Segnali post-inserzionali

Segnali post-inserzionali Ritenzione nel R.E. KDEL C-term RDEL KEEL Individuazione di recettori per KDEL tramite anticorpi di Seconda generazione

Recupero di proteine localizzate nel reticolo endoplasmatico

Mannosio con gruppo fosfato su carbonio in posizione 6 fosfotransferasi Una acetilglucosammina viene trasferita da un trasportatore UDP al C in posizione 6 di un mannosio che fa parte del gruppo glucidico di un enzima lisosomiale fosfodiesterasi Segnale per Lisosomi

Trasporto Passivo ed Attivo Complessi del Poro Nucleare (30-50 differenti nucleoporin Permette un grosso flusso Ø 25 nm (Fatt. Trascr., Complessi multisubunità, Ribonucleoprotein

Translocazione nei mitocondri Necessità differenza di potenzia e ATP e chaperone che mantien Proteina in stato non ripiegato

Inserzione nello spazio intermembrana Classe I : proteine con presequenza bipartitica ( idropatica +idrofobica) esempio : citocromo b2 Classe II : proteine che sono intrappolate in IMS per ripiegamento facilitato per interazione con cofattori esempio Sod1 con CCS Classe III: proteine che rimangono intrappolate per interazione con proteine di membrana di IM

TIBS 1995,20, 65-69

Quattro subunità ognuna 17500 Lega proteine denaturate con alta affinità (Kd circa nm ) ma bassa per prot. stato nativo Lega peptidi piccoli e carichi e successivamente peptidi idrofobici

Modificazioni post-traduzionali

Il processamento proteolitico Taglio proteolitico di frammenti peptidici -frequente in proteine destinate a compartimenti specifici Ormoni peptidici usualmente sintetizzati come precursori molto lunghi così come molte proteine virali che vengono poi proteolizzate in singole proteine Il precursore è chiamato proproteina Alcune sono sintetizzate come pre-proproteine ( precursore con sequenza all N-terminale) Esempio albumina è sintetizzata come preproalbumina

Il processamento proteolitico Gli enzimi digestivi dei mammiferi, come la tripsina, la chimotripsina, la pepsina, sono sintetizzati nel pancreas come zimogeni inattivi ovvero come tripsinogeno, chimotripsinogeno e pepsinogeno. devono essere secreti, sono sintetizzati come prezimogeno. la secrezione avviene dopo la rimozione della sequenza al Nterminale ma rimane sotto forma di zimogeno. L attivazione avviene dopo la secrezione ed avviene in seguito all azione proteolitica di proteasi specifiche. Il tripsinogeno ad esempio deve essere proteolizzato da un enterochinasi che non viene sintetizzata nel pancreas ma nella mucosa duodenale così che il tripsinogeno può essere attivato a tripsina quando le proteine vengono ad essere secrete prevenendo la formazione prematura della tripsina.

Processamento proteolitico avviene anche per molti ormoni Insulina matura 51 aminoacidi degli originali 110 Il taglio avviene dopo che il propeptide ha raggiunto il Golgi La ragione è legata sia alla dimensione necessaria per essere translocato sia alla regolazione o per ripiegamento (insulina)

AGGIuNTA DI GRUPPI LIPIDICI Miristoilazione ( spesso chinasi e fosfatasi) Gly N-terminale nel citoplasma Gly-small-X-X-small- (Gly N-terminale) C-terminale farnesile e geranilgeranile nel RE Avviene su S di cisteina di sequenza CAAAX i gruppi terminali rimossi e carbossilico metilato ( RAS ) Palmitico su cisteina in prossimità di segmento transmembrana avviene in più compartimenti

C-terminale glicosil fosfatidil inositolo proteine sul lato extracellulare ( C-term )

3.4 Anchoring of integral proteins to the plasma membrane by hydrocarbon chains " Figure 3-36!

Modificazione con acido miristico non permette un ancoraggio stabile sulla membrana CH 2 ΔG 0.8 Kcal/mol ΔG per 10 CH 2 8 Kcal/mol Ka=10 4 M -1 Un peptide miristoilato si lega ad una vescicola lipidica neutra con una differenza di energia libera pari a ΔG ~ - 8 kcal/mole

Necessità fattore aggiuntivo Il fattore addizionaler è elettrostatico l associazione del peptide MARCKS, substrato della chinasi c, dopo miristoilazione con il - doppio strato lipidico aumenta: 1) aumentando il contenuto di lipidi acidi nella membrana; 2) aumentando il numero di residui basici nel peptide; 3) abbassando la forza ionica; 4) è indipendente dalla natura chimica sia dei residui basici che dei lipidi acidi.

L associazione al doppio strato può quindi essere Modulata variando la carica del peptide attraverso processi di fosforilazione e defosforilazione La costante di associazione per un peptide non miristoilato con un doppio strato contenente il 33% di lipidi acidi assume un valore di K = 103 M -1, mentre nel peptide miristoilato essa risulta essere K = 10 7 M -1,

Convenienza confinamento spaziale cellula R=10µm calotta spessore d=10nm 4/3πr 3 /4πr 2 d=r/3d=10-5 /10-8 = 1000 aumenta concentrazione relativa

Glicosilazione Proprietà gruppi glucidici 1. Struttura variabile => specificità interazione con altre macromolecole 2. Natura idrofilica => alta solubilità 3. Compattezza => perturbazione della superficie proteica N-glicosilazione N di Asn Cotraduzionale, appena Asn appare nel R.E. successivamente può proseguire nel Golgi O-glicosilazione OH di Ser e Thr Post-traduzionale, nel Golgi

Gli oligosaccaridi legati in N hanno in comune un nucleo pentasaccaridico tre res di mannosio due di N-acetilglucosammina Sequenza Asn-X-Ser Asn-X-Thr

Analogo di uridina difosfato-n-acetilglucosammina N-glicosilazione avviene nel reticolo endoplasmatico per trasferi mento di un oligosaccaride preassemblato sul dolicolo fosfato

Nel RE per trasferimento di un oligosaccaride preassemblato sul dolicolo fosfato 1) Aggiunta a dolicolo fosfato di 2acetilglucosammina e 5mannosio 2) Capovolgimento dal citoplasma al RE 3) Aggiunta di ulteriori gruppi ( 14 unità di cui tre di glucosio)

Il controllo di qualità da parte di calnessina e calreticulina

Calnessina 65 kda 573 aa 89 aa citosolici fosforilati Calreticulina 46 kda 400 aa solubile Capaci di legarsi a Proteine glicosilate ancora non ripiegate correttamente Calnessine - A, B, C e D indicano 4 domini che hanno una buona omologia Di sequenza con la proteina del ER Calreticolina ER-retention motif (-RKPRRE) Calreticolina - 46 kda - solubile - KDEL

Glicosidasi I prot membrana 92 kda Glicosidasi II solubile eterodimero 104 kda sito attivo 58 kda segnale di ritenzione Glicosiltransferasi solubile 170 kda riconosce proteine non-native come substrato Finchè la proteina non è ripiegata è riglicosilata da transferasi ed è legata da calnessina