DISS. ETH No. 21523 INVESTIGATION OF BUDDING YEAST SIGNALING TRANSMISSION AND INTEGRATION BY HIGH-THROUGHPUT QUANTITATIVE MASS SPECTROMETRY A dissertation submitted to the ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Stefania Vaga Dipl. Biomedical Eng., Politecnico di Milano born May 1 st, 1979 citizen of Italy accepted on the recommendation of Prof. Dr. Ruedi Aebersold Prof. Dr. Yves Barral Prof. Dr. Edda Klipp Prof. Dr. Robbie Loewith 2013
Abstract Every living cell needs to sense its environment to decide for the best action to be taken for the preservation of the cell itself or of the organism it belongs to. Signals originate from specialized receptors, which capture a particular environmental parameter and circulate within the cell signaling network (CSNW). The latter is generally composed of proteins (the nodes of the network) and their interactions (the edges of the network). The CSNW is composed of discrete signaling modules called pathways (PWs), which control both the detection and the response to each specific input. The signal transduced and transmitted by one PW usually spreads to every other PW. This enables signals being integrated by key proteins within every PW, so that the cell s final decision can be based on a thorough knowledge of its actual environmental conditions. The vehicles used by cell signals are the post-translational modifications (PTMs) of proteins. PTMs are regulated by specialized enzymes, which constitute an important part of the signaling PWs, and therefore also allows for signal integration. The activation mechanisms of PWs have been usually studied under single input conditions. This approach isolates PWs from the CSNW, to simplify their environment and facilitate their study. In order to understand the mechanisms that cells use for signal integration, we need to study every PW in the context of the CSNW. The aim of this thesis work was therefore to approach the investigation of the CSNW signaling mechanisms of Saccharomyces cerevisiae, a simple eukaryotic cell model. Specifically, we used shot-gun mass-spectrometry -based label-free quantification to quantify PTMs across different samples after the activation of particular cellular PWs. In the first two studies we investigated the response of deletion mutant strains when perturbed by specific kinases inhibitors. In these works, which focused on the TORC2 and the Rim15 PWs respectively, phosphorylation changes were used to identify direct and indirect substrates of kinases or phosphatases, thus reconstructing defined portions of the signaling cascades investigated. In the next study we investigated the crosstalk mechanisms between the Snf1 and the TORC1 signaling cascades. As these PWs participate in the regulation of yeast metabolism according to growth conditions, Snf1 and Tor1 single and double deletion strains were grown in different limiting nutrient conditions to assess if and how the two PWs influence each other. This study proved that the Snf1 and the TORC1 signals converge onto the co-regulation of specific metabolism mechanisms. Next we approached a dynamic study of PWs activation and crosstalk after a doublestimulation. In particular, we focused on the hyper-osmolarity and the mating PWs co-stimulation, i
by NaCl and α-factor respectively, according to a two-dimensional time-plan. We thus collected twodimensional quantitative dynamic data of 2536 phospho-peptides (P-peps), which we used to infer how signals are affecting specific P-peps, and if and how two P-peps are functionally interacting with each other. The data resulting from all these studies, flanked by the already available knowledge on a few specific components, allowed us to contribute to a better understanding of budding yeast CSNW. As basic biochemical mechanisms involved in cell signaling are conserved among all eukaryotes, the same exploratory methods can be generalized and applied to the study of other cellular systems. For instance, the understanding of how signals are shared, communicated, and integrated in CSNWs would add important new insights into the networks rewiring observed in dis-regulated pathological cells. ii
Sommario Ogni cellula rileva i cambiamenti del suo ambiente, al fine di rispondervi nel modo più efficace a garantire la propria sopravvivenza o quella dell organismo cui appartiene. Recettori specializzati catturano determinati parametri ambientali, in risposta ai quali innescano segnali che circolano nella rete di segnalazione intracellulare (RDSI). Quest'ultima è generalmente composta da proteine (i nodi della rete) e dalle loro interazioni (i rami della rete). La RDSI è costituita da moduli discreti chiamati vie di segnalazione intracellulare (VDSI), le quali controllano sia il rilevamento che la risposta a ciascuno stimolo. Il segnale trasdotto e trasmesso lungo una VDSI si diffonde poi ad ogni altra VDSI. Ciò permette ai diversi segnali di essere integrati da proteine chiave all'interno di ogni via, così che ogni azione intrapresa dalla cellula possa basarsi su un processo decisionale che considera tutte le informazioni disponibili sullo stato della cellula e del suo ambiente. I segnali intracellulari sono veicolati dalle modificazioni post-traduzionali (MPT) delle proteine. Le MPT sono regolate da enzimi specializzati che, costituendo una parte importante delle VDSI, oltre a consentire la trasmissione del segnale principale, ne mediano l'integrazione con quelli che convergono dal resto della RDSI. I meccanismi di funzionamento delle VDSI sono stati frequentemente studiati in seguito a stimolazione singola. Questo approccio isola le VDSI dalla RDSI per semplificarne il contesto e facilitarne lo studio. Per comprendere i meccanismi che le cellule utilizzano per l'integrazione del segnale, occorre tuttavia studiare ogni VDSI nel contesto della RDSI. Lo scopo di questa tesi era dunque di affrontare l'indagine dei meccanismi di segnalazione della RDSI di Saccharomyces cerevisiae, un semplice modello di cellula eucariotica. In particolare, abbiamo utilizzato un metodo di quantificazione delle MPT tra diversi campioni, in seguito all attivazione di VDSI specifiche, senza l'impiego di agenti derivatizzanti di gruppi funzionali, basato sulla spettrometria di massa. Nei primi due studi abbiamo analizzato la risposta agli inibitori di specifiche chinasi da parte di ceppi mutanti nei quali geni di interesse erano stati deleti. In questi lavori, focalizzati sulle VDSI di TORC2 e Rim15 rispettivamente, i cambiamenti dello stato di fosforilazione dei peptidi quantificati sono stati utilizzati per identificare i substrati, diretti e indiretti, di chinasi e fosfatasi, contribuendo così alla ricostruzione di porzioni definite delle relative VDSI. Nello studio successivo abbiamo investigato i meccanismi di cross-comunicazione tra le VDSI di Snf1 e TORC1. Poiché queste VDSI svolgono ruoli importanti e complementari nella regolazione del metabolismo del lievito, sulla base delle caratteristiche del mezzo di crescita, i ceppi con delezione singola o doppia di Snf1 e Tor1 sono stati coltivati in mezzi di coltura con limitazione di nutrienti, al fine di valutare se e in che modo le due VDSI si influenzano a vicenda. Questo studio ha dimostrato iii
che i segnali prodotti dalle VDSI di Snf1 e TORC1 convergono nella co-regolazione di specifici meccanismi del metabolismo. In seguito abbiamo intrapreso lo studio della dinamica di segnalazione e della crosscomunicazione in seguito ad una doppia stimolazione. In particolare, abbiamo studiato la risposta della RDSI alla co-stimolazione di colture di lievito con NaCl e fattore-α. Abbiamo così raccolto dati quantitativi, sotto forma di tabelle bidimensionali, delle dinamiche di 2536 fosfo-peptidi (F-pep). Tali dati sono stati usati per dedurre come un segnale può influenzare lo stato di fosforilazione di un F- pep di interesse, e se due F-pep interagiscono tra di loro nel tempo. I dati ottenuti da questi studi, affiancati alle conoscenze già disponibili su alcuni specifici componenti, ci hanno permesso di contribuire ad una migliore comprensione della RDSI del lievito di birra. Siccome i meccanismi biochimici di base coinvolti nella segnalazione intracellulare sono conservati tra tutti gli eucarioti, gli stessi metodi di esplorazione possono essere generalizzati e applicati allo studio di altri sistemi cellulari. Ad esempio, la comprensione di come i segnali vengono condivisi, comunicati e integrati nella RDSI può accrescere la comprensione sul ricablaggio che altera il comportamento delle cellule patologiche. iv