I Force Fields atomistici per Sistemi di interesse biologico

Capitolo 1 I Force Fields atomistici per Sistemi di interesse biologico Nel capitolo che segue descriveremo le metodologie per il calcolo delle energie configurazionale dei sistemi di interesse biologico a livello atomistico. La conoscenza dell energia configurazionale del sistema costituisce, come vedremo, un elemento fondamentale per individuare le strutture molecolari assunte dal sistema in condizioni fisiologiche. Per force field si intende l insieme dei parametri o parametrizzazione che concorrono alla determinazione dell energia di interazione tra le particelle (atomi) che costituiscono il sistema. Il generale possiamo dunque scrivere: V (r 1, r 2,..., r N ) = E (1.1) dove r 1, r 2,..., r N sono i vettori 1 posizione della particella (atomo) 1, della particella 2,..., della particella ennesima. La funzione energia definita dall equazione 1.1 è dunque 1 N.B. I vettori sono definiti nello spazio cartesiano da tre componenti, lungo x, y e z. Quando ci si riferisce ad una quantità vettoriale (per esempio velocità, forza, posizione etc) la si scrive in grassetto per distinguerla da una quantità scalare. Dunque con r indico il vettore posizione (tre coordinate x,y,z) rispetto all origine, mentre con r indico la distanza dall origine (un numero) 1

una funzione a 3N variabili perché il vettore posizione della particella i-esima si definisce specificando le sue componenti x, y, z. Il sistema biologico sul quale ci concentreremo in questo corso è costituito da un recettore (tipicamente una proteina), da un farmaco (una molecola molto più piccola) e dal solvente circostante (normalmente acqua). Se N p è il numero di atomi che costituiscono la proteina, N f il numero di atomi che costituiscono il farmaco e N s il numero di atomi che costituiscono il solvente, tali che N = N p + N f + N s, l equazione 1.1 può dunque essere scritta come: V (r 1, r 2,..., r N ) = V p (r 1, r 2,..., r Np ) + V f (r 1, r 2,..., r Nf ) + + V pf (r 1, r 2,..., r Np, r 1, r 2,..., r Nf ) + + V ps (r 1, r 2,..., r Np, r 1, r 2,..., r Ns ) + + V fs (r 1, r 2,..., r Nf, r 1, r 2,..., r Ns ) + + V s (r 1s, r 2s,..., r Ns ) (1.2) Sulla base della Eq. 1.2, la forma potenziale 1.1 può essere scritta come una somma di termini corrispondenti a: 1) V p (r 1, r 2,..., r Np ) Potenziale proteina-proteina che dipende dalle coordinate dei soli N p atomi delle proteina. 2) V f (r 1, r 2,..., r Nf ) Potenziale farmaco-farmaco che dipende dalle coordinate dei soli N f atomi del farmaco. 3) V pf (r 1, r 2,..., r Np, r 1, r 2,..., r Nf ) Potenziale farmaco-proteina che dipende dalle N pf = N p + N f coordinate della proteina e del farmaco 4) V ps (r 1, r 2,..., r Np, r 1, r 2,..., r Ns ) Potenziale N ps = N p +N s proteina-solvente che dipende dalle coordinate della proteina e del solvente. 5) V fs (r 1, r 2,..., r Nf, r 1, r 2,..., r Ns ) Potenziale farmaco-solvente che dipende dalle N fs = N f + N s coordinate del farmaco e del solvente. 2

6) V s (r 1s, r 2s,..., r Ns ) Potenziale solvente-solvente che dipende dalle N s coordinate del solo solvente. Nella reazione farmaco-recettore, ovvero ai fini della determinazione dell affinita di un farmaco verso un recettore, ciascuno di questi termini del potenziale di interazione è importante. P + F PF [P][F] [PF] = k i (1.3) La funzione 1.2 rende il valore dell energia per una configurazione del sistema costituito dal farmaco, dalla proteina e dal solvente. Per configurazione del sistema si intende l insieme dei 3N valori delle coordinate che costituiscono il sistema stesso composto da N particelle (atomi). Come vedremo le configurazioni scelte dal sistema biologico (cioè quelle che e più probabile osservare in condizioni fisiologiche) sono quelle a energia inferiore. Vedremo meglio in seguito che nei sistemi a temperatura finita, viene popolata maggiormente la configurazione con l energia libera più bassa. L energia libera si definisce come: G = E T S (1.4) Essa è una funzione delle coordinate di ordine sistema. Nel caso del sistema farmacorecettore descritto dalla Eq. 1.2, essa e una funzione delle N = N p +N f +N s coordinate. G(r 1, r 2,..., r N ) = E(r 1, r 2,..., r N ) T S(r 1, r 2,..., r N ) (1.5) Vedremo che la dipendenza di G dalle coordinate è molto complessa. Quanto al significato di E(r 1, r 2,..., r N ), esso è direttamente collegabile al potenziale definito nelle equazioni 1.1 e 1.2: E(r 1, r 2,..., r N ) =< V (r 1, r 2,..., r N ) > (1.6) 3

Dove il significato del simbolo < V (r 1, r 2,..., r N ) > sta ad indicare il valor medio del potenziale (in senso termodinamico statistico) nelle condizioni del sistema, come vedremo in seguito. Per quanto riguarda il solvente, esistono due modi per tenerlo in conto. 1) Il modo esplicito, nel quale il solvente è semplicemente costituito da un insieme di molecole fatte a loro volta di atomi. 2) Il metodo implicito, nel quale il solvente è considerato un mezzo dielettrico continuo in cui sono immersi il farmaco e la proteina. I potenziali V p e V f nella Eq 1.2 vengono, in questo ultimo approccio, rinormalizzati. L equazione 1.2 si riferisce al modello a solvente esplicito costituito da N s particelle (atomi). L energia complessiva nel modello implicito si scrive come V (r 1, r 2,..., r N ) = V p(r 1, r 2,..., r Np ) + V f(r 1, r 2,..., r Nf ) + + V pf(r 1, r 2,..., r Np, r 1, r 2,..., r Nf ) (1.7) Il simbolo nell equazione 5.7 come soprascritto di V p, V f e V pf, sta ad indicare che queste funzioni sono opportunamente modificate rispetto al caso esplicito per la presenza del solvente continuo. Prima di affrontare il problema farmaco-recettore da un punto vista meccanico-statistico (cioè dal punto di vista delle equazione 1.5 e 2.8), bisogna vedere come fare a calcolare il valore dell energia data una configurazione del sistema, ovvero noto l insieme delle coordinate x, y, z di tutti i suoi atomi. Per fare questo occorre definire esplicitamente una forma analitica della funzione empirica V (r 1, r 2,..., r N ). Affronteremo il problema a pezzi. Vedremo prima come sono definiti i potenziali V p (r 1, r 2,..., r Np ) e V f (r 1, r 2,..., r Nf ) cosiddetti bonded, cioè che definiscono la struttura topologica delle molecole proteina e farmaco. Vediamo prima il caso della proteina: V p (r 1, r 2,..., r Np ) = Vp bonded (r 1p, r 2p,..., r Np ) + Vp non bonded (r 1p, r 2p,..., r Np ) (1.8) Il potenziale Vp bonded (r 1, r 2,..., r Np ) è detto termine bonded di valenza e coinvolge tutti gli N p atomi delle proteine. Il termine Vp nonbonded (r 1, r 2,..., r Np ) è detto potenziale 4

non bonded e di nuovo coinvolge le coordinate di tutti gli atomi della proteina. Esso è responsabile delle interazioni tra atomi non legati e lo vedremo meglio in seguito. Possiamo naturalmente scrivere una equazione analoga alla equazione 1.8 per il farmaco o per il solvente : V f (r 1, r 2,..., r Nf ) = Vf bonded (r 1, r 2,..., r Nf ) + V non bonded f (r 1, r 2,..., r Nf ) V s (r 1, r 2,..., r Ns ) = Vs bonded (r 1, r 2,..., r Ns ) + Vs non bonded (r 1, r 2,..., r Ns ) (1.9) Sulla base dell equazione 1.8 (o della equazione 1.9) abbiamo assunto che il potenziale intra-proteina (o intra-farmaco/solvente) possa essere scritto come una somma di due termini, il potenziale bonded e quello non-bonded (I termini misti nella Equazione 1.2, cioè i termini V pf, V ps, V fs in solvente esplicito o il termine V pf in solvente implicito, come vedremo nelle sezioni seguenti, sono descritti dal solo potenziale non-bonded ). Concentriamoci ora sulla forma del potenziale bonded. 1.1 Potenziale bonded (legato o di valenza) per i sistemi biologici Per capire questo potenziale la cosa migliore è fare un esempio pratico. Supponiamo di aver a che fare con una mini proteina costruita da una sola alanina (vedi Figura 1.1) Il fatto che questo esempio sia sufficiente a spiegare la forma funzionale del potenziale bonded, implica il concetto di trasferibilità dei parametri associati a tale potenziale. Così in generale possiamo scrivere che : V bonded (r 1, r 2,..., r Np ) = V bonded (r 1, r 2,..., r Np, α1, b α2, b..., αp) b (1.10) Dove gli α1, b α2, b..., αp b sono i parametri del potenziale bonded. Questi parametri costituiscono una parte del cosiddetto force field. L insieme di tutti i parametri riferiti ai diversi termini, bonded, non-bonded, V f, V p, V ps, etc, etc. costituiscono il force field. 5

Figura 1.1: Mini-proteina costituita dal solo residuo Alanina con due unita terminali metiliche. La mini-proteina ha tutti gli ingredienti di una proteina, il legame peptidico (evidenziato in rosso), gli angoli diedri psi e phi, etc. etc. Vedremo ora, nel caso dell interazione bonded per la proteina, le struttura della funzione V bonded (r 1, r 2,..., r Np, α b 1, α b 2,..., α b p). Abbiamo che: V bonded (r 1, r 2,..., r Np, α b 1, α b 2,..., α b p) = V stretch (r 1, r 2,..., r Np, α st 1, α st 2,..., α st p ) + +V bend (r 1, r 2,..., r Np, α ben 1, α ben 2,..., α ben p ) + +V tors (r 1, r 2,..., r Np, α tors 1, α tors 2,..., α tors p ) (1.11) 6

Una formula del tutto simile si applica al potenziale di tipo bonded del farmaco che in questo caso dipenderà dalle r 1, r 2,..., r Nf parametri di tipo bonded per il farmaco. Vediamo il primo termine nella equazione 1.11: coordinate del farmaco e dagli α b 1, α b 2,..., α b f V stretch (r 1, r 2,..., r N, α1 st, α2 st,..., αp st ) = 1 N strech K i (r i r 0i ) 2 (1.12) 2 La sommatoria nella equazione 1.12 va su tutti gli stretching presenti nel sistema, ovvero su tutti i legami. Nelle mini proteine di Figure 1.1, r 0i contiene 21 stretching, di cui 10 di tipo C-H, 2 di tipo C=O, 2 di tipo N-H, 4 di tipo C-N, 1 di tipo C-C, 2 di tipo C-C(=O). Io ho quindi raggruppato gli stretching possibili nelle molecole di Figura. 1. in classi Nella 1.12, teoricamente ci sono tante coppie di parametri r oi e K i quanti sono gli stretching del sistema. In realtà il numero di r 0i e K i è pari al numero di classi. Nel caso della nostra proteina di Figura 1.1 le classi sono solo 6 (contro 21 stretching). Ciò significa che i parametri relativi ad uno stretching C-H sono trasferibili a tutti gli stretching appartenenti alla stessa calasse. Ciò che caratterizza una classe di stretching è il tipo (atomo) e ibridazione dei due atomi coinvolte nello stretching: tutti e 9 gli stretching C-H coinvolgono un carbonio eh un idrogeno, nei quali il carbonio è ibridato sp3. Veniamo ora al significato dei parametri r 0i e K i nelle equazione 1.12 Come detto vi sono 6 classi di stretching nella proteina di Figura. 2. e dunque vi sono 12 parametri, α 1,..α 12, nella nostra molecola di Figura 1.1. i=1 Per capire a cosa sono legati questi parametri di stretching, facciamo il grafico della funzione potenziale associate ad uno solo di questi parametri. r o è la distanza di equilibrio, per la quale l energia di stretching vale 0. Per tutti gli altri valori di r, V è maggiore di 0. Dunque la configurazione più favorita energeticamente è proprio quella per cui r = r 0, cioè quella per la quale i due atomi coinvolti nello stretching si trovano proprio alla distanza r 0. r è la distanza tra i due atomi coinvolti nello stretching. Essa dipende dalle coordinate di 7

Figura 1.2: Destra: Grafico della funzione dell energia di uno stretching generico V str = 1 K(r r 2 0) 2 in funzione della distanza r tra i due atomi legati.sinistra: Definizioni di coordinate vettoriali di due atomi questi atomi (supponiamo 1 e 2) in modo tale che: r = r 1 r 2 = (x 1 x 2 ) 2 + (y 1 y 2 ) 2 + (z 1 z 2 ) 2 (1.13) La costante K nell espressione per lo stretching 1.12 è legata alla curvatura della funzione energia, cioè alla forza del legame tra atomi coinvolti nello stretching. Più alto è K e maggiore è la forza del legame. In realtà l espressione 1.12 è solo un approssimazione della realtà fisica di un legame chimico. La funzione energia vera in funzione della distanza di legame assomiglia alla forma funzionale V = 1 2 K(r r 0) 2 D c soltanto per valori di distanze vicini al valore di equilibrio r 0. Questo accade (cioè la distanza di legame oscilla attorno a r 0 ) soltanto quando la temperatura del sistema non è troppo elevata (tipicamente T=300K). Dunque l espressione 1.12 costituisce una buona approssimazione della realtà quantomeccanica (rappresentata dalla curva solida di Figura 1.3 solo a temperature ordinarie, cioè quelle alle quali i legami chimici non si rompono 8

Figura 1.3: Funzione di Morse vera per un legame chimico (tratto solido) e sua approssimazione armonica (curva tratteggiata) V = 1K 2 i(r i r 0i ) 2 D c dove D c e un off-set legato all energia dissociazione mai: In una proteina, se non intervengono modifiche post-transazionali indotte da agenti esterni (tipicamente enzimi), l integrità dei legami chimici è preservata. Il termine D c in Figura 1.3 (corrispondente alla ordinata del minimo della funzione) corrisponde all energia di dissociazione ed è un termine costante, che viene normalmente non incluso nell espressione energia di stretching: se invece si vuole confrontare l energia di stretching di due diverse configurazioni atomiche delle molecole, questo termine (D c ) si elide e non conta nulla. La costante K è legata alla frequenza di oscillazione del legame. maggiore è la frequenza di vibrazione del legame e più elevato è K secondo la relazione: K = µω 2 (1.14) 9

µ = m 1m 2 m 1 + m 2 ω = K µ (1.15) dove µ è la massa ridotta. la frequenza di vibrazione. La K può essere derivata, per esempio, dagli spettri infrarossi di molecole organiche. La K relativa allo stretching C-H può essere dedotta dall analisi degli spettri degli idrocarburi aromatici ω = 2πν 1 λ (cm 1 ) = ν c ν = 3000 cm 1 3 10 10 cm sec 1 ν 9 10 13 sec 1 ω 3.14 9 10 13 radianti sec 1 (1.16) Figura 1.4: Spettro infrarosso del butano in fase gassosa. L assorbimento a ca 3000 cm 1 corrisponde ai modi di stretching della molecola. Dunque la frequenza ω dello stretching C-H è pari a 3 10 14 sec 1. Ciò implica che la K è data da K 9 10 28 ( u.m.a. sec 2 ), visto che la massa ridotta del legame C-H è circa 1, pari cioè a quella dell atomo più leggero (in u.m.a.). In realtà le unità di misura della K, costante di forza, sono in Kcal mol 1 Å 2, dove 1Å = 10 10 m. In questa 10

unità la K del legame C-H desunta dagli spettri infrarossi è data da c.a 200 KcalÅ 2. Infatti: 9 10 28 10 29 g mol 1 sec 2 10 26 Kg mol 1 sec 2 10 26 Joule mol 1 metri 2 10 6 Joule mol 1 Å 2 10 3 KJoule mol 1 Å 2 200 Kcal mol 1Å 2 Veniamo ora al termine detto di bending espresso dal termine V bend (r 1, r 2,..., r Np ) nella Eq. 1.12. Abbiamo che: Al solito K (b) i V bend (r 1, r 2,..., r N, α1 ben, α2 ben,..., αp ben ) = 1 bendings K (b) i (α α 0i ) 2 (1.17) 2 è la costante di forza (legata alla frequenza) dell i-esimo bending, α 0i è l angolo di bending di equilibrio (cioè quello per il quale l energia di bending è 0) e la sommatoria e estesa a tutti i possibili bendings (angoli) della molecola. Nel caso di Figura 1.1, questa sommatoria si estende a 36 possibili bending (c.a. 1.5 volte gli stretching) puri. Per ogni carbonio ibridato sp3 noi possiamo definire 6 possibili bending e per ogni carbonio/azoto ibridato sp2 noi contiamo 3 bending, per un totale appunto di 36. Le classi in questo caso sono solo 10 (ovvero i parametri da definire nella Equazione 1.17 sono solo 20, i 10 angoli di equilibrio e le 10 costanti di forza legate alla frequenza di bending per le 10 classi ). Le classi sono definite dal tipo di atomi e dalla loro ibridazione. Nuovamente la K è legata alla frequenza di bending (che nel butano [vedi Figura 1.4] è circa 1000 cm 1 ). La relazione K ω è un po più complessa che nel caso dello stretching: ω 2 = 4K/I b dove I b è il momento di inerzia attorno all asse di bending. Il valore dell angolo α dipende dalle coordinate di tre atomi, ovvero dei tre atomi coinvolti nel bending. Dunque: 1=1 α = (x 1, y 1, z 1, x 2, y 2, z 2, x 3, y 3, z 3 ) (1.18) Nella figura 1.1 r 12 r 13 è il prodotto scalare dei due vettori: r 12 = (r 2 r 1 ) = [(x 2 x 1 ), (y 2 y 1 ), (z 2 z 1 )] (1.19) r 13 = (r 3 r 2 ) = [(x 3 x 2 ), (y 3 y 2 ), (z 3 z 2 )] (1.20) 11

Figura 1.5: Classi di bending per la mini-proteina di Figura 1.1 cos α = r 12 r 13 r 12 r 13 Ricordiamo che il prodotto scalare tra due vettori a e b è definito dalle: a b = a x b x + a y b y + a z b z Dove a x, a y, a z sono le componenti x, y, e z del vettore a e b x, b y, b z sono le componenti x, y e z del vettore b. Nella Figura 1.1, con la notazione r 12 si indica il modulo o norma del vettore r 12 che va dall atomo 1 all atomo 2. Esso coincide con la distanza ordinaria (euclidea) tra l atomo 1 e l atomo 2, e cioè r 12 = [(x 2 x 1 ) 2 + (y 2 y 1 ) 2 + (z 1 z 2 ) 2 ] 1/2. Dunque in accordo alla formula riportata a destra nella figura 1.1 e sulla base delle definizioni di prodotto scalare e modulo abbiamo che l angolo di bending viene scritto 12

esplicitamente in termini delle 9 coordinate cartesiane dei tre atomi coinvolti come: cos α = α = arccos (x 2 x 1 )(x 3 x 1 ) + (y 2 y 1 )(y 3 y 1 ) + (z 1 z 2 )(z 3 z 1 ) (x2 x 1 ) 2 + (y 2 y 1 ) 2 + (z 1 z 2 ) 2 (x 3 x 1 ) 2 + (y 3 y 1 ) 2 + (z 3 z 1 ) 2 (x 2 x 1 )(x 3 x 1 ) + (y 2 y 1 )(y 3 y 1 ) + (z 1 z 2 )(z 3 z 1 ) (x2 x 1 ) 2 + (y 2 y 1 ) 2 + (z 1 z 2 ) 2 (x 3 x 1 ) 2 + (y 3 y 1 ) 2 + (z 3 z 1 ) 2 E veniamo ora all ultimo termine nell equazione 1.11, ovvero Questo termine è dato da: V tors ((r 1, r 2,..., r Np, α tors 1, α tors 2,..., α tors p ). V tors = 1 2 n tors k=1 V 0i (1 + cos(n i ϕ i γ i )) (1.21) Nell equazione 1.21, ϕ i è l angolo diedro per la torsione i-esima e dipende da 4 coordinate atomiche, mentre V 0, n i e γ 1 sono dei parametri il cui significato fisico (e valore) dipende dall ibridazione degli atomi coinvolti. La sommatoria 1.21 e di nuovo estesa a tutte le possibili N tors torsioni che si possono contare nella nostra molecola. Tali torsioni sono circa quattro/cinque volte il numero di atomi e dunque nel caso di Figure 1.1 esse sono circa 60. Per esempio in un sistema tipo etano si contano 9 possibili angoli diedri, cioè torsioni che sono definite da tutte le possibili quadruplette di atomi che le definiscono. ϕ è l angolo tra i piani definiti dagli atomi (punti) 1,2,3 e 2,3,4. Nelle figure a destra sto guardando le quadruplette lungo l asse di legame 2-3. ϕ si dice angolo diedro. Nella molecola di etano: posso definire 9 di queste quadruplette (vedi Figura 1.7). L angolo diedro φ dipende dalle coordinate cartesiane dei quattro atomi coinvolti secondo la Equazione: cos ϕ = (r 21 r 23 )(r 32 r 34 ) r 21 r 23 r 32 r 34 (1.22) dove (r 21 r 23 ) è il prodotto vettoriale del vettore che va dall atomo 1 all atomo 2 e del vettore che va dall atomo 2 all atomo 3. Il prodotto dei due vettori A e B dà luogo ad un vettore (A B) perpendicolare sia ad A che a B. Dunque il significato del prodotto 13

Figura 1.6: Angolo diedro: angolo fra i piani definito dagli atomi 1,2,3 e 2,3,4 (tratteggiato) r 21 r 23 e quello della normale al piano 1,2,3. Il senso o verso di A B si ottiene applicando la cosiddetta regola della mano destra (vedi Figura 1.8). Nota che in accordo alla definizione 1.22, si ottiene che, nel caso in cui tutti gli atomi 2,3,4 stessero su uno stesso piano con 1 e 4 in posizione cis, l angolo diedro corrispondente a questa configurazione sarebbe pari a zero. Quando 1 e 4 stanno su uno stesso piano ma Figura 1.7: Possibili torsioni nella molecola di etano. 14

Figura 1.8: Regola della mano destra per il prodotto vettoriale A B. in posizione trans l angolo diedro è pari a 180 (cos ϕ = 1). Nella equazione 4.21 per r 21 intendiamo il vettore che va da 2 a 1 e cioè r 21 = r 1 r 2 = (x 1 x 2 ), (y 1 y 2 ), (z 1 z 2 ) e analogamente per gli altri 4 vettori. Il prodotto vettoriale a b è definito dall equazione: i j k a b = det a x a y a z = i(a y b z a z b y ) + j(a z b x a x b z ) + k(a x b y a y b z x) (1.23) a x a y a z Dove i (1, 0, 0), j (0, 1, 0), k (0, 0, 1),sono rispettivamente i versori lungo x, y e z (un versore è un vettore con lunghezza unitaria). Veniamo adesso al significato fisico dei parametri V 0i n i e γ i nell equazione 1.21. Vediamoli con un esempio: Nel caso delle torsioni che coinvolgano un legame centrale 23 ibridato sp3, abbiamo che n i = 3 e γ i = 0 mentre V 0i ha un valore nell ordine delle frazioni di kcal/mole. V 0i è infatti una energia e rappresenta, come vedremo, l altezza massima delle barriere torsionali energetiche tra configurazioni eclissata e sfalsata. In 15

Figura 1.9: Configurazioni cis (φ = 0) e trans (φ = 180 ) questo specifico caso la torsione relativa e data da (cfr Eq. 1.21) : V = 1 2 V 0(cos 3y + 1) (1.24) L andamento dell energia 1.24 in funzione dell angolo diedro è rappresentato in Figura 1.10, dove si riporta a titolo di esempio il potenziale torsionale della molecola di normalbutano attorno al legame C2-C3. I massimi corrispondono alle configurazioni eclissate (sfavorite energeticamente) mentre i minimi corrispondono alle configurazioni sfalsate (favorite energeticamente). L altezza della barriera torsionale è tale che alle temperature ordinarie, essa viene agevolmente superata quando l ibridazione del legame centrale è sp3. Nel caso in cui l ibridazione sia sp2 noi abbiamo che n i = 2, γ i = 180 e V 0 e molto maggiore rispetto al caso sp3, ed e dell ordine di circa 2 kcal/mol. In questo caso il 16

Figura 1.10: Andamento dell energia torsionale per una torsione di tipo sp3 nella molecola di n-butano; N.B. I minimi e massimi non sono tutti alla stessa altezza come previsto dalla Eq. 1.24 per effetto del potenziale non-bonded(vedi sezione successiva) ed tra i gruppi metilici CH 3 potenziale torsionale e dato dalla V (ϕ) = 1 2 V 0[cos(2ϕ 180) + 1] (1.25) L andamento dell energia in funzione dell angolo è quella descritta in figura 1.11 In questo caso V 0 è l altezza della barriera energetica che separa le configurazioni cis e trans. Sulla base della Eq. 1.25 le configurazioni cis e trans sono iso-energetiche, cioè hanno la stessa energia. Il Potenziale torsionale (ed in generale il solo potenziale bonded o di valenza) non è in grado di differenziare energeticamente le configurazione cis e le trans. Come vedremo in seguito sarà l aggiunta del potenziale non bonded a quello di tipo bonded che differenzierà le due configurazioni cis e trans (o le configurazioni 17

Figura 1.11: Andamento dell energia torsionale per una torsione di tipo sp2 sfalsate ed eclissate nel caso dell ibridazione sp3 del legame torsionale). Riassumendo il potenziale bonded del mio sistema biologico è dato da: V bonded (r 1, r 2,..., r N, α b 1, α b 2,..., α b ρ) = 1 2 + 1 2 bendings 1=1 K (b) i (α α 0i ) 2 + 1 n tors 2 k=1 N strech i=1 K i (r i r oi ) 2 V 0i (i + cos(n i ϕ i γ i )) (1.26) dove le sommatorie sono estese a tutti i possibili stretching, bending e torsioni indipendentemente dalla loro appartenenza (farmaco, proteina o solvente): in altre parole possiamo sempre scrivere (nel caso dello stretching): stretch 1 K i (r i r 0i ) 2 = 1 2 2 i=1 + 1 2 stretch p i=1 stretch s i=1 K p i (rp i rp 0i )2 + 1 2 stretch f i=1 K f i (rf i rf 0i )2 K f i (rs i r s 0i) 2 (1.27) 18

Dove stretch p, stretch f, stretch s, sono rispettivamente i numeri di legami (o stretching) presenti sulla proteina, sul farmaco e sul solvente. Cioè il numero totale di stretching nel sistema si ottiene sommando gli stretching dei suoi componenti (farmaco e proteina e solvente). Nel caso in cui il solvente sia implicito l ultimo termine a destra nella Eq. 1.27 non compare. Considerazioni del tutto analoghe possono essere fatte per il potenziale complessivo di bending o torsionale. Chiudiamo questa sezione con una considerazione importante: la parte bonded del potenziale riferito al farmaco e alla proteina non subisce alcuna modifica se si usa o meno il solvente implicito. La parte che cambia a seconda del metodo usato per trattare il solvente è quella non bonded. Veniamo di seguito al potenziale non bonded nella equazione 1.8 relativa al potenziale proteina-proteina. 1.2 Potenziale non bonded L interazione non bonded tra atomi non direttamente legati o non coinvolti in bendings impedisce che le catene laterali in una proteina possano andare l una sull altra, oppure è responsabile della formazione dei ponti salini o dei legami ad idrogeno nella struttura secondaria. In altre parole, se il potenziale bonded mantiene inalterata la struttura primaria della proteina conservando l integrità dei legame, degli angoli e delle torsioni (la cui topologia resta invariata per tutte le possibili conformazioni del sistema), il potenziale non bonded determina la forma tridimensionale nello spazio di una proteina (molto più di quanto non accada in un farmaco che e quasi sempre una molecola relativamente rigida). Il potenziale non-bonded determina infatti la struttura secondaria e terziaria nella proteina. Questa affermazione si riferisce, come vedremo, al potenziale non-bonded totale e non al solo potenziale non bonded proteina-proteina che compare nella Eq. 1.8 Il bilancio delle interazioni non-bonded solvente-proteina è infatti responsabile della stabilità delle formazioni terziarie delle macromolecole. Prima di vedere tutto questo 19

veniamo alle definizioni del potenziale non-bonded per la sola proteina: V non bonded (r 1, r 2,..., r Np ) = N p 1 i=1 N p j=i+1 v (ij) i j > 3 (1.28) Il potenziale non-bonded è dato quindi dalla somma di termini di potenziale a coppia, che dipendono cioè dalla sola distanza r tra l i-esimo ed il j-esimo atomo del sistema. In una proteina ci sono N(N 1) 2 possibili coppie atomiche. Per esempio, riferendoci sempre al caso delle mini proteine di figura Figura 2., abbiamo 22 atomi e dunque 22 21/2 = 231 possibili coppie di atomi. Se indichiamo gli atomi con dei numeri interi da 1 a 22: Le possibili interazioni a coppie si ottengono considerando la parte superiore della matrice di interazione. Nella equazione 1.28 non vengono considerate le coppie che coinvolgono Figura 1.12: Matrice delle interazioni a coppia per il potenziale non bonded per la mini-proteina di Figura 1.1 20

atomi direttamente legati (stretching) oppure le coppie con atomi in posizione 13 in un bending. Dunque alle 23 coppie, occorre sottrarre le coppie relative agli stretching (che sono 21) e quelle relative ai bending (che sono 36) mentre si considerano tra le interazione non legate le coppie di atomi in posizione 14 nelle torsioni. Dunque le coppie totali nella equazione 1.28 per il caso della mini-proteina di 1.1 sono 231 21 36 = 174. L interazione non-bonded tra atomi legati (1-2) e atomi coinvolti in un bending (1-3) vengono escluse (vedi Figura 1.12). Veniamo ora alla forma della funzione v(r ij ) nella Eq. 1.28 relativa ad una coppia generica tra le 174 possibili tra atomi non legati nella nostra mini proteina. Tale funzione e data dalla somma di due termini, tale che V non bonded (r 1, r 2,..., r Np ) = ij v LJ (r ij ) + v el (r ij ) i j > 3 (1.29) in cui σij 12 v LJ (r ij ) = 4ε ij r ij σij r ij 6 (1.30) v el (r ij ) = q i q j 4πε 0 r ij (1.31) Nelle Eqs. 1.31, 1.30, 1.29 r ij è semplicemente la distanza relativa della coppia di atomi ij, ovvero: r ij = [(x i x j ) 2 + (y i y j ) 2 (z i z j ) 2 ] 1/2. r ij e la quantità che varia al variare delle disposizioni degli atomi nello spazio tridimensionale, ed è dunque lei la variabile della funzione v(r ij ). Le quantità δ ij e εij, q i e q j sono parametri del potenziale non-bonded, ovvero le quantità fisse α1 nb, α2 nb,..., αp nb nella definizione del force field non bonded: V non bonded = V (r 1, r 2,..., r N, α nb 1, α nb 2,..., α nb ρ ) (1.32) Il termine v LJ (r ij ) si dice potenziale di Lennard-Jones ed è responsabile delle interazioni idrofobiche, garantisce che le catene laterali non si compenetrino ed è per esempio responsabile della struttura di tipo stacking negli aggregati intermolecolari 21

(vedi il caso del DNA). Il potenziale di Lennard-Jones (equazione 1.30) è dato a sua volta della somma di due funzioni della distanza r ij, ma positiva e short-ranged (corto raggio) e l altra negativa (vedi Figura 1.13) Figura 1.13: Potenziale di interazione di Lennard-Jones A lunghe distanze prevale la parte negativa 4ε(σ/r) 6 mentre a corte distanze prevale la parte positiva 4ε(σ/r) 12. Il risultato complessivo della funzione V ij (r) è quello di un andamento a minimo (la linea solida nella Figura 1.13). Veniamo ora al significato fisico dei parametri. σ ij è pari al valore di r ij quando l energia vale 0, quando cioè il potenziale V(rj) intercetta l asse delle ascisse. Al minimo, la derivata del potenziale di Lennard-Jones vale 0. Dunque avremo che: [omettiamo per semplicità gli indici ij] 22

dv (r) dr = 0 = 4ε 0 σ 12 r 13 MIN 0 = 12σ12 6σ6 r 13 r 7 ( 12) σ6 ( 6) rmin 7 12σ 12 = 6σ 6 r 6 MIN r 6 MIN = 2σ 6 r MIN = 2 1 6 σ (1.33) Dunque le distanza alla quale il potenziale di Lennard-Jones assume il valore minimo (cioè quelle per le quali la derivata e nulla) è pari a r MIN = 2 1 6 σ. A questa distanza l energia vale: σ 12 v MIN = v(r MIN ) = 4ε 0 4σ σ6 12 2 σ 6 = 4ε 0 1 = ε 0 (1.34) 4 Ovvero ε 0 corrisponde al valore dell energia di Lennard-Jones al minimo. Questi parametri sono definiti, σ ed ε, su base atomica. In particolare σ è legato al raggio di Van-der-Waals. σ 12 = σ 1 + σ 2 (1.35) La 4.32 è la prima regola di combinazione per il potenziale di Lennard-Jones. seconda regola si ottiene dalla: La ε 12 = (ε 1 ε 2 ) 1/2 (1.36) L energia al minimo è legata alla polarizzabilità degli atomi che legata a sua volta al numero di elettroni presenti nel sistema. Il termine attrattivo nel potenziale di Lennard- Jones corrisponde ad una interazione dipolo-dipolo indotto. La nube elettronica dei due atomi si organizza in media in modo da allineare due dipoli di verso uguale in modo da minimizzare l energia elettrostatica di polarizzazione (vedi Figura 1.14). Sulla base 23

Figura 1.14: Origine delle forze attrattive di dispersione. Gli atomi di neon non hanno alcuna tendenza a formare un legame. I dipoli istantanei presenti sugli atomi producono un campo elettrico che induce un momento di dipolo sugli atomi vicini, generando delle forze attrattive. delle regole di combinazione?? 1.36 possiamo definire, per il potenziale non-bonded di Lennard-Jones delle classi atomiche. Sulla base della regola di combinazione 1.35, i parametri di coppia σ ij ed ε ij vengono definiti da quantità puramente atomiche tenendo conto del contesto chimico. Così per esempio: σ c = 1.6 e ε c = 0.2Kcal/mole per un atomo di carbonio ibridato sp3. I raggi di Van- der- Waals per gli atomi inseriti in una proteina dipendono come detto dal contesto chimico così come i parametri ε 0. Per esempio un idrogeno legato ad un ossigeno avrà un σ più piccolo di quello relativo ad un idrogeno legato ad un carbonio alifatico. Questo perché l H dell OH ha in media meno elettroni intorno a sé rispetto ad un atomo H legato ad un C (sp2) che è un atomo meno 24

elettronegativo di O. Nel caso della nostra mini proteina di 1.1 abbiamo una classe di H legata a C alifatici per quanto riguarda i parametri σ ed ε [in altre parole gli atomi 1, 2, 3, 10, 12, 13, 14, 20, 21 e 22 hanno tutti gli stessi σ ed ε], una classe di atomi C (sp3) [gli atomi 4, 9, 19 in Figura. 9b], una classe di atomi N [atomi 7, 17], una classe di atomi C (sp2) [atomi 5 e 15], una classe di idrogeni HN [atomi 8 e 18], una classe di atomi di ossigeno [atomi 6 e 16], per un totale di 5 classi per i paramatri atomici σ ed ε. Veniamo ora al potenziale elettrostatico (o coulombiano): Figura 1.15: Distribuzione di carica elettronica sulla molecola di acqua: la molecola ha attorno a se 10 elettroni (8 provenienti dall ossigeno e due dagli idrogeni), ma sull ossigeno vi sono in media circa 8.8 elettroni contro gli 0.6 elettroni presenti sugli idrogeni. Ciò conferisce all atomo di H una carica parziale di 0.4 e, ed all atomo di O una carica parziale di -0.8 e V el (r i j) = q iq j 4πε 0 r ij = 332 q iq j r ij (1.37) Di nuovo r ij è la variabile che dipende dalla 6 coordinate cartesiane degli atomi e q i e q j sono paramatri. ε 0 è la permittività dielettrica nel vuoto che vale circa 8 10 12 nel sistema SI (quello senza i coulomb!). q i e q j sono le cariche elettriche parziali presenti sugli atomi i e j. Tali cariche si originano a causa dalle differenze nelle elettronegatività 25

degli atomi. Per esempio nella molecola di acqua (vedi Figura 1.15), ci sono in media più elettroni sull ossigeno che non sugli idrogeni: L ossigeno nell acqua, a causa della sua maggiore elettronegatività, ha intorno a se in media circa 8.8 elettroni in luogo degli 8 dell atomo isolato, mentre gli idrogeni ne hanno in media 0.4 in luogo 1 dell atomo isolato. Il numero 332 e una costante di conversione, tale che V el risulta espressa in Kcal/mol se le cariche parziali sono espresse in elettroni e le distanze in Å. A titolo di esempio, l energia coulombiana o elettrostatica di una mole di legami ad idrogeno O H è data: V el = 0, 4 0.8 332 59 kcal/mole (1.38) 1, 8 che è in effetti elevatissima. Le energie elettrostatiche sono molto maggiori delle energie relative al potenziale di Lennard-Jones. Il potenziale V el (r ij ) è attrattivo e di segno negativo se le cariche sono di segno opposto e repulsivo e di segno positivo se le cariche sono dello stesso segno. Due atomi che si attraggono (ad esempio ossigeno ed idrogeno) e che non sono legati producono un andamento dell energia elettrostatica V el del tipo indicato in Figura.: Il potenziale di Lennard-Jones al minimo vale pochissimo rispetto all energia elettrostatica (vedi Figura 1.16). Tuttavia a corte distanze è il potenziale repulsivo di Lennard-Jones che prevale. Il minimo del potenziale somma V LJ + V el (linea tratteggiata in Figura 1.16) capita per distanze leggermente inferiori rispetto alla distanza del minimo del potenziale di Lennard-Jones. Il potenziale non-bonded del tipo 1.29 è il solo termine che contribuisce i termini misti V pf, v ps e V fs nell equazione 1.2. La forma funzionale dell energia è dunque: 26

40 Coulomb Energy Lennard-Jones Energy Total Energy 20 Energy (kcal mol -1 ) 0-20 -40 2.4 2.8 3.2 3.6 4 4.4 4.8 5.2 5.6 6 Distance (Angstroem) Figura 1.16: interazione O...H Energia Coulombiana ed Energia di dispersione-repulsione per una V (r 1, r 2,..., r N ) = Vp bonded (r 1, r 2,..., r Np ) + Vp non bonded (r 1, r 2,..., r Np ) + + Vf bonded (r 1, r 2,..., r Nf ) + Vp non bonded (r 1, r 2,..., r Nf ) + + N p N f i=1 N p N s N s v pf (r ij ) + + v ps (r ij ) + v fs (r ij ) j=1 N s N s i=1 v(r ij ) + j=1 i=1 N MOL (solv) i=1 j=1 N f i=1 j=1 V bonded s (r i 1, r i 2,...r Ns ) (1.39) I primi quattro termini si riferiscono all energia bonded e non-bonded del farmaco e proteina. Il quinto termine è l interazione non-bonded farmaco-proteina (costruita attraverso l assegnazione delle classi atomiche e le regole di combinazione 1.35 e 1.36 per 27

la parte Lennard-Jones). Il sesto termine è l interazione non-bonded proteina-solvente (se esplicito). Il settimo termine è l interazione non-bonded farmaco-solvente (se esplicito). L ottavo termine è l interazione non-bonded solvente-solvente (sempre costruita con le regole di combinazione atomo-atomo 1.35 e 1.36) e il nono termine è l interazione bonded del solvente del tipo: (nel caso in cui questo fosse acqua). V bonded solv = + + N MOL i=1 N MOL i=1 1 2 K OH(r i,1 r 0 ) 2 + 1 2 K OH(r i,2 r 0 ) 2 K HOH (α i α 0 ) 2 (1.40) Dove r 0 = r 0 OH = 1Å e α 0 = α HOH = 105 sono rispettivamente la distanza intramolecolare OH e l angolo di bending di equilibrio e con r i,1, r i,2 si indicano le distanze effettive delle lunghezze dei due legami O-H nella molecola i-esima. Una volta assegnati tutti i paramatri del force field, ovvero stabiliti i valori delle costanti k, r 0, α 0, V t 0, µ, γ, σ, ε e q per tutte le classi presenti nel sistema, siamo in grado dalla espressione generale 1.39 di calcolare il valore dell energia del sistema per qualunque configurazione degli atomi che lo compongono, ovvero per qualunque set di 3N (con N = N p +N f +N s ) coordinate cartesiane che definiscono il sistema complessivo proteina, farmaco, solvente. 28