I microrganismi nell Industria Chimica e Farmacuetica
Esempi di prodotti industriali ottenuti mediante l impiego di microrganismi
Produzione industriale di aminoacidi Produzione riferita all anno 1985. Metodi produttivi: C: sintesi chimica; M: sintesi microbiologica (fermentazione, biotrasformazione di precursori, trasformazioni enzimatiche); P: purificazione da idrolisati proteici
Alcuni polisaccaridi microbici di interesse industriale Polisaccaridi Microrganismo Utilizzazione produttore Destrani Leuconostoc P.M. 40.000-60.000: mesenteroides sostituti del plasma (soluzioni al 6-10%) Xantani Xantomonas Addensanti e stabilizzanti campestris in campo alimentare Alginati Pseudomonas - Agenti stabilizzanti e leganti aeruginosa di preparazioni farmaceutiche - preparazione di bendaggi per ferite - terapia di disturbi esofagei
Enzimi microbici di interesse industriale e farmaceutico
Esempi di trasformazioni microbiche di steroli
Produzione di acido 6-aminopenicillanico
Degradazione di composti organici nelle biodepurazioni Esempi di plasmidi catabolici in alcuni microrganismi
Esempi di metaboliti microbici non antibiotici con attività farmacologica
Ricerca e produzione di nuovi antibiotici - Modificazione di antibiotici naturali - Sintesi chimica di nuove molecole Studio di: spettro d azione in vitro tossicità farmacocinetica efficacia in infezioni sperimentali in animali
Biotecnologia Scienza che studia ed applica processi in cui organismi viventi (procarioti o eucarioti) vengono geneticamente manipolati, attraverso l ingegneria genetica, per indurli alla produzione di sostanze utili, al fine di realizzarne applicazioni industriali, mediche o altre Integrazione di Microbiologia, Biochimica ed Ingegneria
Biotecnologia Deliberata modificazione dell'informazione genetica di un organismo vivente mediante modificazione diretta del suo acido nucleico o introduzione di uno o più geni esogeni, attraverso una serie di metodologie, definite nell'insieme "Tecnologia del DNA ricombinante", basate sulla possibilità di: tagliare il DNA, in corrispondenza di siti specifici, con enzimi di restrizione (endonucleasi), identificare geni di interesse, trasferirli ed inserirli in opportuni vettori (clonaggio), introdurre tali vettori modificati (DNA ricombinante) in ospiti, che ne consentono la propagazione ed espressione, con produzione della proteina codificata dal gene di interesse (proteina ricombinante).
Biotecnologia I microrganismi (batteri o lieviti), data la rapidità di crescita, facilità e relativa economicità della loro coltivazione sono gli ospiti più utilizzati Applicazioni: ricerca, industria farmaceutica, alimentare, medicina, agricoltura, zootecnia, ecc. Industria farmaceutica: produzione di proteine di difficile ottenimento o purificazione, da utilizzare quali vaccini, prodotti terapeutici, diagnostici
Alcune pietre miliari nel campo della biotecnologia e del DNA ricombinante 1969 primo enzima di restrizione (EcoRI) 1970 trascrittasi inversa (Temin, Baltimore) sintesi in vitro di un gene completo 1972 clonaggio di geni in vettori plasmidici 1975 prima diagnosi prenatale con una sonda genica specifica 1976 metodi per sequenziamento rapido DNA 1977 scoperta dei geni interrotti (introni) sintesi della somatostatina ricombinante 1978 sintesi della insulina ricombinante 1979 clonaggio del primo gene codificante un antigene virale umano (epatite B) clonaggio del gene codificante un antigene virale dell'afta epizootica
Alcune pietre miliari nel campo della biotecnologia e del DNA ricombinante 1981 produzione industriale di insulina umana in E.coli 1982 isolamento, clonaggio, caratterizzazione del primo oncogène umano trasferimento del gene per l'ormone della crescita di ratto in uova fecondate di topo (terapia genica in vitro) piante di tabacco rese resistenti all'erbicida glifosato (inserzione di un gene di Salmonella) 1985 sviluppo della reazione polimerasica a catena (PCR) terapia genica in topo: cura di una malattia genetica letale con inserimento di un gene normale in una cellula uovo fecondata 1987 produzione di una pianta agricola geneticamente modificata (soia)
Alcune pietre miliari nel campo della biotecnologia e del DNA ricombinante 1988 primo saggio sul campo di un virus degli insetti geneticamente modificato (baculovirus in grado di uccidere larve dei geometridi del cavolo) 1989 produzione primo granturco geneticamente modificato fertile (gene per la resistenza all'erbicida bialaphos) produzione di anticorpi ricombinanti nel fago λ 1990 sviluppo maiali e capre transgenici in grado di produrre proteine umane (es. emoglobina) produzione di anticorpi ricombinanti in fagemidi (fago M13) 1991 primo test di terapia genica in un paziente con cancro 1992 immunizzazione genica sperimentale
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante la tecnologia del DNA ricombinante
Alcuni enzimi utilizzati nella Tecnologia del DNA ricombinante Enzimi Microrganismi produttori Endonucleasi di restrizione Bam HI Dpn l EcoRI Hae Il Sal I Enzimi modificanti DNA ligasi del fago T4 DNA polimerasi (E. coli) DNA polimerasi del fago T4 Polinucleotide chinasi Trascrittasi inversa Bacillus amyloliquefaciens Diplococcus pneumoniae Escherichia coli Haemophilus aegyptius Streptomyces albus E. coli infettato con T4 E. coli E. coli infettato con T4 E. coli infettato con T4 Virus della mieloblastosi aviaria
Strategie del clonaggio genico clonaggio: possibilità di trasferire da un organismo ad un altro un determinato gene, senza che esso venga degradato, ma sia in grado di essere espresso, propagato (autonomamente o meno) e trasmesso alle cellule figlie (funzioni fornite dal vettore) DNA donatore + vettore di clonaggio - frammenti del genoma - plasmidi -cdna(trascrizione inversa di mrna) - batteriofagi - DNA sintetico - cosmidi e fagemidi -virus inserimento del DNA nel vettore inserimento del vettore ricombinante nella cellula ospite (procariota o eucariota) (trasformazione, trasduzione, elettroporazione) selezione del clone contenente il gene desiderato (tecniche immunologiche con l uso di anticorpi marcati, ibridazione con sonde nucleotidiche, ecc.)
Schema del clonaggio genico fotografia al M.E. del plasmide e del gene tagliati fotografia al M.E. del plasmide ricombinante ottenuto Il gene di interesse, contenuto nel DNA donatore, viene tagliato con una endonucleasi (es. Eco RI); il vettore plasmidico, contenente un gene per la resistenza ad un antibiotico (es. tetraciclina, tetr) viene tagliato con lo stesso enzima Le 2 molecole di DNA, purificate, sono miscelate in modo che le basi complementari si appaino e legate insieme ad opera dell enzima ligasi Il DNA ricombinante così ottenuto viene introdotto in una cellula ospite (es. E. coli) sensibile alla tetraciclina; le cellule in cui entra il DNA ricombinante diventano resistenti e possono formare colonie su terreni contenenti l antibiotico (selezione dei ricombinanti). A volte il DNA viene tagliato con 2 diverse endonucleasi per ottenere un clonaggio direzionale.
Clonaggio di geni eucariotici Mentre geni batterici e virali possono essere tagliati e clonati direttamente in un vettore, spesso i geni eucariotici sono interrotti da introni; si preferisce allora ottenere il gene completo (cdna) a partire da mrna maturo Nella trascrizione primaria tutto il gene viene trascritto (RNA trascritto primario), poi subisce un processo di maturazione ( splicing ), durante il quale le sequenze introniche vengono rimosse. L mrna maturo può essere retrotrascritto per ottenere una molecola di cdna che contiene il gene non interrotto
Sintesi di cdna a partire da mrna eucariotico Le code di polia, presenti nel mrna maturo, permettono di utilizzare inneschi di oligo dt che consentono all enzima trascrittasi inversa di sintetizzare un filamento di cdna che termina con un ripiegamento. L RNA a questo punto viene degradato dalla aggiunta di NaOH. Aggiungendo DNA polimerasi I si consente la sintesi della 2^ elica di DNA. Infine, il tratto ripiegato viene eliminato mediante trattamento con una nucleasi (S1) ed alle estremità vengono aggiunte brevi sequenze di basi (ad es. C) per poter inserire il gene in un vettore
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico Escherichia coli Primo sistema ospite utilizzato per clonaggio genico e produzione di proteine ricombinanti: batterio più studiato e conosciuto, per cui la sua manipolazione genetica è abbastanza facile. Svantaggi: - non possiede efficienti sistemi di secrezione delle proteine (le proteine ricombinanti prodotte spesso si accumulano all'interno della cellula e, nei casi di produzione elevata, danno origine ad aggregati intracellulari); - alcune proteasi batteriche possono degradare le proteine ricombinanti (si ovvia utilizzando ceppi mutanti che non producono proteasi). - come tutte le cellule procariotiche, non permette modificazioni posttraduzionali (glicosilazioni, fosforilazioni, tagli, ecc.) - essendo un batterio Gram- la proteina ricombinante ottenuta è contaminata da endotossina (attività pirogena) e deve essere purificata. E il sistema di espressione più utilizzato (insulina, somatostatina, ormone della crescita, interferoni, ecc.); la proteina ricombinante rappresenta il 30-40% delle proteine totali.
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico Bacillus subtilis Dopo E. coli è il sistema genetico meglio conosciuto Vantaggi: - essendo Gram+, non possiede endotossina - è un microrganismo apatogeno Tuttavia è poco utilizzato, in quanto non sono disponibili efficienti vettori di clonaggio e non è stato possibile ottenere un efficiente produzione di proteine ricombinanti eterologhe
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico Saccharomyces cerevisiae Microrganismo eucariota (lievito) molto utilizzato a livello industriale e ben conosciuto dal punto di vista genetico. Vantaggi: possiede un efficiente sistema di secrezione, anche per le proteine ricombinanti eterologhe; esistono vettori efficienti; è di facile coltivazione; le proteine ricombinanti non formano inclusioni intracellulari; sono possibili modificazioni posttraduzionali (che tuttavia non sono necessariamente le stesse prodotte dalle cellule animali); è apatogeno. Viene utilizzato per produrre interferone, insulina, interleukina 2, ecc. Più recentemente sono stati utilizzati anche altri lieviti, quali Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, che hanno vantaggi in termini di facilità di coltivazione o resa del prodotto finale.
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico Cellule di mammifero coltivate in vitro Questo sistema ospite permette di ottenere la secrezione della proteina ricombinante e di realizzare le modificazioni post-traduzionali di tipo eucariotico (es. glicosilazione), richieste per la funzionalità della proteina finale. Sono disponibili efficienti sistemi di espressione (vettori). Questo sistema è tuttavia estremamente costoso e le rese del prodotto sono enormemente inferiori a quelle dei sistemi microbici, per cui, quando possibile, questi ultimi sono preferiti. Es. cellule CHO (cellule di ovaio di hamster cinese)
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico La scelta della sistema ospite dipende dalle caratteristiche del prodotto finale. Se questo richiede modificazioni post-traduzionali, occorre utilizzare sistemi eucariotici più o meno complessi. Le cellule ospiti vengono coltivate in chemostati (fermentatori per batteri e lieviti; bioreattori per cellule di mammifero) e le proteine ricombinanti vengono purificate dal sopranatante della coltura.
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Ormoni Insulina (E. coli, S. cerevisiae) Ormone umano della crescita (E. coli, S. cerevisiae, cellule CHO) Eritropoietina (cellule CHO) Proteine del sangue Attivatore tissutale del plasminogeno (E. coli, S. cerevisiae) Fattore VIII di coagulazione (S. pombe, cellule CHO)
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante la tecnologia del DNA ricombinante Enzimi DNasi umana (cellule CHO) Vaccini Epatite B (S. cerevisiae, P. pastoris, H. polymorpha) Immunomodulatori Interferone α-2a (E. coli) Interferone α-2b (E. coli) Interferone β-1a (cellule CHO)
Altre applicazioni importanti del DNA ricombinante Terapia genica Cura di una malattia genetica mediante sostituzione di un gene mutante difettoso con uno normale (ricombinante) introdotto dall esterno Immunizzazione genica Vaccini a DNA. Introduzione nell organismo di DNA ricombinante contenente uno o più geni che codificano per antigeni che vengono prodotti nell organismo e stimolano una risposta immunitaria protettiva