ASPETTI TRADIZIONALI E INNOVATIVI NELLA CLINICA DELLA LEISHMANIOSI NEL CANE

ASPETTI TRADIZIONALI E INNOVATIVI NELLA CLINICA DELLA LEISHMANIOSI NEL CANE gaeoliva@unina.it

ASPETTI CLINICI

VECCHIA TERMINOLOGIA/CLASSIFICAZIONI Asintomatico Oligosintomatico Paucisitomatico Sintomatico Marcatamente sintomatico. Numero dei segni clinici riscontrati, indipendentemente dalla gravità. Nessuna indicazione sulla risposta immunitaria e sulle alterazioni clinico-patologiche

Stadiazione Visita clinica Emocromocitometrico Profilo ematobiochimico Esame delle urine Diagnosi parassitologica STADIAZIONE

Stadiazione dei cani affetti da leishmaniosi Stadio Definizion e Descrizione A Esposto Cane senza alterazioni clinico-patologiche dimostrabili, nel quale i test diagnostici parassitologici risultino negativi ma siano evidenziabili titoli anticorpali specifici, non superiori a 4 volte il valore soglia del laboratorio di riferimento. I cani esposti solitamente soggiornano o hanno soggiornato in un area dove è accertata la presenza di flebotomi B Infetto Cane senza alterazioni clinico-patologiche dimostrabili, nel quale è possibile mettere in evidenza il parassita, con metodi diretti (microscopia, coltura o PCR) e con metodi indiretti (presenza di anticorpi specifici). C Malato Cane infetto, nel quale sia dimostrabile qualunque alterazione clinico- patologica riferibile a leishmaniosi e nel quale sia dimostrabile il parassita o titoli anticorpali superiori a 4 volte il valore soglia del laboratorio di riferimento. D E Malato con quadro clinico grave Refrattari o Recidivo Cane malato affetto da: (i) nefropatia proteinurica; (ii) insufficienza renale cronica; (iii) gravi malattie oculari che possano comportare la perdita funzionale e/o richiedano terapie immuno-depressanti; (iv) gravi malattie articolari che possano invalidare la funzione motoria e/o richiedano terapie immunodepressanti; (v) gravi malattie concomitanti, di natura infettiva, parassitaria, neoplastica, endocrina o dismetabolica. (Ea) Cane malato refrattario al trattamento (Eb) Cane malato sottoposto a trattamento, con recidiva precoce

Clinical staging of canine leishmaniosis

Incidenza (%) delle alterazioni clinicopatologiche Proteinuria PU/CU A/G Piastrinopenia Iperproteinemia Hct Azotemia GPT Creatinemia Fosf. Alcalina 0 10 20 30 40 50 60 70

ASPETTI DIAGNOSTICI

Andamento esami per Leishmaniosi canina in Campania ANNO ESAMI POSITIVI %POS. NEGATIVI %NEG. REATTIVI %REATT. 2004 14.269 2.000 14,0% 10.594 74,2% 1.675 11,7% 2005 11.538 1.567 13,6% 8.186 70,9% 1.785 15,5% 2006 11.790 1.617 13,7% 8.268 70,1% 1.905 16,2% 2007 16.795 1.712 10,2% 12.165 72,4% 2.918 17,4% 2008 17.415 1.374 7,9% 14.522 83,4% 1.519 8,7% 2009 15.899 1.727 10,9% 11.708 73,6% 2.464 15,5%

Detection of CanL infection during time n-pcr Culture/Microscopy Serology Clinical (100%) (82%) (82% 1:160) (45%) 0-22 months (m: 4.5) m= median time expressed in months This is not a standard pattern 0-2 months (m: 1) 3-14 months (m: 7) Oliva et al., J.Clin.Microb., 2006

Months BM Nested PCR BM RT PCR Lymphnode EMTM Culture IFAT ELISA Haemato Biochemical parameters Clinical examination STATUS M9 neg neg <1/40 Neg. normal Mild weight loss Negative M15 pos 4.9 pos 320 2000 PLT Asymptomatic Patent Asymptomatic infection M18 pos 6.5 pos 5120 5000 RBC PLT Inverted A/G ratio Lymphoadenop athy (popliteal) Patent Symptomatic infection M21 pos 6.7 pos 20480 5000 RBC Inverted A/G ratio Pale mucosae Loss of weight - Muscle atrophy Patent Symptomatic infection

Months BM Nested PCR BM RT PCR Lymp hnode EMT M Cultur e IFAT ELISA Haemato Biochemical parameters Clinical examination STATUS M9 neg neg <1/40 PLT prescapular enlarged negative M15 Pos neg <1/40 (-) TP asymptomatic Subpatent infection M18 neg neg <1/40 WBC Healthy negative M21 neg neg <1/40 RBC TP Healthy negative M24 Pos 2.9 neg 1/160 200/ND normal asymptomatic Subpatent infection M 30 neg neg <1/40 normal asymptomatic negative M33 neg neg <1/40 RBC TP asymptomatic negative

sintomatici Infezione Patente (attiva, in progressione verso malattia) asintomatici preclinici? resistenti Estrema difficoltà di isolare il parassita Infezione Serbatoio non attivo??? subpatente (non attiva, possibile regressione)

Reis AB et al., Res Vet Sci, 2006

ASPETTI TERAPEUTICI

Terapia x CanL Glucantime + Allopurinol Totale 78,8% Glucantime Alone Allopurinol Alone (Zyloric) Levamisole Marbofloxacine Vitamins Ripercol Renal protective Metronizadole Allopurinol + Levamisole Other 4,7% 2,8% 2,4% 1,9% 1,4% 0,9% 0,9% 9,0% 16,5% 17,5% Veterinari che impiegano ciascun protocollo Base: Total sample n=212 Multiple answer DK/NA 0,9%

Nuova Molecola Miltefosina

Punteggio Clinico Mirò et al., 2009 20 18 16 14 Trattamento Glucantime+Allo Milteforan+Allo 12 10 8 6 4 2 0 0 14 28 84 140 Giorno

CT5 RT-QPCR Lab. di Madrid Lab. di Milano Parasitic load vs time Parasitic load vs time 70000 600x10 3 60000 500x10 3 Parasitic load (parasites/ml) 50000 40000 30000 20000 10000 Parasitic load (parasites/ml) 400x10 3 300x10 3 200x10 3 100x10 3 0 0-10000 Day 0 Day 28-100x10 3 Day 0 Day 28 Time Time Milteforan + Allopurinol Glucantime + Allopurinol Milteforan + Allopurinol Glucantime + Allopurinol

Clinical staging of canine leishmaniosis

Proteinuria (62% )

PROFILASSI Prevenire è meglio che curare

Le possibili strategie per il controllo della CanL sono inquadrabili in tre punti ritenuti fondamentali: Lotta agli insetti vetori e prevenzione dalle punture Vaccinazione dei cani sani Eliminazione dei cani infetti/ammalati

La prevenzione dalla puntura dei flebotomi vettori è una profilassi che dovrebbe essere sempre applicata, indipendentemente dall uso di farmaci o vaccini che non possono mai essere considerati risolutivi del problema in assoluto

Maroli et al., 2010

CHE VOGLIAMO OTTENERE CON UN VACCINO? Stimolazione del sistema immune (per) prevenire infezione/malattia 27

PLASTICITY OF CD4+ T-CELL SUBSETS ALTHOUGH REGULATORY T CELLS PREVENT COMPLETE ELIMINATION OF THE INFECTION, THEY ARE CRUCIAL IN INHIBITING THE DEVELOPMENT OF SECONDARY IMMUNOPATHOLOGY. A BALANCE IS THEREFORE ACHIEVED BETWEEN INFECTION LIMITING. TH1 IMMUNITY AND IMMUNOPATHOLOGY-LIMITING REGULATION. THE REGULATORY ACTIVITY MIGHT COME FROM CLASSICAL INDUCED OR NATURAL TREG, BUT EQUALLY SOME LEISHMANIA-SPECIFIC TH1 CELLS MAY BE RE-PROGRAMMED TO BECOME IL-10 PRODUCING REGULATORY CELLS. M. Day, CVBD forum, Nice 2011 STERILIZING IMMUNITY CHRONIC INFECTION

Reis at al., Trends Parasitolgy 2010

CLASSIFYING DOG INFECTION STATUS FOR CHALLENGE STUDIES: Clinical parameters Clinically healthy Classification Leishmania Free Leishmania Free (PCR-, Culture -, Clinically well) Leish DNA positive only (PCR+, Culture -, Clinically well) Infection Status No Evidence of active infection Clinical signs and/or haematol/biochem abnormalities Asymptomatic active infection (PCR +, Culture +, Clinically well) Symptomatic active infection (PCR +, Culture +, Symptomatic) Active infection confirmed (disease)

31 E I VACCINI?????

Vaccini di 1 generazione Vaccini di 2 generazione Vaccini di 3 generazione Parassiti uccisi Vaccini vivi modificati Vaccini a DNA Lisati di parassiti autoclavati (AL) Vaccini che usano batteri o virus ricombinanti (carriers di antigeni) Vaccini basati su antigeni della saliva dei flebotomi Mix di parassiti vivi ed uccisi Antigeni purificati di Leishmania Antigeni ricombinanti Vaccini sintetici

Leishmune FML (Fucose-Mannose-Ligand) glicoproteina di membrana adiuvata con saponine EFFICACIA NELLA PREVENZIONE DELLA MALATTIA Blocking Transmission Vaccine (Risultati ancora non confermati) Immunoterapeutico, da solo od in associazione a farmaci convenzionali

CANILEISH

ISS DSCV Luigi Gradoni Eleonora Fiorentino Gioia Buongiorno Marina Gramiccia Titti Di Muccio Aldo Scalone Gaetano Oliva Valentina Foglia Manzillo Silvia Cappiello Rossella Paparcone Manuela Gizzarelli Paolo Muzj Carmen Cañavate e Coll. : Istituto Carlos III, Madrid, Spagna Anne Marie Cousinier e Coll. : Virbac, Francia

I punti chiave: Qual è la tecnologia del vaccino? E sicuro? E efficace? Uso pratico del vaccino

Excreted-Secreted Proteins (ESP) Vantaggi: Proteine Parassitarie Solubili Conformazione Naïve (ottenute da L. infantum) Frazione Definita (molto meno complessa dell estrazione dell intero parassita) Pure. Assenza di altre proteine contaminanti Tutte le proteine provengono da Leishmania Il principale antigene tra le ESP è il PSA (antigene di superficie del parassita) che è presente sia negli amastigoti che nei promastigoti Si ritiene che le proteine ESP siano coinvolte in varie interazioni ospiteparassita

L adiuvante scelto Il miglior adiuvante selezionato è stato il QA-21 Si tratta di una frazione altamente purificata della saponina (QA saponin) che conserva un elevata capacità come adiuvante e nel contempo un buon indice di sicurezza Si ritiene sia un potente stimolante della risposta dominante Th1 Il suo analogo utilizzato in medicina umana ( l adiuvante QS-21) è il candidato per il più avanzato vaccino a livello mondiale contro la malaria : Fase III GlaxoSmithKline (Ballou WR, 2009, 492).

Studi di campo che utilizzano il modello di infezione naturale (Gradoni L., Oliva G.) Valutati 90 cuccioli Leishmania-free, vaccinati (45) e trasferiti in aree altamente endemiche (Italia, Spagna) per condurre uno studio di infezione naturale I soggetti sono stati controllati per 2 anni dall immissione nel sito L infezione è stata monitorata con test ripetuti ogni 3 mesi: Coltura della Leishmania (midollo osseo o linfonodo) PCR (midollo osseo) nested e quantitative real-time PCR Sierologia Valutazioni cliniche Mediamente il 72% dei cani del gruppo di controllo testati con PCR sono risultati positivi almeno una volta durante lo studio (rispetto al 57% dei cani vaccinati)

Esito dello studio di campo Riscontrata durante lo studio una più alta carica parassitaria nel gruppo di controllo (Real Time-PCR) Maggiore probabilità dell evoluzione verso l infezione attiva nel gruppo di controllo (p=0.0265) Maggiore probabilità di manifestare la sintomatologia nel gruppo di controllo (p=0.0466) Le forme più gravi della malattia si sono manifestate maggiormente nel gruppo di controllo L effetto benefico del vaccino è quello di ridurre il rischio* per i cani di diventare soggetti con infezione attiva (rischio più basso di 3.6 volte) o sintomatici (rischio più basso di 4 volte) *Espresso come odds ratio una misura della probabilità che un soggetto rimanga sano rispetto alla probabilità che sviluppi la malattia per ogni cane malato sarà 4 volte maggiore la probabilità che siano sani i cani del gruppo dei vaccinati

Uso pratico Il protocollo vaccinale è di 3 iniezioni con intervalli di 3 settimane seguite un richiamo vaccinale annuale L inizio dell immunità è a 4 settimane dalla terza iniezione E consigliato sverminare gli animali prima che inizi il protocollo Solo gli animali siero-negativi per Leishmania possono essere vaccinati Sono osservati anticorpi transitori rilevabili con IFAT che possono essere differenziati da quelli dovuti all infezione naturale tramite test sierologici rapidi attualmente in valutazione L'uso di misure per ridurre l'esposizione ai flebotomi non deve essere assolutamente abbandonato