Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito Ricerca di Micosi Superficiali in Campioni Dermatologici Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE Batteriologia I B 39 I Emissione no: 2.2 I Data emissione: 21.05.14 I Pagina 1 di 26 Crown copyright 2014

Ringraziamenti Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web http://www.hpa.org.uk/smi/partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare http://www.hpa.org.uk/smi/workinggroups). Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Publiv Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ E-mail: standards@phe.gov.uk Website: http://www.hpa.org.uk/smi Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 2 di 26

Contenuti RINGRAZIAMENTI... 2 TABELLA MODIFICHE... 4 SMI DEL RU: SCOPO E OBIETTIVO... 6 SCOPO DEL DOCUMENTO... 8 SCOPO... 8 INTRODUZIONE... 8 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI... 11 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA... 14 2 PRELIEVO DEL CAMPIONE... 14 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE... 15 4 PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE... 16 8 PROCEDURA DI REFERTAZIONE... 22 9 NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE... 24 BIBLIOGRAFIA... 25 NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation. Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 3 di 26

Tabella delle Modifiche Ricerca di Micosi Superficiali in Campioni Dermatologici Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail: standards@phe.gov.uk I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica No/Data. 3/21.05.14 Emissione eliminata. no 2.1 Emissione inserita no. 2.2 Sezione(i) interessate/pagina no. Documento intero. Modifica. Il documento è stato inserito in un nuovo formato che evidenzia il passaggio della Health Protection Agency alla Public Health England. Prima pagina ridisegnata. Rinominata la pagina di Stato come Scopo e Obiettivo ed aggiornata in modo appropriato. I loghi delle organizzazioni professionali sono stati revisionati ed aggiornati. La bibliografia degli standard di sicurezza enotifica è stata revisionata ed aggiornata. Il contenuto scientifico rimane invariato. Modifica No/Data. 2/01.08.12 Emissione eliminata. no 2 Emissione inserita no. 2.1 Sezione(i) interessate. Modifica. Documento presentato in nuovo formato. Documento intero. Il termine '' contenitore a tenuta ermetica con marchiatura CE sostituisce quello di contenitore impermeabile sterile '' (ove appropriato) e si riferisce al testo specifico nell ambito della Direttiva UE per Dispositivi Medico-Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) e alla direttiva stessa EC 1,2. Edito per chiarezza Riorganizzazione di parte del testo. Piccole modifiche del testo. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 4 di 26

Sezioni su prelievo del campione, trasporto, conservazione e procedura Bibliografia Riorganizzate con cambio della numerazione precedente. Bibliografia in parte aggiornata Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 5 di 26

SMI del RU # : Scopo e Obiettivo Utilizzatori delle SMI Ricerca di Micosi Superficiali in Campioni Dermatologici Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione Informazioni di Base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova, la garanzia della qualità, la definizione dell'incertezza della determinazione. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo. Nel Regno Unito le SMI rappresentano strategie omogenee per le prove diagnostiche e la programmazione degli interventi di sanità pubblica Collaborazione Paritaria La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.l'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito http://www.hpa.org.uk/smi/partnershipshttp. L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Assicurazione di Qualità Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di # Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 6 di 26

attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti ell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del Paziente e della Comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza http://www.hpa.org.uk/webc/hpawebfile/hpaweb_c/1317133470313. I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato. Citazione Suggerita per questo Documento Public Health England. (2014). Investigation of Dermatological Specimens for Superficial Mycoses. UK Standards for Microbiology Investigations. B 39 Emissione 2.2.http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 7 di 26

Scopo del Documento Tipi di campione Cute, Unghia, Capello Scopo Questa SMI descrive le procedure per l isolamento di dermatofiti, muffe non dermatofitiche ed altri funghi da campioni cutanei, ungueali e capelli. Questa SMI deve essere usata congiuntamente alle altre SMI. Per la descrizione e le illustrazioni delle strutture osservabili al microscopio e/o nelle colture, fare riferimento ai testio al sito web Doctor Fungus sul sito web 3-6 http://www.doctorfungus.org/. Introduzione Dermatofiti 7 I dermatofiti possono essere suddivisi in tre gruppi: antropofili, zoofili, e geofili. I dermatofiti antropofili sono trasmessi da uomo a uomo e sono quelli di maggior riscontro nella comunità. Le infezioni zoofile, o acquisite da animali, sono solitamente sporadiche. Le infezioni da dermatofiti geofili sono spesso trasmesse per stretto contatto col terreno o da un animale infettatosi col terreno. L infezione è diagnosticata dal rilievo d ife fungine nei campioni di cute, capelli o di unghie. E comunque importante eseguire l esame colturale per determinare il genere e la specie dell agente infettante. Questa procedura consente di somministrare la terapia più appropriata e definire una traccia epidemiologica. Le infezioni da dermatofiti (altrimenti note come tricofizie) sono di solito refertate come tinea, seguita dal termine latino della sede corporea interessata. Le infezioni dermatofitiche più frequenti sono la tinea pedis dell adulto (piede d atleta) che può comprendere anche la tinea unguium (infezione ungueale), e la tinea capitis (tricofizia del cuoio capelluto) nei bambini. L infezione da dermatofiti è a sede cutanea, ristretta di solito agli strati cornei non vitali nei pazienti immunocompetenti. Ciò e dovuto al fatto che i funghi dermatofiti non sono generalmente in grado di invadere tessuti non sufficientemente cheratinizzati, (quali quelli profondi e le strutture degli organi). Le reazioni a queste infezioni possono variare da forme lievi a patologie gravi, condizionate da: risposta immunologica dell ospite, virulenza delle specie infettanti, sede dell infezione e fattori ambientali. Il gruppo dei funghi dermatofiti è classificato in tre generi: specie Epidermophyton, specie Microsporum e specie Trichophyton. Non Dermatofiti Sono note poche pocmuffe non dermatofitiche che possono infettare in modo diverso la cute, queste includono: Scytalidium dimidiatum, Scytalidium hyalinum (variante bianca di S. dimidiatum), Phaeoannellomyces werneckii e Piedraia hortae. Le muffe non-dermatofitiche, includenti quelle prima descritte, possono infettare unghie danneggiate da traumi, malattie o da pre-esistenti infezioni dermatofitiche. Sono note numerose muffe non dermatofitiche implicate nell infezione Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 8 di 26

delle unghie; l isolamento di una muffa da un campione ungueale deve essere segnalato solo se sono state osservate rigorose procedure; infatti questo tipo di materiale è frequentemente contaminato da spore. La frequenza delle muffe non dermatofitiche nella diagnosi di infezione delle unghie è inferiore al 5%. I campioni di unghia friabili sono più frequentemente positivi. Le specie Candida, in modo particolare C. parapsilosis, C. guilliermondii e C. albicans, sono state segnalate come causa importante di infezione ungueale. Scaglie cutanee sottili in sede toracica o dorsale suggeriscono la diagnosi di pytiriasis versicolor. La cute può essere un organo bersaglio per lo sviluppo d infezioni metastatiche di probabile origine ematogena, determinate da numerosi agenti fungini che causano micosi sistemiche negli ospiti immuno-compromessi (funghi filamentosi quali specie Aspergillus e Fusarium; specie Candida, Cryptococcus neoformans ecc). Talvolta funghi quali Sporothrix schenckii o C. neoformans possono penetrare nei tessuti per inoculo percutaneo e determinare localmente malattie invasive e talvolta sistemiche. Nei pazienti con trapianto renale, la criptococcosi e l infezione da HIV possono esordire con lesioni cutanee. Le ferite possono essere contaminate anche da muffe delle specie Aspergillus e Alternaria e da zigomiceti. Nella maggior parte dei casi la crescita del fungo sarà invasiva solo localmente, ma potrà determinare necrosi estesa dei tessuti. Occasionalmente si osservano pazienti con micosi primaria (invasiva, sistemica) nei quali l esordio è rappresentato da un infezione cutanea o mucosa (Paracoccidioides brasiliensis). Condizioni morbose quali istoplasmosi, blastomicosi, coccidioidomicosi, ed infezioni da Cladophialophora bantiana (già Xylohypha bantiana o Cladophialophora bantianum) e Penicillium marneffei possono pure esordire con manifestazioni di tipo cutaneo. Se la presenza di questi agenti infettivi è nota o ragionevolmente sospetta, i materiali clinici e le colture devono essere manipolati con attenzione in Condizioni di Contenimento 3. Manifestazioni Cliniche di Infezioni Superficiali Fungine 7 Tinea barbae L infezione della barba può manifestarsi in forma lieve o con grave follicolite pustolosa, che erroneamente può essere diagnosticata come infezione da Staphylococcus aureus. Tinea barbae è spesso associata a dermatofiti zoofili quali Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes e raramente a Trichophyton mentagrophytes var. erinacei: è stato isolato anche l antropofilo Trichophyton rubrum 8,9. Tinea capitis L infezione del cuoio capelluto è di solito causata da specie Microsporum o Trichophyton. L infezione può manifestare quadri clinici da lievi desquamazioni a reazioni infiammatorie gravi con follicolite, lesioni cicatriziali ed alopecia. Possono essere coinvolte la superficie cutanea ed i capelli. La sede delle spore fungine può assumere valore diagnostico per le specie infettanti. Le definizioni utilizzate sono: Ectotrix guaina di artroconidi (spore) formata all esterno del fusto del capello. Endothrix artroconidi contenuti all interno del fusto del capello. Ectoendotrix spore attorno ed all interno del fusto del capello. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 9 di 26

Favo Presenza di ife e spazi aerei all intero del fusto del capello. Tinea corporis Infezione nota come tricofizia del corpo può coinvolgere il tronco, le spalle e gli arti. L infezione può manifestare quadri clinici da forme lievi a gravi, presentando di solito lesioni squamose con bordi eritematosi vescicolari rilevati chiaramente definiti. Tinea cruris Le infezione delle pieghe inguinali e delle sedi perianale e perineale sono più frequenti nei maschi adulti. Trichophyton rubrum e Epidermophyton floccosum sono gli agenti eziologici di più frequente riscontro. Le lesioni sono da eritematose a marrone scuro ricoperte da scaglie sottili ed asciutte. Queste possono estendersi verso la parte interna della coscia e presentare un bordo rilevato, netto, talvolta con presenza di piccole vescicole. Tinea favosa (Favo) Determina una condizione patologica grave ad andamento cronico ed è la più comune in Africa ed Asia. Le tipiche croste (scutuli) si formano attorno ai follicoli di capelli infetti e sono costituite da detriti di materiale epiteliale e micelio. Questa manifestazione è di solito causata dal Trichophyton schoenleinii. Tinea imbricata Manifestazione ad andamento cronico, sostenuta dalla tinea corporis, riscontrata principalmente nelle Isole del Pacifico. Si manifesta con caratteristici anelli concentrici di scaglie sovrapposte. Agente eziologico unico, rappresentato dal Trichophyton concentricum. Tinea manuum Coinvolge i palmi e le aree interdigitali della mano. Si presenta di solito con ipercheratosi diffusa ed è comunemente causata dal T. rubrum e da altre specie di Trichophyton e Microsporum. Le mani possono divenire sede di infezioni da dermatofiti zoofili o geofili; lesioni di tipo infiammatorio possono coinvolgere dorso della mano e braccio. Tinea pedis (Piede d atleta) Sono interessate soprattutto le sindattilie e le piante dei piedi, in modo particolare, gli spazi interdigitali fra il quarto ed il quinto dito possono presentare macerazione, desquamazione e screpolature della pelle. Un altra forma clinica assume andamento cronico, aspetto squamoso con ipercheratosi a scaglie sottili di colore argento che ricopre aree rosate di pianta, calcagni e sedi laterali del piede. I più frequenti agenti causali della tinea pedis sono T. rubrum, T. mentagrophytes var. interdigitale ed E. floccosum. T. mentagrophytes causa un infiammazione acuta con presenza di vescicole, pustole e bolle. Tinea unguium / Onicomicosi La tinea unguium è stata di solito descritta come forma invasiva delle unghie causata da funghi dermatofiti; l infezione da non dermatofiti è stata classificata come onicomicosi. Il termine onicomicosi ha ora assunto una valenza generale e di conseguenza comprende ogni tipo di infezione fungina della sede ungueale 2. Sono noti quattro tipi di onicomicosi: Onicomicosi distale e laterale subungueale è la forma più frequente, causata di solito da T. rubrum. E caratterizzata dall invasione dell iponichio sotto il letto ungueale e dei lati dell unghia con successiva diffusione all intera struttura Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 10 di 26

Onicomicosi subungueale prossimale, nota come onicomicosi subungueale bianca, è relativamente infrequente ed anche questa è causata dal T. rubrum. Il microrganismo invade la cuticola. Questa manifestazione infettiva è la più frequente nei pazienti con HIV/AIDS Onicomicosi superficiale bianca, relativamente rara, è causata da funghi che invadono gli strati superiori dell unghia. Si presenta con isole bianche ben delimitate. L agente causale più frequente è T. mentagrophytes var. interdigitale. Spesso il coinvolgimento delle unghie delle dita è associato ad infezione da HIV Infezioni da specie Candida, più frequentemente causate da C. albicans. L infezione ungueale può iniziare in sede paranochiale e coinvolgere l unghia solo dopo interessamento del tessuto molle circostante. L infezione della parte distale dell unghia è associata alla malattia di Raynaud s Onicomicosi distrofica totale, rappresenta lo stadio terminale della malattia. Può essere conseguente a tutte e quattro le condizioni descritte in precedenza Consultare la Tabella 1 per l elenco di dermatofiti, muffe e lieviti che causano infezione dell unghia. Pytiriasis versicolor (tinea versicolor) 10 Infezione dello strato corneo da lieviti lipofili del complesso Malassezia furfur. Il coinvolgimento dei tessuti è modesto, la malattia è principalmente di pertinenza cosmetica e causa cambiamenti della pigmentazione cutanea. I microrganismi del complesso M. Furfur non crescono su terreni di routine per micologia e la diagnosi, solitamente clinica, si avvale dell ispezione visiva della cute e del rilievo microscopico su raschiamenti cutanei di cellule del lievito associate ad elementi miceliari corti, ricurvi, non ramificati. Informazione Tecnica/Limitazioni Limitazioni delle SMi del RU Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo Terreni Selettivi per Procedure di Screening I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti possono essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve pertanto essere ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di una piastra di terreno. Contenitori per Campioni 1,2 Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE per descrivere quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 11 di 26

rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a questi scopi''. Terreni Il Sabouraud (glucosio peptone) è il miglior terreno per l isolamento fungino di routine. Sono disponibili numerose preparazioni commerciali di tipo diverso, ciascuna capace di influenzare la morfologia finale delle colonie dei dermatofiti; è pertanto necessario che ogni laboratorio acquisisca competenze per riconoscere le diverse morfologie delle specie che si sviluppano sull agar in dotazione. Le piastre devono contenere terreno sufficiente a prevenire la disidratazione conseguente all incubazione prolungata. E particolarmente importante la presenza del cloramfenicolo per prevenire la crescita batterica. La cycloeximide inibisce lo sviluppo di muffe non dermatofite; non usare un terreno contenente questo composto se si sospetta la loro presenza. Incubazione I dermatofiti non si sviluppano a temperature superiori a 30 C; pertanto è importante che il termostato sia mantenuto a 28 C. L intervallo di tolleranza è compreso fra 26 C e 30 C 3. Per prevenire la contaminazione crociata e infestazioni da acari si consiglia di posizionare le piastre in un contenitore, ad esempio un sacchetto richiudibile, scatola di plastica, ecc. Trasporto del campione Sono disponibili alcune confezioni con marchio registrato da utilizzare per la raccolta ed il trasporto di campioni cutanei, ungueali e capelli. Tabella 1. Tipologia di campione in cui possono essere riscontrati dermatofiti, altre muffe e lieviti Tipi di campione/manifestazioni cliniche Funghi patogeni noti per essere comunemente associati ad infezione. Questo elenco non è esaustivo, altre specie fungine possono causare infezione Cute: Tinea barbae T. mentagropyhtes var. mentagrophytes, T. mentagropyhtes var erinacei, T. verrucosum, T. rubrum Tinea capitis M. audouinii, M. canis, T. mentagrophytes var. mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, T. soudanense, T. Violaceum Tinea corporis Può essere causata da qualsiasi dermatofita Tinea cruris T. rubrum, E. floccosum Tinea imbricata T. concentricum Tinea manuum T. rubrum, T. mentagrophytes var. mentagrophytes, T. erinacei, M. canis, M. persicolor Tinea pedis T. rubrum, T. mentagrophytes var. interdigitale, E. floccosum Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 12 di 26

Unghia: Tinea unguium/ onychomycosis T. rubrum, T. mentagrophytes var. interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes, E. floccosum (agenti della tinea capitis possono pure essere riscontrati nelle unghie delle dita in soggetti con infezione del cuoio capelluto) Specie Acremonium, specie Alternaria, specie Aspergillus, specie Fusarium, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium hyalinum, Scopulariopsis brevicaulis, Onychocola canadensis, Candida albicans, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. tropicalis Capello: Tinea favosa Tinea capitis Trichophyton schoenleinii M. canis, M. audoinii, T. tonsurans, T. soudanense, T. verrucosum, T. violaceum Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 13 di 26

1 Considerazioni sulla Sicurezza 1,2,11-25 1.1 Prelievo, Trasporto e Coservazione del Campione 1,2,11-14 Usare tecnica asettica Raccogliere i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marcatura CE e trasportarli in contenitori di plastica sigillati. Porre attenzione se per prelevare i campioni si usano bisturi con lame affilate o forbici. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni postali, di trasporto e di conservazione. 1.2 Procedura sul Campione 1,2,11-25 Livello di contenimento 2, Le procedure di laboratorio che possono generare aerosol infettiva devono essere condotte in cabina microbiologica di sicurezza 17. Se non si sospettano infezioni di microrganismi del Gruppo di Rischio 3, quali ad esempio Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Cladophialophora bantiana (in precedenza Xylohypha bantiana o Cladophialophora bantianum) o Penicillium marneffei; in questo caso le manipolazioni devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza in completo Contenimento di Livello 3. Com è noto, molti funghi sono dotati di componenti allergizzanti, si raccomanda pertanto di limitare la disseminazione delle spore. L idrossido di potassio (KOH) al 10% 30% usato per l esame microscopico dei campioni dermatologici ha effetti corrosivi. Si utilizza KOH per dissolvere lentamente il campione liberando le cellule fungine Nota: In letteratura sono descritte diverse concentrazioni di KOH comprese fra il 10% ed il 30. Se si utilizzano concentrazioni fra il 10% ed il 15%, i campioni richiederanno più tempo per essere digeriti, il 30% è molto corrosivo. I laboratori devono continuare ad utilizzare la concentrazione che ritiengono più appropriata. Fare riferimento alla linea guida corrente sulla sicurezza delle manipolazioni di tutti i microrganismi presentati in questa SMI. Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio 2 Prelievo del campione 2.1 Tipo di Campione Cute, Unghia, Capello. 2.2 Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo 26 Per considerazioni sulla Sicurezza fare riferimento allla Sezione 1.1 Prelevare i campioni prima della terapia antimicrobica se possibile. I campioni devono essere inseriti in un contenitore robusto di carta, chiuso, posto in contenitore di plastica o confezione commerciale specificamente predisposta per la raccolta ed il trasporto di materiale cutaneo, unghie e capelli. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 14 di 26

Se è possibile ottenere un raschiamento cutaneo, pressare sulla lesione un nastro adesivo pulito, prelevare e trasferire il materiale su vetrino con la superficie del nastro rivolta verso il basso. Trasportare in laboratorio in appropriato contenitore porta vetrini. Raschiamenti cutanei e capelli prelevati con strappo sono i materiali d elezione per la diagnosi di infezione del cuoio capelluto, ma per la raccolta dei campioni, si può utilizzare anche uno spazzolino da denti sterile monouso. Questi materiali devono essere trasportati in laboratorio inseriti in contenitore di plastica sterile. I capelli, se di lunghezza sufficiente, devono essere strappati con pinze, avvolti in foglio di carta nero o inseriti in confezioni commerciali con le scaglie cutanee. Cute Prima del prelievo del campione cute ed unghie dei pazienti possono essere tamponate con alcol 70%; questa procedura è particolarmente importante se sono state applicate creme, lozioni o prodotti in polvere. I margini delle lesioni cutanee forniscono la maggior quantità di elementi fungini vitali. Le lesioni devono essere raschiate con bisturi a lama smussata. Se con il raschiamento si ottiene materiale insufficiente, pressare sulla lesione un nastro adesivo e trasferirlo su vetrino pulito per il successivo trasporto in laboratorio ( prelievo per asportazione ). Unghie Campioni d unghia di buona qualità sono difficili da prelevare. Specificare se il campione proviene da unghie della mano o del piede. Prelevare il materiale da unghie che hanno perso colorazione, o sono distrofiche o da parti residue. Le unghie coinvolte devono essere recise il più distante possibile per il loro intero spessore e devono includere ogni tipo di materiale a consistenza ridotta. Possono essere utili sonde perforanti le unghie, bisturi e dispositivi per sollevamento ed è richiesta la loro sterilizzazione fra un paziente e l altro. Se si manifesta interessamento di tipo superficiale (onicomicosi superficiale bianca) il materiale ungueale può essere raccolto per raschiamento. Campioni associati a lesioni cutanee sono presumibilmente infettati dallo stesso tipo di microrganismo e forniscono risultati colturali positivi con maggior frequenza. Capelli I campioni del cuoio capelluto devono includere frammenti cutanei e capelli strappati o loro radici. Per l esame diretto i capelli recisi non sono appropriati perché di solito le aree infette sono adiacenti alla superficie del cuoio capelluto. In presenza di scarsa desquamazione evidente, e se i campioni prelevati per un esame diretto non sono in grado di sostituire quelli da raschiamento, raccogliere il campione per l esame colturale del cuoio capelluto con spazzole di plastica, dispositivi per massaggio o spazzolini da denti di plastica. 2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni 26 Numero e la frequenza dei campioni prelevati dipendono dalle condizioni cliniche del paziente. 3 Trasporto e Conservazione del Campione 1,2 3.1 Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla sezione 1.1. I campioni devono essere conservati a temperatura ambiente, e trasportati e processati il più presto possibile 26. I campioni devono essere disidratati e mantenuti a temperatura ambiente. Verificare che i campioni siano mantenuti disidratati, i funghi rimangono vitali per alcuni mesi. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 15 di 26

4 Processo/Procedura sul Campione 1,2 4.1 Selezione della prova Selezionare una parte significativa di campione per l esame microscopico e colturale. 4.2 Aspetto N/D 4.3 Preparazione del Campione Per considerazioni sula sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.2. 4.4 Microscopia 4.4.1 Standard Campioni cutanei Tagliare in piccoli frammenti (1-2 mm) ed inserirne 5 o 6 in una goccia di idrossido di potassio al 10% - 30% (KOH) posta su vetrino da microscopio. Coprire con coprioggetto ed attendere 15 20 minuti a temperatura ambiente. Se il materiale è insufficiente per l esame microscopico e quello colturale, privilegiare l esame microscopico, salvo il caso in cui il clinico l abbia eseguito in precedenza. Segnalare sul modulo di richiesta l insufficienza del materiale per l esecuzione dell esame colturale. Al termine della digestione del materiale cutaneo, premere sul coprioggetto per spremere i frammenti e renderli trasparenti; allontanare l eccesso di KOH. Esaminare tutti i vetrini con obiettivo 10x. L osservazione di ife fungine deve essere confermata con ingrandimento 40x. Le infezioni da dermatofiti presentano ife settate, ramificate, di diametro uniforme, che possono sviluppare catene di spore rettangolari (definite artrospore: queste originano dalla frammentazione delle ife). Se è utile, prendere nota della presenza di artrospore perché indicativa di infezione da dermatofiti. E importante ricordare che più del 35% di unghie infettate da dermatofiti non è in grado di sviluppare esami colturali positivi; per la diagnosi è pertanto di primaria importanza un accurato esame microscopico. Nei casi di pityriasis versicolor, il fungo appare come un conglomerato di cellule sferiche o semisferiche associate a corte ife non ramificate 10. Questo riscontro deve essere refertato come Esame microscopico compatibile per Tinea versicolor. Nei campioni cutanei ed ungueali le Candida presentano di solito aspetto ovale, con gemmazioni d aspetto lievitiforme a parete sottile, protrudenti da una base ristretta, associate a filamenti di vere o pseudoife. Talvolta si osservano solo cellule di lievito. Campioni ungueali Sminuzzare in piccoli frammenti (1-2 mm) o raschiare il materiale dalle superfici superiore ed inferiore dell unghia(e). Inserire 5 o 6 frammenti rappresentativi in una goccia di KOH al 10% - 30% su un vetrino da microscopio. Coprire con coprioggetto ed attendere almeno 30 minuti a temperatura ambiente per la digestione del campione. Se il campione è costituito da più di un frammento, usare alcuni di loro per l esame microscopico e gli altri per la coltura.. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 16 di 26

Osservare i vetrini con obiettivo 10x. La presenza di ife fungine deve essere confermata con ingrandimento 40x. La presenta di tipiche catene di spore rettangolari (definite artrospore, generate dalla frammentazione delle ife) è caratteristica per l infezione da dermatofita. Queste formazioni a catenelle non sono di solito presenti nelle altre infezioni causate da muffe che infettano le unghie; registrare pertanto questa importante osservazione che può aiutare a valutare l isolamento di una muffa non dermatofitica isolata successivamente. L esame microscopico diretto dei campioni ungueali non è in grado di differenziare i dermatofiti dagli altri tipi di muffe, ad eccezione di Scopulariopsis brevicaulis, i cui i tipici conidi a base piatta si possono formare in tasche aeree all interno dell unghia. Le muffe non dermatofitiche infettano solitamente unghie danneggiate da traumi, malate o con concomitanti infezioni da dermatofiti e rappresentano meno del 5% delle infezioni ungueali. Le muffe non dermatofitiche sono sensibili alla cycloheximide e per consentire la loro crescita i campioni positivi all esame microscopico devono essere seminati su agar Sabouraud destrosio con cloramfenicolo (SABC) e agar Sabouraud destrosio con cloramfenicolo e actidione (SABCA). Campioni di capelli Tagliare i capelli 5 mm sopra la radice e trasferire cinque o sei radici su un vetrino da microscopio immergendole in una goccia di KOH al 10% - 30%. Coprire con coprioggetto e lasciare rammollire per 20 minuti a temperatura ambiente. I capelli non devono essere schiacciati perché quelli infetti possono disgregarsi e perdere la caratteristica disposizione diagnostica delle artrospore. Se i capelli presentano caratteristiche d infezione, registrare le dimensioni delle artrospore e la loro disposizione seguendo le indicazioni della tabella 2. Tabella 2. Dimensione e disposizione delle artrospore Fungo Dimensione (µm) artrospore Disposizione Microsporum audouinii Piccola 2-5 Ectothrix Microsporum canis Piccola 2-5 Ectothrix Trichophyton mentagrophytes Piccola 3-5 Ectothrix Trichophyton erinacei Piccola 3-5 Ectothrix Trichophyton verrucosum Grande 5-10 Ectothrix Trichophyton tonsurans Grande 4-8 Endothrix Trichophyton violaceum Grande 4-8 Endothrix Trichophyton soudanense Grande 4-8 Endothrix Registrare le caratteristiche microscopiche sul modulo di richiesta. Depilazione cutanea 10 Applicare un nastro adesivo impermeabile trasparente sull area infetta, staccare ed appiccicarlo su vetrino sterile per l esame microscopico. Se la diagnosi clinica è 'tinea/pityriasis versicolor', rimuovere il nastro dal supporto e depositarlo su una goccia di cristal violetto all 1% distribuita su un vetrino da microscopio; lavare con acqua corrente dopo un minuto. Esaminare al microscopio. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 17 di 26

Nei casi di tinea/pityriasis versicolor, il fungo (specie Malassezia) appare corto, con ife non ramificate associate a lieviti commensali di Malassezia. 4.4.2 Tecniche supplementari specialistiche di colorazione La disponibilità di un microscopio a fluorescenza consente l uso di preparati, quali il bianco calcoflour o il blankophor, che possono migliorare la ricerca nei campioni cutanei, ungueali e capelli. Campioni cutanei e capelli Il calcofluor bianco (0.1%) può essere usato a temperatura ambiente in proporzioni uguali al KOH 10% - 30%: depositare il colorante sul materiale predisposto sul vetrino da microscopio e ricoprire con coprioggetto; lasciare digerireire per 20 minuti. Durante questo periodo proteggere dalla luce. A digestione avvenuta, esercitare pressione sul campione per formare uno strato singolo di cellule; esaminare con microscopio a fluorescenza con sorgente a 360-370 nm., la luce fluorescente emessa è blu-bianca. (oppure usare eccitazione ed emissione di luce secondo le indicazioni del produttore della strumentazione. Campioni ungueali E importante che i campioni ungueali siano rammolliti prima dell aggiunta di calcofluor bianco; in caso contrario il composto non penetra nel tessuto. Inserire pochi frammenti di unghie tagliate in una provetta di dimensioni ridotte, immergere in 10% - 30% di KOH e lasciare digerire per 30 min a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, rimuovere i frammenti d unghia dalla provetta con una pipetta, trasferirli sulla superficie di un vetrino, aggiungere una goccia di calcofluor, ricoprire con coprioggetto, esercitare pressione per formare uno strato sottile di cellule. Esaminare con microscopio a fluorescenza con sorgente a 360-370 nm. La luce fluorescente emessa è blubianca. Questo metodo di colorazione evidenzia una parte di tessuto cutaneo ed ungueale cui sono associate sole forme di lievito Malassezia. 4.5 Coltura e ricerca 4.5.1 Standard Cute Se dopo l esame microscopico è rimasto materiale sufficiente, trasferire circa 20 frammenti di cute su piastra di agar peptone glucosio (Sabouraud) addizionata con cycloheximide e cloramfenicolo. Se il materiale e di dimensioni ridotte, spargere sulla piastra di questo terreno tutto il materiale rimasto. Se il clinico segnala la possibilità di infezione da Scytalidium dimidiatum (Hendersonula toruloidea) il campione deve essere seminato su terreno privo di cicloeximide per consentire la crescita del microrganismo, che con la variante bianca di Scytalidium hyalinum, è l unica muffa non dermatofitica in grado di causare lesioni simil-dermatofitiche al palmo delle mano, pianta e sindattilie dei piedi). La Tinea nigra, causata dalla muffa Phaeoannellomyces werneckii, è una rara manifestazione che solitamente forma aree di pigmentazione nera sulla cute del palmo della mano ed è distinguibile clinicamente dalle lesioni dermatofitiche. Al microscopio si osservano ife settate di colore marrone scuro. Non essendo una muffa dermatofitica, i materiali per la coltura dei pazienti sospetti per infezione da tinea nigra devono essere seminati su terreno privo di cycloheximide. Incubare le piastre a 26 C - 30 C per 7-14 giorni, verificare la crescita settimanalmente. In caso di sviluppo di dermatofiti procedere all identificazione ed alla refertazione. Prima dell eliminazione, Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 18 di 26

le piastre devono essere incubate di nuovo a 26 C - 30 C per altre 3 settimane, oppure a temperatura ambiente (risparmio di spazio nel termostato), per confermare il dermatofita con l identificazione visiva. Le colture negative con esame microscopico positivo possono essere segnalate con referto anche dopo sette giorni, ma le piastre devono essere incubate di nuovo a 26 C - 30 C per un altra settimana ed esaminate a due settimane prima della loro eliminazione: deve essere emesso un referto modificato se si isola un dermatofita a lenta crescita. Se non si manifesta crescita dal materiale con esame microscopio positivo per fungo, controllare i frammenti di cute con microscopio per la lettura delle piastre e verificare che non sia presente una lenta crescita di Trichophyton verrucosum (colonie a spillo); se un esame accurato non rivela alcuna crescita, inviare un referto preliminare. Eseguire altre colture su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e agar peptone glucosio con cloramfenicolo e cycloheximide, ed incubare di nuovo la piastra originale. Se è disponibile materiale per una sola piastra deve essere utilizzata la prima delle due indicate in precedenza. Se non è disponibile materiale deve essere emesso un referto finale adeguato. Unghia Seminare circa 20 frammenti rappresentativi sulla superficie di una piastra di agar glucosio peptone addizionato a cloramfenicolo e cicloeximide ed altri 20 su piastra di agar glucosio peptone addizionata solo con cloramfenicolo. Se non si dispone di quantità sufficiente di materiale per la seminana di entrambe le piastre, scegliere quella con cloramfenicolo e cicloeximide. Incubare le piastre 26 C - 30 per 7-14 giorni. Con controllo settimmanale. Se si sviluano dermatofiti, questi devono essere identificati e segnalati. Le piastre possono essere incubate di nuovo per altre tre settimane a temperatura ambiente, per controllare visivamente e confermare l identificazione dei dermatofiti, prima della ione elimina. Le colture negative possono essere refertate dopo 7 giorni, ma le piastre devono essere incubate di nuovo per un altra settimana ed esaminate dopo due settimane prima della loro eliminazione: se si isola un dermatofita a lenta crescita deve essere emesso un referto modificato. Se non si manifesta crescita da materiale con esame microscopio positivo per fungo, emettere un referto preliminare e predisporre colture successive su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e cicloeximide, incubare di nuovo la piastra originale. Se è disponibile materiale per una sola piastra deve essere utilizzata la prima delle due possibilità indicate in precedenza. Se non è disponibile materiale deve essere emesso un referto finale appropriato. Capelli Seminare le restanti radici dei capelli ed i frammenti di cute su una piastra di agar glucosio peptone addizionata con cloramfenicolo e cicloeximide. Incubare le piastre a 26 C - 30 C per 7-4 giorni controllando settimanalmente: se si sviluppa crescita di un dermatofita, procedere all identificazione e refertare. Prima della loro eliminazione, conservare le piastre a temperatura ambiente per tre settimane per confermare l identificazione con il controllo visivo. Le colture negative possono essere refertate dopo 7 giorni, ma incubare di nuovo le piastre per una settimana e controllare dopo due settimane prima di scartarle: deve essere emesso un referto modificato nel caso di isolamento di dermatofiti a lenta crescita. Se non si manifesta crescita dal materiale con esame microscopio positivo per fungo, controllare i frammenti di cute adesi ai capelli con microscopio per lettura di piastre e verificare che non sia presente una lenta crescita di Trichophyton verrucosum o di T. violaceum (colonie a spillo). Se un esame accurato non rileva sviluppo, inviare un referto preliminare e predisporre colture successive Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 19 di 26

su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e peptone glucosio con cloramfenicolo e cicloeximide, ed incubare di nuovo la piastra originale. Se è disponibile materiale per una sola piastra deve essere utilizzata la seconda delle due indicate in precedenza. Se non è disponibile materiale emettere un referto finale adeguato. Depilazioni Se si ricevano due campioni, staccarli dal vetrino da microscopio e trasferirne uno sulla superficie di un agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e l altro su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e cicloeximide. Se si riceve un solo campione, trasferirlo su piastra di agar addizionata con cloramfenicolo e cicloeximide. Incubare le piastre a 26 C - 30 C per 7-14 giorni; verificare la crescita settimanalmente, se si sviluppa un dermatofita identificarlo e refertare. Prima della loro eliminazione le piastre devono essere mantenute a temperatura ambiente per tre settimane per confermare l identificazione macroscopica. Le colture negative possono essere refertate dopo 7 giorni, ma le piastre devono essere incubate di nuovo per un altra settimana prima della loro eliminazione e devono essere ancora esaminate dopo due settimane dalla semina: emettere un referto modificato se si isolano dermatofiti a lenta crescita. Tutti i campioni Se dopo due settimane di incubazione si rende evidente una crescita, ma il fungo non può essere identificato, eseguire sottocoltura su una nuova piastra di agar peptone glucosio, agar lactritmel di Borelli, e/o agar Malto, e/o terreno di prova per dermatofiti (DTM); incubare tutte le colture per un altra settimana. Utilizzare una provetta con agar urea a becco di clarino per differenziare Trichophyton rubrum e Trichophyton interdigitale; i T. rubrum (fatta eccezione per la forma granulare) sono ureasi negativi. Se gli isolati non sono ancora identificabili, inviare il ceppo ad un Mycology Reference Laboratory. 4.5.2 Prove Supplementari E consigliato l uso di agar a becco di clarino perché riduce le possibilità di contaminazione da muffe ambientali; è inoltre importante seminare in coltura materiale sufficiente. Per l esame colturale di ogni campione seminare almeno due becchi di clarino con 20 frammenti rappresentativi di tessuto. In alternativa, sigillare le piastre con nastro adesivo idoneo. In assenza di particolari problemi di contaminazione aerea del laboratorio, queste misure possono non essere necessarie. La sterilizzazione a caldo dei supporti per piastre dopo il loro uso può ridurre la contaminazione. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 20 di 26

4.5.3 Terreni di coltura, condizioni e microrganismi Aspetti clinici/ Condizioni Terreni standard Incubazione Lettura colture Microrganismo(i) ricercati Temp C Atmosfera Tempo Dermatomicosi onocomicosi, infezione cuoio capelluto SABCA* 26-30 Aerobica 7-14 giorni microscopici negativi 7 21 giorni microscopici positivi 7-21 giorni secondo disponibilità Dermatofiti e lieviti Onicomicosi SABC** 26-30 Aerobica 7-14 giorni microscopici negativi 7 21 giorni microscopici positivi 7-21 giorni secondo disponibilità Dermatofiti, muffe e lieviti Terreni ottimali Incubazione Lettura colture Microrganismo(i) ricercati Temp C Atmosfera Tempo Malto 2% 26-30 Aerobica 7 e 14 giorni 7-14 giorni Favorisce la sporulazione delle muffe Lactritmel di Borrelli 26-30 Aerobica 7 e 14 giorni 7-14 giorni Favorisce la sporulazione dei dermatofiti Terreno per dermatofiti 26-30 Aerobica 4 e 7 giorni 4-7 giorni Favorisce la differenziazione dei dermatofiti; attenzione ad alcuni nondermatofiti che possono causare cambiamenti di colore Urea 22 26-30 Aerobica 4 e 7 giorni 4-7 giorni Utilizzato per differenziare T. rubrum (ureasi negativo) e T. interdigitale (ureasi positivo) Considerazione su altri microrganismi occasionalmente funghi non-dermatofiti causano micosi superficiali, più frequentemente nei campioni ungueali. Questi comprendono: specie Acremonium, specie Aspergillus, specie Candida, specie Chrysosporium, specie Fusarium, Scopulariopsis brevicaulis e specie Scytalidium. *Agar Sabouraud destrosio con cloramfenicolo e cycloheximide ** Agar Sabouraud destrosio con cloramfenicolo 4.6 Identificazione Per l identificazione dei microrganismi fare riferimento alle singole SMI. I microrganismi devono essere identificati a livello di specie e ciò consente di rilevare importanti informazioni epidemiologiche sulla rintracciabilità della sorgente dell infezione ed un aiuto per la scelta della terapia. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 21 di 26

4.7 Prova di Sensibilità agli Antimicrobici Fare riferimento alle linee guida.della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o EUCAST 4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico N/D 4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms. Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati laboratori di riferimento. Contattare l appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili, tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per invio del campione: Inghilterra e Galles http://www.hpa.org.uk/webw/hpaweb&page&hpawebautolistname/page/1158313434370?p=11 58313434370 Scozia http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx Irlanda del Nord http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection 5 Procedura di Refertazione 5.1 Microscopia I laboratori devono emettere un referto preliminare fornendo i risultati dell esame microscopico diretto dei campioni di tipo dermatologico. Refertare tutti i campioni inviati per la diagnosi di tinea/pityriasis versicolor precisando: esame microscopico compatibile per tinea versicolor ; seguirà referto finale. I referti devono essere emessi il più presto possibile dopo la conclusione dell esame microscopico. Nota: La diagnosi di pityriasis versicolor si avvale di particolari caratteristiche differenziali riscontrate con i rilievi microscopici. L agente eziologico, il lievito Malassezia furfur, non si sviluppa sull agar Sabouraud privo di supplemento lipidico 10. 5.1.1 Tempo di refertazione Microscopia Referto scritto: 24 48 ore. 5.2 Coltura Se l esame microscopico è negativo e non si sviluppa crescita evidente dopo una settimana d incubazione a 26 C 30 C, può essere emesso un referto finale, ma la coltura deve essere incubata di nuovo per un altra settimana. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 22 di 26

Se si sviluppa crescita dopo incubazione di una o due settimane, identificare il dermatofita ed emettere il referto finale. Le muffe non-dermatofitiche diverse da Scytalidium dimidiatum, Scytalidium hyalinum e Phaeoannellomyces werneckii di solito non sono patogene per il tessuto cutaneo. Occasionalmente possono essere isolate da lesioni cutanee muffe di specie Aspergillus, Fusarium, Scedosporium e Penicillium marneffei come risultato di un infezione disseminata o localizzata ad una ferita. Numerose altre muffe, particolarmente gli zigomiceti, possono causare infezione della ferita. Inviare un referto preliminare dopo una o due settimane se non si sviluppa crescita dal materiale seminato ed il fungo è stato riscontrato all esame microscopico. Se si dispone di materiale residuo sufficiente, eseguire nuove colture su agar glucosio peptone addizionato con cloramfenicolo e cycloheximide e/o agar glucosio peptone addizionato con solo cloramfenicolo. Se non si dispone di materiale sufficiente per un nuovo esame colturale, inviare il referto finale dell'esame microscopico, segnalando che il materiale è risultato insufficiente per ripetere la coltura. Isolamento di muffa non-dermatofitica dal tessuto ungueale L isolamento di una muffa non dermatofitica non è considerato significativo se l esame microscopico diretto ha dato esito negativo. Si deve in ogni modo considerare la possibilità di un nuovo tentativo di isolamento di un dermatofita se all esame microscopico sono state osservate catene di artroconidi, in quanto queste possono suggerire un infezione dermatofitica. Non considerare significativa e non segnalare nel referto la presenza di una muffa nondermatofitica in un campione nel quale è stato isolato un dermatofita. Se l esame microscopico diretto è positivo e non è stato isolato alcun dermatofita, ma si sono sviluppate 1-3 colonie della stessa muffa non-dermatofitica, queste non sono significative salvo che l isolato non sia lo Scopulariopsis brevicaulis e l osservazione microscopica sia compatibile con questo agente eziologico. Se l esame microscopico diretto è positivo e non è stato isolato alcun dermatofita, ma si riscontrano 4 o più colonie della stessa muffa non-dermatofitica in coltura pura, questa deve essere identificata ed il risultato refertato. Se ciò si verifica in assenza di un esame microscopico diretto positivo, si deve ripetere l esame microscopico. Se il suo esito è negativo, richiedere un nuovo campione. Isolamento di lieviti da campioni dermatologici I lieviti isolati non devono essere menzionati nel referto salvo che siano stati riscontrati all esame microscopico diretto, o l anamnesi del campione ungueale riveli specificamente una paranochia cronica e la coltura sviluppi crescita abbondante. 5.2.1 Tempo di refertazione delle colture Referto scritto dopo una, due o tre settimane specificando, se appropriato, che sarà emesso un referto successivo Telefonare risultati clinicamente urgenti quando disponibili. 5.3. Sensibilità agli Antimicrobici Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito. Si raccomanda di usare in modo prudente gli antimicrobici secondo i protocolli locali e nazionali Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 23 di 26

6 Notifica al PHE 28,29 o Equivalente 30-33 Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt Jakob disease CJD da includere nel Notification Duties of Registered Medical Practitioners, e non al Notification Duties of Diagnostic Laboratories. http://www.hpa.org.uk/topics/infectiousdiseases/infectionsaz/healthprotectionregulations/ Esistono accordi diversi in Scozia 30,31, Galles 32 e Irlanda del Nord 33.. Batteriologia B 39 Emissione no: 2.2 Data emissione: 21.05.14 Pagina: 24 di 26

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