsa delle fibre muscolari nucleate centralmente ( CNFs). E ormai chiaramente stabilita l importanza della transizione Th1 a Th2 nel normale procedere della rigenerazione muscolare. Cosa regola lo shift del fenotipo macrofagico nel muscolo ingiuriato? Lo shift nei macrofagi dal fenotipo M1 all M2 in seguito all ingiuria muscolare, coincide con il cambiamento dell ambiente muscolare da uno che promuove la rimozione dei detriti cellulari e aumenta l attivazione e la proliferazione delle cellule satellite, ad uno che promuove il differenziamento e la crescita. Nonostante si sappia poco circa i meccanismi che regolano questa transizione del fenotipo dei macrofagi nel muscolo ingiuriato, studi in vitro supportano la visione che la rimozione fagocitica dei detriti cellulari da parte delle cellule mieloidi possa giocare un ruolo significativo. Per esempio, i macrofagi che venivano indotti ad assumere il fenotipo M1 mediante il trattamento con INF-γ e il lipopolisaccaride, mostrano una riduzione della secrezione di TNF-α e un aumento della secrezione di TGF-ß dopo la fagocitosi 12

di cellule muscolari necrotiche riflettendo uno shift verso il fenotipo M2. In modo interessante, l identità delle cellule necrotiche fagocitate dai macrofagi può determinare se lo shift del fenotipo avverrà o meno. L esposizione dei macrofagi ai neutrofili lisati aumenta la produzione di IL-10 da parte dei macrofagi, ma l esposizione ai linfociti lisati non produce questo effetto, differenza attribuibile alle proteine citosoliche rilasciate dai due tipi di cellule in seguito alla lisi. Comunque una variabile più importante nel determinare lo switch del fenotipo macrofagico può essere se il target dei fagociti è una cellula necrotica o apoptotica. La fagocitosi di neutrofili apoptotici, ma non dei neutrofili opsonizzati, sopprime l espressione di IL- 1ß, IL-10 e TNF-α e aumentata l espressione di TGF- ß indicando uno shift verso il fenotipo M2. In modo simile, l apoptosi dei neutrofili, ma non i neutrofili lisati aumenta la secrezione di TGF- ß, mentre la fagocitosi di neutrofili lisati ma non dei neutrofili apoptotici aumenta la secrezione di TNF- α. Il time course dell apoptosi delle cellule mieloidi nel muscolo in seguito all ingiuria acuta, coincide con lo shift del fenotipo dei macrofagi. Questo fatto supporta la speculazione che la fagocitosi delle cellule apoptotiche possa contribuire a regolare il fenotipo dei macrofagi nel muscolo ingiuriato in vitro. MODIFICAZIONI DEL MUSCOLO DURANTE L INVECCHIAMENTO L invecchiamento è associato ad una lenta e progressiva diminuzione della forza muscolare che è ampiamente attribuibile alla perdita del muscolo. Fra i 30 e 75 anni, la massa magra dell organismo si riduce, soprattutto a causa della perdita di massa muscolare scheletrica, inoltre il numero e la dimensione delle fibre muscolari diminuiscono progressivamente. Questo processo è denominato sarcopenia. Nella patogenesi della sarcopenia possono essere coinvolti diversi fattori legati all invecchiamento : riduzione del livello di attività fisica, modificazioni a carico del sistema nervoso centrale o periferico, probabilmente iniziate nel corso dell età media, che possono portare alla perdita di unità motorie, riduzione del tasso di sintesi proteica nei muscoli scheletrici. In molte persone anziane, la perdita di massa muscolare può essere accelerata dal concomitante aumento del fabbisogno proteico e dalla riduzione dell assunzione di proteine con la dieta. Nei giovani sani, il 30% del peso corporeo è rappresentato dai muscoli, il 20% dal tessuto adiposo e il 10% dalle ossa. Ai muscoli si deve il 50% della massa magra corporea e circa il 50% del contenuto corporeo totale di azoto. Entro i 75 anni, i muscoli costituiscono circa il 15% del peso corporeo, il tessuto adiposo il 40% e le ossa l 8%. Pertanto, la metà della massa muscolare è scomparsa a causa della sarcopenia. Le fibre muscolari di 13

tipo II, ad alta velocità di contrazione, si riducono in misura maggiore rispetto alle fibre di tipo I, a contrazione più lenta. La perdita di fibre muscolari dovuta all invecchiamento provoca una diminuzione della forza massima di contrazione isometrica, che si riduce del 20% entro i 60 anni e del 50% entro gli 80 anni. I motivi della comparsa di queste modificazioni della composizione corporea e della forza di contrazione isometrica non sono ancora del tutto compresi, ma tra i fattori che vi contribuiscono potrebbe esserci un deficit relativo di ormoni anabolizzanti, come l ormone della crescita, il fattore di crescita insulino-simile I (IGF-1), il testosterone e il deidroepiandrosterone (DHEA), e una riduzione dell esecuzione abituale di un lavoro muscolare vigoroso. Crescita muscolare e rigenerazione nel muscolo dell anziano Anche in età avanzata, il muscolo scheletrico risponde ad un allenamento contro resistenza con un aumento della massa muscolare e della forza. Vi sono comunque dei dati che riguardano sia l animale sia l uomo in cui si dimostra che la plasticità muscolare è ridotta in età avanzata come si può vedere dal fatto che vi è un attenuata risposta ipertrofica, un mancato adattamento agli stimoli elettrici ed una perdita della capacità rigenerativa delle fibre muscolari. Questo in parte può essere dovuto ad una diminuzione dei fattori di crescita e di rimodellamento e ad un attenuato cambiamento nella loro espressione dopo una serie di esercizi contro resistenza in età avanzata. Per la rigenerazione, la crescita e il mantenimento muscolare è essenziale il reclutamento delle cellule satellite. Durante le normali attività di vita giornaliera, il muscolo può subire alcuni, sebbene piccoli, danni. Per riparare questi danni, le cellule satellite si dividono, fondono in miofibre o formano miotubi per riempire le regioni danneggiate della fibra e poi differenziarsi in mionuclei. Mentre in vitro il potenziale di proliferazione e differenziamento delle cellule satellite derivate da persone anziane sembra essere sufficiente per la rigenerazione, in vivo il reclutamento delle cellule satellite nei muscoli umani di anziani è ridotto. La differenza cruciale potrebbe essere l ambiente delle cellule satellite che è simile per le cellule giovani e vecchie in coltura, mentre non è necessariamente lo stesso in vivo. A conferma dell importanza dell ambiente della cellula satellite i ricercatori Carison e Faulkner hanno dimostrato in un loro studio del 1989 che i muscoli vecchi avevano un recupero simile a quello dei muscoli giovani quando erano trasferiti in ratti giovani, mentre la rigenerazione dei muscoli giovani era impedita quando questi ultimi erano trasferiti in animali vecchi. Studi ed 14

approfondimenti successivi hanno evidenziato che la rigenerazione muscolare in topi vecchi migliorava quando essi condividevano la circolazione con animali giovani. Il rafforzamento della capacità rigenerativa dei muscoli vecchi non era spiegabile con il contributo delle cellule progenitrici derivate dagli animali giovani, ma era piuttosto il risultato del ringiovanimento delle cellule satellite presenti all interno del muscolo anziano. Inoltre, il ringiovanimento delle cellule satellite vecchie esposte al siero proveniente da animali giovani in vitro suggerisce che le sostanze circolanti influenzano la capacità rigenerativa della cellula miosatellite. Fino ad ora non è noto quali siano le sostanze che hanno un impatto negativo sulla capacità rigenerativa del muscolo e quindi contribuiscono alla perdita della massa muscolare e della forza durante l invecchiamento, ma ci sono indicazioni in base alle quali si può supporre che una infiammazione sistemica cronica di bassa entità potrebbe essere quel fattore. In verità la citochina infiammatoria TNFα influenza negativamente la capacità rigenerativa del muscolo: TNFα destabilizza MyoD, un fattore di trascrizione muscolo-specifico coinvolto nella proliferazione e nel differenziamento delle cellule satellite e induce apoptosi delle cellule satellite particolarmente in età avanzata. E stato ipotizzato che alcuni di questi effetti siano mediati dall espressione di inibitori di proteine del differenziamento indotta da TNFα. Va precisato che l aumento di TNFα durante la normale risposta infiammatoria facilita piuttosto che impedire, il processo di riparazione. Questa apparente contraddizione può essere spiegata per il fatto che gli effetti del α TNF sono dipendenti dalla concentrazione e dal tempo. Perciò l effetto negativo dell infiammazione sistemica sulla forza muscolare in età avanzata può comparire quando TNFα supera un determinato valore soglia e persiste per un periodo prolungato. 3.8.Effetti della citochina TNFα sulle cellule miosatellite Diversi ricercatori concordano nell ipotesi che la citochina TNFα possa mediare, almeno in parte, le alterazioni nell espressione dei fattori regolatori miogenici 15

(MRFs) e delle proteine inibitrici del differenziamento (Id). Gli MRFs sono una famiglia di 4 fattori di trascrizione muscolo specifici, MyoD, miogenina, MRF4 e Myf5 che regolano la trascrizione di geni muscolo specifici durante i vari stadi del differenziamento muscolare. Quando formano degli eterodimeri con le proteine E, gli MRF possono legare il DNA e indurre la trascrizione di geni che sono sotto il loro controllo. Il rilascio di ROS indotto da TNFα non solo incide negativamente sulla funzione muscolare, ma facilita anche l attivazione di NF-kB mediante la degradazione di I-kB nel proteosoma. L attivazione di NF-kB indotta da TNFα porta alla perdita dell mrna per MyoD ed alla degradazione, mediante il sistema ubiquitina -proteosoma di MyoD e Miogenina (che sono regolatori chiave del passaggio delle cellule miosatellite da cellule proliferanti a cellule in differenziamento). Questo potrebbe spiegare perché i mioblasti esposti al TNFα in vitro proliferano ma sono incapaci di differenziare. Effetti simili non sono limitati alla condizione in vitro, poiché anche i topi in cui era sovraespresso TNFα o in cui veniva iniettata un elevata concentrazione di TNF α manifestavano una compromessa capacità rigenerativa muscolare, che era accompagnata da livelli ridotti della proteina MyoD. La capacità rigenerativa, inoltre, potrebbe essere ulteriormente impedita dall apoptosi dei mioblasti, particolarmente in età avanzata quando le cellule satellite sono più suscettibili all apoptosi indotta da α. TNF Nei ratti, comunque, l età avanzata è associata ad un aumento del numero dei nuclei apoptotici delle cellule miosatellite e alla perdita della capacità di recupero dopo un danno provocato da contrazione. Complessivamente tutte queste osservazioni concordano con l opinione che il TNFα possa causare preferenzialmente l apoptosi delle cellule satellite. L infiammazione sistemica cronica di basso grado può contribuire alla sarcopenia? L infiammazione normalmente è strettamente correlata con la rigenerazione e il meccanismo di riparazione che segue il danno. Anche dopo una singola seduta di esercizio contro resistenza i macrofagi locali e il rilascio di citochine mostrano una risposta evidente che è significativamente attenuata durante l invecchiamento. 16

Durante il processo di recupero dal danno e dopo una seduta di esercizio contro resistenza, la risposta infiammatoria porta all attivazione delle cellule satellite che è cruciale per il recupero dal danno. E stato visto che TNFα, una delle principali citochine infiammatorie, stimola la proliferazione delle cellule satellite e il loro differenziamento. Questo, insieme alla stimolazione della sintesi delle proteine muscolari, può aiutare il processo di recupero dal danno. Questo effetto, comunque, è dipendente dalla concentrazione, poiché il differenziamento dei mioblasti in coltura avviene solo ad una concentrazione di TNFα di 0.05 ng/ml, mentre il differenziamento è compromesso alla concentrazione di 0.5-5 ng/ml di TNFα. A concentrazioni più elevate può avvenire anche l apoptosi dopo un iniziale fase di proliferazione. Prese tutte insieme queste osservazioni suggeriscono che il diverso effetto di TNFα dipende dalla sua stessa concentrazione. Anche se la situazione non è del tutto definita, vi sono molti dati che indicano che la fragilità e la mortalità sono correlate ai livelli dell infiammazione cronica sistemica di basso grado e gli elevati livelli di citochine circolanti sono negativamente correlati alla massa muscolare e alla funzionalità muscolare negli anziani. In uno studio prospettico di follow-up, relativo ad un periodo superiore a 4 anni, è stato trovato che la capacità di produrre TNFα da parte del sangue intero in persone di 85 anni correlava con la perdita di forza nell hand-gripper. Questi effetti negli anziani possono essere causati dalla persistenza per diversi anni di livelli relativamente elevati di citochine infiammatorie che impediscono il differenziamento delle cellule satellite e, quindi, il mantenimento del muscolo, portando ad una lenta, ma progressiva perdita muscolare. Come fronteggiare l infiammazione sistemica e la perdita muscolare Esercizio Il ridotto livello di attività durante l invecchiamento contribuisce all atrofia correlata all età e accompagna la debolezza muscolare nonché la perdita della capacità di generare forza. La debolezza muscolare può portare ad una maggior vulnerabilità a causa di contrazioni improvvise di elevata intensità e porta ad una risposta infiammatoria più ampia rispetto a quella che si verifica nel muscolo forte. Se è così, l esercizio di resistenza potrebbe non solo portare ad un aumento della dimensione del muscolo e della forza, ma anche ad una riduzione della espressione locale di TNFα. A supporto di questa ipotesi c è il fatto che nel muscolo di soggetti anziani 17

che seguono un programma di allenamento contro resistenza diminuisce l espressione di TNFα e aumenta la sintesi di proteine muscolari e della forza. Allo stesso modo è stato dimostrato che l esercizio contro resistenza aumenta la forza e la massa muscolare in soggetti anziani, molto anziani e fragili ed in varie tipologie di pazienti con fragilità. Vi sono comunque alcuni studi che mostrano una risposta ipertrofica attenuata in età avanzata sia nel muscolo umano sia nel muscolo di ratto. Inoltre l inizio di un esercizio a lungo termine in ratti di età superiore ai 20 mesi, accorcia, piuttosto che aumentare l aspettativa di vita per i ratti, il che porta al concetto di età soglia oltre la quale l esercizio è controproducente e non benefico. Da notare, inoltre, che donne settantaquattrenni, come le donne giovani, sviluppano ipertrofia in risposta a esercizio progressivo contro resistenza, mentre ciò non avveniva per donne ottantacinquenni. Ciò fa pensare che un valore soglia potrebbe esistere anche per i soggetti umani. È opportuno comunque che quanto è stato appena detto non implichi che l esercizio contro resistenza non debba essere proposto a persone anziane fragili, ma che la risposta all esercizio deve essere strettamente monitorata. Chiaramente se questa età-soglia esiste anche negli umani, sarà diversa tra i singoli individui e deve essere ancora stabilito da che cosa essa sia determinata Restrizione calorica La restrizione calorica rallenta il processo di invecchiamento, non solo riducendo lo stress ossidativo, ma anche inducendo un cambiamento metabolico che aumenta il ricambio proteico e previene il danno macromolecolare. Recentemente, da uno studio condotto su ratti, è stato dimostrato che un regime di restrizione calorica mantenuto per tutta la vita attenua l aumento correlato all età del TNFα circolante, con effetti antiapoptotici nel muscolo superficiale rapido vasto laterale, inoltre induce alterazione del segnale NF-kB nel muscolo lento soleo; la qual cosa potrebbe attenuare rispettivamente le rotture muscolari e le conseguenze del compromesso differenziamento delle cellule satellite. Anche se ciò è molto promettente, vi sono alcuni effetti collaterali come abbassamento della pressione sanguigna, ritardo nel processo di guarigione e osteoporosi, il che potrebbe richiedere ulteriori studi, prima che un regime di restrizione calorica possa essere largamente raccomandato contro l invecchiamento. 18

IGF-1 IGF-1 è un importante ormone anabolico e aumenta la rigenerazione muscolare, favorisce la protezione dal danno e lo sviluppo dell ipertrofia, almeno parzialmente modulando l espressione locale delle citochine infiammatorie. Di conseguenza è allettante pensare di somministare IGF-1, per diminuire il potenziale effetto deleterio dell infiammazione sistemica cronica di basso grado in età avanzata. L efficacia di IGF-1 può comunque essere diminuita da TNFα poiché, TNFα può interferire con la via di segnale di IGF-1 ed è stato visto in vitro che gli effetti di IGF-1 sull azione di TNFα dipendono dalla concentrazione di entrambe le sostanze. Mentre i mioblasti esposti a 1 ng/ml di TNFα non vanno in apoptosi, la coincubazione di TNFα con IGF-1 si è dimostrata pro-apoptotica; di qui l ipotesi che in certe condizioni IGF-1 possa persino aggravare la situazione. Una situazione simile può esistere in vivo in particolare negli anziani dove esiste una correlazione positiva tra i livelli di IGF-1 circolanti e forza muscolare e potenza muscolare, correlazione che scompare se i livelli sierici di IL-6 sono elevati. Queste osservazioni indicano che IGF-1 può in alcuni casi causare un ulteriore peggioramento della perdita muscolare e quindi della funzionalità del muscolo piuttosto che un miglioramento della situazione. Conclusioni Livelli elevati di citochine circolanti sono associati a perdita muscolare e debolezza in età avanzata. Normalmente comunque l infiammazione gioca un ruolo importante nel processo di riparazione tissutale, incluso il muscolo scheletrico. L apparente divergenza tra gli effetti benefici dell infiammazione nella riparazione muscolare e gli effetti deleteri osservati nell invecchiamento e in molte malattie croniche può dipendere dal livello e dalla durata dell infiammazione sistemica. Gli effetti di TNFα, per esempio, sono dipendenti dalla concentrazione e dal tempo di esposizione; mentre concentrazioni relativamente basse facilitano il processo di riparazione, elevate concentrazioni ed un esposizione di lunga durata compromettono la rigenerazione. Gli effetti dell infiammazione sistemica possono essere modulati anche dai livelli di altre sostanze circolanti come IGF-1. Inoltre, non tutti gli anziani sono soggetti a infiammazione sistemica di basso grado; pertanto, è lecito supporre che altri fattori contribuiscano alla debolezza muscolare e alla perdita muscolare 19

correlate all età. Ancora, la concentrazione di molti ormoni circolanti come -IGF-1, l ormone della crescita, l ormone tiroideo, estrogeni e testosterone -che esercita un effetto positivo sulla massa e sulla funzione muscolare, diminuisce con l età. Perciò l effetto negativo dell infiammazione sistemica sulla forza muscolare in persone in età avanzata può comparire quando essa supera una certa soglia.vari studi negli ultimi anni hanno iniziato a fornire elementi per la comprensione della complessa relazione tra le cellule infiammatorie ed il muscolo scheletrico interessato da un danno acuto o da malattie cronico-degenerative. Ora, è chiaro che i macrofagi e i neutrofili sono necessari per la fagocitosi delle fibre necrotiche nello stadio iniziale del danno e della degenerazione delle fibre. Inoltre, i macrofagi promuovono attivamente la rigenerazione delle fibre attraverso il rilascio di fattori di crescita mitogenici e di chemochine, che, probabilmente, contribuiscono al reclutamento di precursori miogenici locali e circolanti portando alla riparazione muscolare. 20