KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A

KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A REF Da utilizzarsi con lo strumento LightCycler 2.0 (numeri di serie 1415001 e successivi) 03 610 195 001 Kit sufficiente per 32 reazioni per un massimo di 30 campioni Per uso diagnostico in vitro. NOTA IMPORTANTE: LE INFORMAZIONI RIGUARDANTI IL LOTTO SPECIFICO DEL KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A SONO RIPORTATE SUL RETRO DI QUESTO FOGLIO ILLUSTRATIVO, IN FORMA ALFANUMERICA O COME CODICE A BARRE. È OBBLIGATORIO IMMETTERE QUESTE INFORMAZIONI NEL SOFTWARE DELLO STRUMENTO LIGHTCYCLER 2.0. A QUESTO SCOPO, INSERIRE I DATI MANUALMENTE O UTILIZZARE IL LETTORE DI CODICI A BARRE NEL CORSO DEL FLUSSO DI LAVORO. PRIMA DI INSERIRE QUESTE INFORMAZIONI, È TUTTAVIA OPPORTUNO VERIFICARE CHE IL NUMERO DI LOTTO RIPORTATO SUL RETRO DEL FOGLIO ILLUSTRATIVO E IL NUMERO DI LOTTO PRESENTE SULLA SCATOLA DEL KIT SIANO IDENTICI. USO PREVISTO Il kit Factor II (Prothrombin) G20210A è indicato per la rivelazione e la genotipizzazione di una mutazione puntiforme (da G ad A nella posizione 20210) del gene del fattore II umano proveniente da DNA isolato da sangue periferico intero umano. Per l'esecuzione del test sullo strumento LightCycler 2.0 si utilizzano due tecniche: la prima, una reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR), amplifica il DNA del fattore II proveniente da campioni clinici; la seconda, l'ibridazione bersaglio-specifica con sonde fluorogeniche, consente di rivelare e genotipizzare il DNA del fattore II precedentemente amplificato. Il test Factor II (Prothrombin) G20210A è un esame diagnostico in vitro finalizzato alla rivelazione e alla genotipizzazione della mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A e utilizzato come strumento ausiliario per la diagnosi e la valutazione dei pazienti con sospetta trombofilia. Il test è stato concepito per essere utilizzato sullo strumento LightCycler 2.0 con il software LightCycler 4.05. I campioni devono essere preparati in base alle procedure di lavoro descritte di seguito. SPIEGAZIONE DEL TEST La trombofilia ereditaria predispone un soggetto ad eventi trombolici come la trombosi venosa, attualmente la terza patologia cardiovascolare più diffusa (1). La resistenza alla proteina C attivata (APC) è ritenuta l'anomalia della coagulazione che più comunemente appare associata alla trombosi venosa (1,2). Se un paziente risulta positivo alla mutazione del fattore V Leiden o alla resistenza alla proteina C attivata (APC), è consigliabile che si sottoponga a una serie di test di genetica molecolare per individuare le altre trombofilie più comuni con intersezione del fenotipo, per le quali esistono in commercio appositi test [ad esempio la variante Factor II (Prothrombin) G20210A] (2). È infatti dimostrato che la protrombina, presente nell'1-2% della popolazione, è coinvolta nella tromboembolia venosa (2). PRINCIPIO DEL TEST E DESCRIZIONE Preparazione dei campioni La preparazione dei campioni può avvenire manualmente o in modo automatizzato utilizzando High Pure PCR Template Preparation Kit o lo strumento MagNA Pure LC, sul quale viene eseguito MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Rivelazione 1. Un frammento di 165 bp (paia di basi) del gene del fattore II viene amplificato dal DNA genomico umano utilizzando primer specifici. 2. L'amplicone viene rivelato mediante fluorescenza utilizzando una coppia specifica di sonde H. Le sonde H sono costituite da due distinti oligonucleotidi che, durante la fase di "annealing" (appaiamento, riassociazione) del ciclo PCR, ibridano su una sequenza interna del frammento amplificato. Una sonda è marcata all'estremità 5' con LightCycler Red 640-NHS (rosso, estere dell'n-idrossisuccinimide 640) e, per evitare l'estensione, viene modificata all'estremità 3' mediante fosforilazione. L'altra sonda è marcata all'estremità 3' con fluoresceina. 3. Le due sonde vengono a trovarsi in stretta prossimità solo dopo l'ibridazione sul DNA templato, provocando un trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) tra i due fluorofori. Durante la fase FRET il fluoroforo donatore (donor), ovvero la fluoresceina, viene eccitato dalla sorgente di luce dello strumento LightCycler 2.0 e una parte dell'energia di eccitazione viene trasferita al fluoroforo ricevente (acceptor), ovvero l'estere LightCycler Red 640-NHS. 4. La fluorescenza emessa dall'estere LightCycler Red 640-NHS viene quindi misurata dallo strumento LightCycler 2.0. Genotipizzazione Le sonde H servono inoltre per determinare il genotipo. A questo scopo viene eseguita un'analisi della curva di melting al termine dei cicli di amplificazione, quando l'amplicone è presente in concentrazioni maggiori. Si assiste così all'ibridazione della sonda H marcata con Red 640 su una parte della sequenza bersaglio che non è mutata e funge da sonda di ancoraggio. La sonda H marcata con fluoresceina copre il sito di mutazione (sonda di mutazione). Durante l'analisi della curva di melting, l'aumento della temperatura provoca una diminuzione della fluorescenza in quanto la sonda più corta tra le due (la sonda di mutazione) si dissocia per prima e i due marcatori fluorescenti non si trovano più in stretta prossimità. Se la mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A è presente, l'assenza di complementarietà tra sonda di mutazione e bersaglio destabilizza l'ibrido, causando una diminuzione della fluorescenza a una temperatura più bassa. Con il genotipo wild type non si verifica questa assenza di complementarietà, pertanto il DNA eteroduplice avrà una temperatura di melting (T m ) più alta. Il genotipo eterozigote mostra un particolare insieme di proprietà. 1

REAGENTI SOLUZIONI DI LAVORO 1. FIIG20210A MD Mix [miscela di rivelazione per fattore II (Protrombina), mutazione G20210A] 1 78 µl 2. FIIG20210A R Mix [miscela di reazione per fattore II (Protrombina) G20210A] 1 78 µl 3. FIIG20210A CT [modello di controllo per fattore II (Protrombina) G20210A] 1 50 µl 4. FIIG20210A DIL [diluente per fattore II (Protrombina) G20210A] 1 1 ml <0,01% primer FIIG20210A forward e reverse <0,01% sonda H FIIG20210A marcata con Red 640 <0,01% sonda H FIIG20210A marcata con fluoresceina Tampone Tris-HCl <0,01% Taq DNA polimerasi (wt) <0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp <0,01% DNA templato di controllo contiene plasmide: pf2 WT e pf2 MUT Brij 35 MgCl 2 Brij 35 MgCl 2 H 2 O, grado PCR (utilizzata anche come controllo negativo per l'amplificazione) PRECAUZIONI E AVVERTENZE Polimorfismo Nell'ambito del gene del fattore II, oltre alla mutazione FIIG20210A esiste un'altra mutazione nota nella posizione 20218, denominata mutazione A20218G, che viene coperta dalla sonda di mutazione. Si tratta di una mutazione che, seppur rara, produce un risultato falso positivo dopo la genotipizzazione. Istruzioni per la manipolazione PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. Questo prodotto può essere manipolato esclusivamente da personale con adeguata conoscenza della tecnica PCR. Adottare le normali precauzioni previste per la manipolazione di tutti i reagenti di laboratorio. Questo test è idoneo all'uso con sangue intero umano raccolto solo con gli anticoagulanti EDTA o citrato. L'uso dell'eparina in questa procedura è sconsigliato, in quanto questo tipo di anticoagulante può interferire con la PCR. È necessario adottare un flusso di lavoro conforme alla Buona Prassi di Laboratorio (Good Laboratory Practices, GLP) che sia inoltre di tipo unidirezionale e preveda, ad esempio, una separazione fisica tra le varie fasi: preparazione dei campioni, configurazione della PCR, seduta PCR con LightCycler 2.0. Non utilizzare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto. Richiudere tutti i flaconi subito dopo l'uso, in modo da prevenire eventuali fuoriuscite di liquidi, alterazioni della concentrazione del tampone o variazioni delle condizioni del tampone. Dopo l'apertura, conservare i flaconi e le fiale in posizione verticale. Non mescolare reagenti di lotti diversi. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza. Evitare il contatto diretto tra la cute, gli occhi o le membrane mucose e il tampone legante/di lisi e il tampone di lavaggio I (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I) o il tampone di rimozione degli inibitori (High Pure PCR Template Preparation Kit). In caso di contatto accidentale, lavare immediatamente con abbondante acqua. Se non si interviene, vi è il rischio di ustioni. In caso di fuoriuscita del reagente, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare il contatto diretto tra soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) o soluzioni fortemente acide e il tampone legante/di lisi (MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I), che contiene tiocianato di guanidina. L'eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas altamente tossici. Procedure di laboratorio Considerare come potenzialmente infettivi tutti i materiali di origine umana e i materiali di scarto prodotti. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro con i disinfettanti consigliati dalle autorità locali. Evitare di mangiare, bere o fumare nell'area di lavoro del laboratorio. Non pipettare per bocca. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Durante il prelievo delle aliquote dai flaconi, evitare la contaminazione microbica o da nucleasi dei reagenti. Si consigliano pipette sterili di tipo monouso. Dopo la manipolazione dei campioni e dei reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani. Materiale di scarto Smaltire i reagenti inutilizzati e i rifiuti nel rispetto delle normative locali, regionali, nazionali e comunitarie vigenti. È possibile richiedere le schede di sicurezza dei prodotti (MSDS, Material Safety Data Sheets) alla sede Roche locale. Preparazione dei campioni Per informazioni sulla manipolazione e lo smaltimento dei campioni, fare riferimento alle istruzioni per la sicurezza fornite nel foglio illustrativo dei prodotti MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I e High Pure PCR Template Preparation Kit. Le confezioni di MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I e High Pure PCR Template Preparation Kit devono essere conservate a temperatura ambiente (tra +15 C e +25 C). Prima di utilizzare il tampone legante/di lisi appartenente al MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, agitare il flacone per sciogliere i precipitati. Non conservare a una temperatura inferiore a quella ambiente. Per lo svolgimento di questa procedura, utilizzare esclusivamente la tanica di reagente media MagNA Pure LC da 20 (nr. di catalogo 03 004 058 001) o la tanica di reagente grande MagNA Pure LC (nr. di catalogo 03 004 040 001) nelle posizioni loro assegnate dallo strumento MagNA Pure LC. Amplificazione e rivelazione Prima di utilizzare questo kit, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler 2.0 per uso IVD. Prendere nota della correlazione con l'id del rotore porta campioni LightCycler, registrando il nome associato a ciascun campione, la posizione sul rotore porta campioni LightCycler e il numero del capillare, in modo da assicurare una corretta identificazione dei campioni. Non toccare la superficie dei capillari. Per manipolare i capillari, indossare sempre i guanti. 2

MANIPOLAZIONE DEI REAGENTI 1. FIIG20210A MD Mix (tappo giallo, fiala 1), pronto per l'uso Conservare tra -15 C e -25 C. Tenere al riparo dalla luce. 2. FIIG20210A R Mix (tappo rosso, fiala 2), pronto per l'uso Conservare tra -15 C e -25 C. 3. FIIG20210A CT (tappo viola, fiala 3), pronto per l'uso Conservare tra -15 C e -25 C. 4. FIIG20210A DIL (tappo incolore, fiala 4), pronto per l'uso Conservare tra -15 C e -25 C. CONSERVAZIONE E STABILITÀ DEI REAGENTI Prima dell'apertura, il kit può essere conservato a una temperatura compresa tra -15 C e -25 C fino alla data di scadenza stampata sull'etichetta. Tenere il reagente FIIG20210A MD Mix (fiala 1, tappo giallo) al riparo dalla luce. Scongelare i componenti del kit Factor II (Prothrombin) G20210A, miscelare con cura e conservare in ghiaccio. Congelare subito dopo l'uso. I reagenti del kit possono essere congelati e scongelati al massimo cinque volte. RACCOLTA, PREPARAZIONE E STABILITÀ DEI CAMPIONI Per la preparazione del DNA genomico da sangue umano, eseguire la purificazione dell'acido nucleico con il prodotto High Pure PCR Template Preparation Kit (nr. di catalogo 11 796 828 001) oppure con il prodotto MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) sullo strumento MagNA Pure LC (nr. di catalogo 12 236 931 001), come descritto di seguito. Il sangue periferico umano raccolto con gli anticoagulanti EDTA o citrato è stabile per almeno 7 giorni a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C. Può essere conservato a -20 C per un massimo di 12 mesi e scongelato una sola volta. Il DNA eluito può essere conservato in una cartuccia per campioni sigillata oppure in provette Sarstedt con tappo avvitabile a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C per un massimo di 7 giorni. È stabile a lungo (3 settimane circa) se conservato a una temperatura compresa tra -15 C e -25 C. Il DNA eluito può essere congelato e scongelato al massimo tre volte. MATERIALI FORNITI Vedere "Reagenti soluzioni di lavoro" a pagina 2. MATERIALI E DISPOSITIVI NECESSARI MA NON FORNITI Strumento LightCycler 2.0 (nr. di cat. 03 531 414 201) Software LightCycler 4.05 (nr. di cat. 04 717 392 001) Capillari LightCycler (20 µl) (nr. di cat. 11 909 339 001) High Pure PCR Template Preparation Kit (nr. di cat. 11 796 828 001) Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, sterili, senza nucleasi Adattatori per centrifuga LightCycler (nr. di cat. 11 909 312 001) Lettore di codici a barre (nr. di cat. 04 557 174 001) Factor II (Prothrombin) G20210A Macro (nr. di cat. 04 586 930 001) Etanolo p.a. Isopropanolo p.a. MATERIALI OPZIONALI H 2 O, bidistillata, sterile e senza nucleasi Strumento MagNA Pure LC (nr. di cat. 12 236 931 001) Software MagNA Pure 3.03 o successivo (nr. di cat. 03 322 025 001) MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di cat. 03 003 990 001) Cestelli per Centrifuga per rotore porta campioni LC 2.0 plus [nr. di cat. 03 709 582 001 (230 V) o 03 709 507 001 (115 V)]. Se è già stata acquistata una Centrifuga per rotore porta campioni LC [nr. di cat. 12 189 682 001 (230 V) o 03 030 512 001 (115 V)], occorre procurarsi anche un Set rotori LightCycler 2.0 (nr. di cat. 03 724 697 001)*. Provette Sarstedt con tappo avvitabile, da 1,5 ml, sterili * Nel caso in cui non sia disponibile una Centrifuga per rotore porta campioni LC, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler 2.0, versione software 4.05 per uso diagnostico in vitro, oppure rivolgersi all'assistenza tecnica. CD contenente i protocolli di post-eluizione per trombofilia Etichette per codici a barre MagNA Pure LC (nr. di cat. 03 531 520 001) (nr. di cat. 04 378 784 001) Nastro per stampante di codici a barre MagNA Pure LC Lettore di codici a barre MagNA Pure LC, (nr. di cat. 03 531 520 001) modello Quick Scan 1000 (nr. di cat. 03 186 580 001) Blocco di raffreddamento MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC Stampante di codici a barre MagNA Pure LC, modello TLP 2844 (nr. di cat. 12 189 704 001) (nr. di cat. 03 576 094 001) Attrezzatura generale da laboratorio PROCEDURA DELL'ANALISI NOTA IMPORTANTE: LE INFORMAZIONI RIGUARDANTI IL LOTTO SPECIFICO DEL KIT FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A SONO RIPORTATE SUL RETRO DI QUESTO FOGLIO ILLUSTRATIVO, IN FORMA ALFANUMERICA O COME CODICE A BARRE. È OBBLIGATORIO IMMETTERE QUESTE INFORMAZIONI NEL SOFTWARE DELLO STRUMENTO LIGHTCYCLER 2.0. A QUESTO SCOPO, INSERIRE I DATI MANUALMENTE O UTILIZZARE IL LETTORE DI CODICI A BARRE NEL CORSO DEL FLUSSO DI LAVORO. PRIMA DI INSERIRE QUESTE INFORMAZIONI, È TUTTAVIA OPPORTUNO VERIFICARE CHE IL NUMERO DI LOTTO RIPORTATO SUL RETRO DEL FOGLIO ILLUSTRATIVO E IL NUMERO DI LOTTO PRESENTE SULLA SCATOLA DEL KIT SIANO IDENTICI. 3

➀ Procedura automatizzata per la preparazione di 15 o 30 campioni con il prodotto MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) e lo strumento MagNA Pure LC (nr. di catalogo 12 236 931 001) A. PURIFICAZIONE Operazioni preliminari Iniziare a preraffreddare il blocco MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC (nr. di catalogo 12 189 704 001) in frigorifero, a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C per almeno 2 ore. Accensione dello strumento e avvio del software MagNA Pure LC 1. Accendere lo strumento MagNA Pure LC e avviare il computer. 2. Avviare il software MagNA Pure LC e, nella schermata Main Menu, fare clic sul pulsante Sample Ordering. 3. Nella schermata Sample Ordering, selezionare il protocollo intitolato DNA I Blood Cells Fast e immettere i numeri dei lotti per MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) e per il kit Factor II (Prothrombin) G20210A, quindi immettere l'id del rotore porta campioni LightCycler (non modificare le altre impostazioni). 4. Immettere il controllo negativo (FIIG20210A DIL, fiala 4, tappo incolore) nella riga 1 della tabella relativa all'ordine dei campioni (posizione A1) digitando "Controllo Negativo". 5. Partendo dalla riga 1 (posizione B1), digitare i nomi dei campioni oppure utilizzare il lettore di codici a barre MagNA Pure LC (facoltativo). Specificare 50 µl per il volume del campione e 0 µl per il volume di diluizione (preimpostato). Il volume di eluizione è preimpostato su 100 µl. 6. Salvare e stampare le informazioni del file con l'ordine dei campioni. 7. Utilizzare la funzione Print Sample Names per stampare un elenco dei nomi dei campioni con le rispettive posizioni all'interno della cartuccia per campioni (facoltativo). 8. Stampare tre copie delle etichette Cartridge Barcode (facoltativo). 9. Apporre le etichette alla cartuccia per campioni (per l'eluizione) e alle stampe (facoltativo). 10. Fare clic su Stage Setup. Preparazione della soluzione di lavoro Proteinasi K (sufficiente per 32 campioni) 1. Aggiungere 3 ml di tampone di eluizione (flacone 6, tappo giallo) in una fiala di Proteinasi K liofilizzata (fiala 4, tappo rosa). Non appena la Proteinasi K sarà completamente sciolta, aggiungere altri 2 ml di tampone di eluizione per ottenere un volume finale di 5 ml. 2. Chiudere la fiala e miscelare con cura. Nota: se non viene utilizzata in giornata, la soluzione ricostituita deve essere conservata a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C nella fiala 4 (massimo 4 settimane). Tutti gli altri reagenti sono pronti per l'uso. Caricamento dei reagenti e dei dispositivi in plastica monouso Nota: Non utilizzare la tanica di reagente MagNA Pure LC da 30: con questa procedura è possibile utilizzare solo la tanica media MagNA Pure LC da 20 (nr. di catalogo 03 004 058 001) oppure la tanica grande MagNA Pure LC (nr. di catalogo 03 004 040 001) nelle posizioni loro assegnate dallo strumento MagNA Pure LC. Prima di riempire le taniche di reagente con la sospensione di particelle di vetro magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP), verificare che lo stato della Heat Unit e delle Cool Units 1 & 2 sia PASS. 1. Riempire manualmente le taniche di reagente (all'esterno dello strumento MagNA Pure LC) con i volumi indicati nella schermata Start Information (accanto al grafico Stage Layout), quindi richiuderle con gli appositi tappi e coperchi. Collocare le taniche piene di reagente nel rack del serbatoio per reagenti, rispettando le posizioni loro assegnate nella schermata Start Information (ad eccezione della sospensione MGP, vedere il passaggio 4). 2. Collocare gli altri dispositivi in plastica monouso nelle posizioni indicate e caricare il rack del serbatoio per reagenti sul piatto porta campioni/porta reagenti seguendo le indicazioni visualizzate nella schermata Start Information. 3. Trasferire manualmente 50 µl di campioni di sangue periferico intero umano risospeso con gli anticoagulanti EDTA o citrato direttamente nella cartuccia per campioni (all'esterno dello strumento MagNA Pure LC) seguendo l'ordine dei campioni indicato nell'elenco. 4. Un attimo prima di avviare la seduta, agitare accuratamente in vortex la fiala di vetro MGP, riempire una tanica di reagente con la sospensione MGP, richiuderla con l'apposito tappo e collocarla sul piatto porta campioni/porta reagenti dello strumento, nella posizione indicata nella schermata Start Information. 5. Collocare la cartuccia per campioni nello strumento MagNA Pure LC. Seduta di purificazione 1. Confermare tutte le posizioni caricate sullo strumento MagNA Pure LC facendo clic su ognuna di esse con il pulsante del mouse nella schermata Start Information. Quando tutte le posizioni saranno state confermate, comparirà il pulsante OK. 2. Rimuovere i tappi dei coperchi, quindi chiudere la barra della serratura e lo sportello dello strumento MagNA Pure LC. 3. Fare clic su OK per avviare la seduta. Verrà visualizzata la schermata Batch Status, mentre una linea viola si sposterà da sinistra a destra per indicare l'andamento della procedura di isolamento. 4. Al termine della seduta verrà visualizzata la schermata Result. 5. Salvare e stampare la schermata Result (facoltativo). 6. È possibile selezionare la funzione Open Post-Elution nel menu Action (facoltativo) oppure procedere con il passaggio B del Capitolo 2 ("Preparazione manuale dei campioni") del presente foglio illustrativo. 7. Se la procedura di estrazione MagNA Pure non può essere portata a termine per un campione (segnalato nella schermata Result), occorrerà ripetere l'estrazione per quel campione. Se non viene eseguita la funzione di post-eluizione, procedere con il passaggio B del Capitolo 2 ("Preparazione manuale dei campioni") del presente foglio illustrativo e utilizzare i campioni estratti o ri-estratti inizialmente. 4

B. POST-ELUIZIONE (facoltativa) Procedura di post-eluizione (facoltativa) 1. Assicurarsi che il blocco di raffreddamento MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC sia in posizione e sia stato preraffreddato (cioè lasciato in frigorifero a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C per almeno 2 ore). 2. Caricare il protocollo di post-eluizione intitolato Thrombophilia 15 or 30 samples dal CD contenente i protocolli di post-eluizione per trombofilia (nr. di catalogo 04 378 784 001) (facoltativo). 3. Preparazione del Master Mix (solo per la procedura di post-eluizione) Preparare solo la quantità necessaria immediatamente prima dell'uso. Scongelare i componenti del kit Factor II (Prothrombin) G20210A, miscelare con cura e conservare in ghiaccio. Collocare nel rotore porta campioni LightCycler un capillare LightCycler per ogni campione di DNA e uno per ogni controllo (in tutto 17 capillari per 15 campioni oppure 32 capillari per 30 campioni). Preparare il Master Mix: Passaggio Operazione 1 In una provetta Sarstedt con tappo avvitabile da 1,5 ml, su ghiaccio, aggiungere i seguenti componenti nell'ordine indicato (esempi per 15 o 30 campioni): Reagenti soluzioni di lavoro Volume* / 15 campioni Volume* / 30 campioni FIIG20210A DIL, fiala 4 209 µl 396 µl FIIG20210A MD Mix, fiala 1 38 µl 72 µl FIIG20210A R Mix, fiala 2 38 µl 72 µl Volume totale 285 µl 540 µl * i volumi indicati comprendono controlli e margini di pipettamento 2 Miscelare con delicatezza. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nella punta della provetta. 3 Collocare la provetta contenente il Master Mix sul blocco di raffreddamento MagNA Pure LC, nella posizione 1. Rimuovere il tappo del coperchio. 4. Collocare il rotore porta campioni LightCycler, con i capillari indicati dal protocollo di post-eluizione, sul blocco di raffreddamento e caricare sul piatto dello strumento MagNA Pure LC il numero di puntali per pipette indicato nella schermata. 5. Aprire il reagente FIIG20210A CT (fiala 3, tappo viola), pipettarne 25 µl in una nuova provetta Sarstedt con tappo avvitabile da 1,5 ml, quindi collocare quest'ultima sul blocco di raffreddamento MagNA Pure LC nella posizione 16, come indicato dal protocollo di post-eluizione. Nota: Centrifugare la fiala contenente il reagente FIIG20210A CT in modo da spingerne il contenuto in basso prima di aprirla. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nella punta della provetta. Sostituire i guanti dopo avere manipolato il controllo. 6. Chiudere lo strumento, fare clic su Start e quindi su OK per avviare il pipettamento automatico. Al termine della post-eluizione verrà visualizzata la schermata Post-Elution Result. 7. Stampare tre copie del codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo). 8. Salvare e stampare la tabella dei risultati di Post-Elution utilizzando i comandi Save e Print, quindi apporre alla stampa un'etichetta con il codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo). 9. Etichettare un dischetto vuoto con il nome della seduta di purificazione o con un codice a barre del blocco di raffreddamento. Generare sul dischetto un file SAM (Sample Pattern File, file del modello del campione) LightCycler. 10. Sigillare ogni capillare con un tappo utilizzando l'apposito arnese LC (nr. di catalogo 03 357 317 001). 11. Apporre al rotore porta campioni LightCycler un'etichetta con il codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo). 12. Collocare il rotore porta campioni LightCycler nel cestello per rotore della Centrifuga per rotore porta campioni LC. 13. Trasferire il cestello con il rotore porta campioni LightCycler nella Centrifuga per rotore porta campioni LC. Nota: se non è disponibile una Centrifuga per rotore porta campioni LC, utilizzare una centrifuga da tavolo (ad esempio la Biofuge 13 di Heraeus Instruments o Kendro Laboratory Products) con gli adattatori LightCycler e far funzionare ad una velocità massima di 735 g per 30 secondi. 14. Premere Start per avviare la seduta della Centrifuga per rotore porta campioni LC. 15. Al termine della centrifugazione, trasferire il rotore porta campioni LightCycler nello strumento LightCycler 2.0. Nota: conservare il DNA eluito a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C per un massimo di sette giorni o a una temperatura compresa tra -15 C e -25 C per periodi più lunghi (3 settimane circa). Se il protocollo di post-eluizione con lo strumento MagNAPure LC non viene eseguito, procedere con il passaggio B del Capitolo 2 per la preparazione del Master Mix per PCR. 16. Se non si devono eseguire altre sedute MagNA Pure, spegnere il computer MagNA Pure LC e lo strumento MagNA Pure LC. C. AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE Strumento LightCycler 2.0 Nota: prima di avviare la macro, eseguire la connessione ad un database Exor DB con tracciato di controllo. Se si è connessi ad un database Exor DB con tracciato di controllo, compare la parola "Traceable" nella barra di stato del software. Per ulteriori informazioni sull'accesso al software, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler 2.0, versione software 4.05 per uso diagnostico in vitro. 1. Se in precedenza (passaggio B.11) è stata apposta l'etichetta del codice a barre, rimuoverla dal rotore porta campioni LightCycler (facoltativo). 2. Collocare il rotore porta campioni nello strumento LightCycler 2.0. 3. Assicurarsi che sia installata la macro Factor II (Prothrombin) G20210A Kit Macro (nr. di cat. 04 586 930 001). È sufficiente installare questa macro una volta, in occasione della prima esecuzione del test. 4. Per avviare la macro, premere il pulsante Roche e immettere il numero di catalogo del kit manualmente o con il lettore di codici a barre. Per conoscere il codice a barre esatto, vedere il retro di questo foglio illustrativo. Nota: è possibile che la casella "Perform self test" non sia attiva. 5. Con la procedura guidata del kit verranno visualizzate istruzioni dettagliate per completare l'intera operazione. 5

6. Immettere i nomi dei campioni nella schermata Capillary View manualmente oppure, se in precedenza è stato creato un file SAM, scegliendo "Import SAM". Immettere il numero di lotto del kit nel campo corrispondente della schermata Capillary View. 7. Fare clic sul pulsante "Start Run" nella procedura guidata del kit. 8. Al termine della seduta, lo strumento LightCycler 2.0 determina automaticamente il genotipo e visualizza le informazioni corrispondenti eseguendo un'analisi della curva di melting. ➁ Procedura manuale per la preparazione di un campione con High Pure PCR Template Preparation Kit (nr. di catalogo 11 796 828 001) A. PURIFICAZIONE Operazioni preliminari Iniziare a preraffreddare gli adattatori per centrifuga LightCycler in frigorifero a una temperatura compresa tra +2 C e +8 C per almeno 2 ore. Preparazione delle soluzioni di lavoro Reagente Ricostituzione e preparazione della soluzione di lavoro Conservazione e stabilità della soluzione di lavoro Proteinasi K Dissolvere la proteinasi K in 4,5 ml di acqua bidistillata, aliquotare la Conservare tra -15 C e -25 C. Stabile per 12 mesi. (fiala 3, tappo rosa) soluzione. Tampone di rimozione Aggiungere 20 ml di etanolo nel tampone di rimozione degli inibitori. Conservare tra +15 C e +25 C. Stabile fino alla (fiala 4a, tappo nero) Nota: contrassegnare e datare il contenitore dopo l'aggiunta data di scadenza stampata sull'etichetta del kit. dell'etanolo. Tampone di lavaggio (fiala 4, tappo blu) Aggiungere 80 ml di etanolo nel tampone di lavaggio. Nota: contrassegnare e datare il contenitore dopo l'aggiunta dell'etanolo. Conservare tra +15 C e +25 C. Stabile fino alla data di scadenza stampata sull'etichetta del kit. Procedura di purificazione 1. Con il tampone di eluizione preparare un'aliquota di 200 µl per ogni campione, utilizzando provette di reazione sterili da 1,5 ml. Chiudere le provette e preriscaldarle a +70 C. 2. In 200 µl di sangue periferico intero umano risospeso con gli anticoagulanti EDTA o citrato aggiungere: 200 µl di tampone legante (tappo verde) 40 µl di proteinasi K (ricostituita) Miscelare immediatamente in vortex e incubare a +70 C per 10 minuti. 3. Aggiungere 100 µl di isopropanolo e miscelare accuratamente in vortex. 4. Pipettare la miscela campione nel serbatoio superiore di una unità filtro High Pure-provetta di raccolta. 5. Centrifugare per 1 minuto a 6000 g in una centrifuga standard da tavolo. 6. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta. 7. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta. 8. Aggiungere 500 µl di tampone di rimozione degli inibitori (tappo nero) nel serbatoio superiore. 9. Centrifugare per 1 minuto a 6000 g. 10. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta. 11. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta. 12. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio (tappo blu) nel serbatoio superiore. 13. Centrifugare per 1 minuto a 6000 g. 14. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta. 15. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta. 16. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio (tappo blu) nel serbatoio superiore. 17. Centrifugare per 1 minuto a 6000 g. 18. Gettare il materiale residuo. 19. Abbinare la provetta filtro alla stessa provetta di raccolta. 20. Centrifugare per 10 secondi alla velocità massima (13.000 g o più) per rimuovere il tampone di lavaggio residuo. 21. Gettare la provetta di raccolta. 22. Inserire la provetta filtro in una provetta di reazione pulita da 1,5 ml. 23. Aggiungere nella provetta filtro 200 µl di tampone di eluizione preriscaldato (+70 C). 24. Centrifugare per 1 minuto a 6000 g. La provetta microfuge contiene il DNA eluito. B. PREPARAZIONE DEL MASTER MIX 1. Scongelare i componenti del kit Factor II (Prothrombin) G20210A, miscelare con cura e conservare in ghiaccio. 2. Negli adattatori per centrifuga LightCycler preraffreddati, collocare un capillare LightCycler per ogni campione di DNA e uno per ogni controllo. 3. Preparare il Master Mix moltiplicando la cifra riportata nella colonna "Volume/reazione" per il numero di reazioni da eseguire (ovvero campioni di DNA, controllo negativo e controllo positivo), più una reazione extra. Per ottenere una reazione standard da 20 µl, procedere nel modo descritto di seguito. 6

Passaggio Operazione 1 In una provetta da reazione da 1,5 ml, su ghiaccio, aggiungere i seguenti componenti nell'ordine indicato: Reagenti soluzioni di lavoro Volume/reazione FIIG20210A DIL, fiala 4 11 µl FIIG20210A MD Mix, fiala 1 2 µl FIIG20210A R Mix, fiala 2 2 µl Volume totale 15 µl 2 Miscelare con delicatezza. Pipettare 15 µl di Master Mix in ciascun capillare LightCycler preraffreddato. Verificare l'elenco dei campioni (Capitolo 1, A7, stampa) confrontando i codici a barre della cartuccia per campioni corrispondente (facoltativo). Aggiungere 5 µl di campione di DNA isolato o 5 µl di FIIG20210A CT (fiala 3, tappo viola) come controllo positivo oppure aggiungere 5 µl di FIIG20210A DIL (fiala 4, tappo incolore) come controllo negativo. 3 Sigillare ogni capillare con un tappo utilizzando l'apposito arnese LC (nr. di catalogo 03 357 317 001). 4 Se si utilizza la Centrifuga per rotore porta campioni LC, procedere con il passaggio 5. Se si utilizza una centrifuga da tavolo equivalente, (ad esempio la Biofuge 13 di Heraeus Instruments o Kendro Laboratory Products), collocare ciascun capillare nel corrispondente adattatore per centrifuga LightCycler preraffreddato, quindi eseguire i seguenti passaggi: Collocare gli adattatori nella centrifuga da tavolo. Centrifugare alla velocità massima di 735 g per 30 secondi. Procedere con il passaggio 5. 5 Collocare il capillare contenente il controllo negativo nella posizione 1 e il capillare contenente il controllo positivo nella posizione 2 del rotore porta campioni LightCycler. 6 Partendo dalla posizione 3, collocare i capillari contenenti i campioni di DNA nel rotore porta campioni LightCycler. 7 Trasferire il cestello con il rotore porta campioni LightCycler LC nella Centrifuga per rotore porta campioni 2.0 oppure nella Centrifuga porta campioni LC equipaggiata con il Set rotori LC 2.0. 8 Premere Start per avviare la seduta della Centrifuga per rotore porta campioni LC. 9 Al termine della centrifugazione, trasferire il rotore porta campioni LightCycler nello strumento LightCycler 2.0. C. AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE Strumento LightCycler 2.0 Nota: prima di avviare la macro, eseguire la connessione ad un database Exor DB con tracciato di controllo. Se si è connessi ad un database Exor DB con tracciato di controllo, compare la parola "Traceable" nella barra di stato del software. Per ulteriori informazioni sull'accesso al software, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler 2.0, versione software 4.05 per uso diagnostico in vitro. 1. Collocare il rotore porta campioni nello strumento LightCycler 2.0. 2. Assicurarsi che sia installata la macro Factor II (Prothrombin) G20210A Kit Macro (nr. di cat. 04 586 930 001). È sufficiente installare questa macro una volta, in occasione della prima esecuzione del test. 3. Per avviare la macro, premere il pulsante Roche e immettere il numero di catalogo del kit manualmente o con il lettore di codici a barre. Per conoscere il codice a barre esatto, vedere il retro di questo foglio illustrativo. Nota: è possibile che la casella "Perform self test" non sia attiva. 4. Con la procedura guidata del kit verranno visualizzate istruzioni dettagliate per completare l'intera operazione. 5. Immettere i numeri dei campioni nella sezione Sample Count e i relativi nomi nella schermata Capillary View, facendo riferimento allo schema di caricamento dei campioni. Immettere il numero di lotto del kit nel campo corrispondente della schermata Capillary View. 6. Fare clic sul pulsante "Start Run" nella procedura guidata del kit. 7. Al termine della seduta, lo strumento LightCycler 2.0 determina automaticamente il genotipo e visualizza le informazioni corrispondenti eseguendo un'analisi della curva di melting. CALIBRAZIONE DELLO STRUMENTO Non è prevista nessuna calibrazione. CONTROLLO DI QUALITÀ In ogni seduta PCR è necessario includere i controlli negativi e positivi. Controllo negativo: Il risultato del dosaggio del controllo negativo FIIG20210A deve essere sempre "negative". In caso contrario viene annullata la validità dell'intera seduta e la procedura deve essere ripetuta dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). Se il controllo negativo produce costantemente un risultato non negativo, rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza tecnica. Controllo positivo: Il risultato del dosaggio del controllo FIIG20210A CT deve essere sempre del genotipo eterozigote ("het"). In caso contrario viene annullata la validità dell'intera seduta e la procedura deve essere ripetuta dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). Se il controllo positivo non produce mai un risultato del genotipo eterozigote, rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza tecnica. Risultato dei campioni: Il dosaggio dei campioni di DNA deve produrre sempre un risultato caratterizzato da un profilo della curva di melting con genotipo omozigote wild type, omozigote mutante oppure eterozigote. In caso contrario viene annullata la validità dei risultati dei campioni e la procedura deve essere ripetuta dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). 7

LIMITI E INTERFERENZE Il reagente FIIG20210A MD Mix (fiala 1, tappo giallo) è specifico della sequenza del gene del fattore II umano. Concentrazioni elevate di eparina potrebbero interferire con la reazione a catena della polimerasi. Non sono note altre possibili interferenze. VALORI PREVISTI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1. Assicurarsi che i risultati dei controlli eseguiti nella seduta siano validi. In caso contrario è necessario ripetere la procedura dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). 2. Quando la seduta è valida, i risultati vengono visualizzati dal modulo di analisi del genotipo presente nel software LightCycler nel seguente modo: Risultato visualizzato wt Interpretazione Genotipo omozigote wild type: il campione è negativo alla mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A (in altre parole, non è presente nessun allele mutante) het Genotipo eterozigote: nel campione sono presenti entrambi gli alleli, uno wild-type e uno mutante (Factor II (Prothrombin) G20210A) mut Genotipo omozigote mutante: il campione è positivo alla mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A (in altre parole, sono presenti due alleli mutanti) unknown Non è stato possibile classificare il genotipo in base agli standard di melting predefiniti. Ripetere la procedura di analisi dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). Se il risultato è ancora sconosciuto ("unknown"), rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza tecnica. negative il campione è conforme ai criteri software impostati per i controlli negativi DATI SPECIFICI SULLE PRESTAZIONI Specificità analitica Grazie all'impiego di oligonucleotidi sintetici come primer e di sonde H, è stato possibile dimostrare che la genotipizzazione con il software LightCycler 4.05 identifica in modo inequivocabile la mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A. Applicando l'analisi della sequenza è stato possibile dimostrare che gli oligonucleotidi sintetici selezionati che sono stati utilizzati come primer amplificano in modo specifico un frammento di 165 bp relativo al gene del fattore II contenente la sequenza Factor II (Prothrombin) G20210A. Sensibilità analitica Il DNA umano eterozigote purificato per la mutazione Factor II (Prothrombin) G20210A è stato sottoposto a diluizione seriale in quattro passaggi. Ogni diluizione è stata analizzata in sei replicati ed è stata oggetto di un'attenta interpretazione statistica. Il livello di sensibilità minimo per il kit Factor II (Prothrombin) G20210A è stato fissato a 198 copie per reazione. Sensibilità e specificità diagnostica In uno studio prospettico riguardante campioni di DNA umano sia freschi che conservati, sono stati analizzati 522 casi di pazienti caucasici con sospetta trombofilia utilizzando il kit Factor II (Prothrombin) G20210A e l'analisi della sequenza a filamento singolo o doppio con lo strumento MegaBACE 500 Sequencing System, dotato di software Cimarron Base Caller SW 3.12. In entrambi i gruppi, i campioni erano rappresentativi di una raccolta di dati su pazienti con sospetta trombofilia, provenienti da un laboratorio di un ospedale universitario e accumulati in un arco di tempo definito. Il livello di concordanza tra il kit Factor II (Prothrombin) G20210A e l'analisi della sequenza è stato del 98,9% (516 casi su 522). I dettagli sono illustrati nella tabella riportata di seguito. Tabella 1: confronto tra il kit Factor II (Prothrombin) G20210A e l'analisi della sequenza Analisi della sequenza Kit Factor II (Prothrombin) G20210A wild type (wt) eterozigote (het) mutante (mut) sconosciuto wt 476 0 5 het 40 1 mut Nota: il 41,0% dei campioni di DNA umano proveniva da pazienti con sospetti eventi tromboembolici venosi, secondo una o entrambe le dichiarazioni di consenso (2,4) dell'american College of Medical Genetics (ACMG) o del College of American Pathologists (CAP); il 38,0% proveniva da pazienti con disturbi trombotici arteriosi ((ad esempio ictus); il 18,0% da pazienti con sospetta trombofilia, identificati per altri motivi; infine il 3,0% è stato incluso per ragioni non specificate. Il kit Factor II (Prothrombin) G20210A non ha prodotto i genotipi relativi a tre di questi campioni. 8

AVVISO PER L'ACQUIRENTE Acquistando il presente prodotto si acquisisce il diritto all'uso dello stesso per le finalità di amplificazione e rivelazione delle sequenze di acido nucleico a scopo diagnostico in vitro su campioni di origine umana. Non si acquisisce tuttavia nessun'altra licenza di nessun tipo, ad eccezione del suddetto diritto specifico all'uso, derivante dall'acquisto. BIBLIOGRAFIA 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, 1305-1307. 2 Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol.2,139-148. 3 Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia. 2005 Roche Diagnostics La tecnologia utilizzata per il sistema LightCycler è concessa in licenza da Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. ROCHE, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE e HIGH PURE sono marchi di fabbrica della Roche. Biofuge è un marchio di fabbrica di proprietà di Heraeus Instruments GmbH. Brij è un marchio di fabbrica di proprietà di ICI Americas, Inc., PA, USA. MegaBACE è un marchio di fabbrica di proprietà di Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, UK. Cimarron è un marchio di fabbrica di proprietà di Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA. Prodotto in Germania per conto di Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania, +49 621 7590 Per gli Stati Uniti: Distribuzione negli Stati Uniti: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA Assistenza tecnica ai clienti negli Stati Uniti: 1-800-526-1247 12/2005 04536037001-02 9